一種人表皮生長(zhǎng)因子的制備方法及含有人表皮生長(zhǎng)因子的藥物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)用超濾濃縮方法，將原尿濃縮10倍以上。然后利用等電點(diǎn)法及飽和硫酸銨，沉淀出尿中蛋白的一種制備人表皮生長(zhǎng)因子的方法研究。
【背景技術(shù)】
[0002]表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor，EGF)是最早發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)因子，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化起著重要作用。在人類，表皮生長(zhǎng)因子蛋白有53個(gè)氨基酸殘基，三個(gè)二硫鍵，質(zhì)量6千道耳頓。
[0003]在人體中，表皮生長(zhǎng)因子是由53個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽，多肽中沒(méi)有丙氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸。它有三個(gè)二硫鍵，這些二硫鍵是它具有生物活性所必需的，如加入琉基試劑和尿素，則表皮生長(zhǎng)因子失活，肽鏈上的巰基可在空氣中自然氧化而完全恢復(fù)活性。
[0004]表皮生長(zhǎng)因子是人體內(nèi)分泌的一種重要的生長(zhǎng)因子，極微量即能強(qiáng)烈促進(jìn)皮膚細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)，此外，它還能刺激細(xì)胞外一些大分子(如透明質(zhì)酸和糖蛋自等)的合成和分泌，滋潤(rùn)皮膚，因此它既可作為化妝品的添加劑及用于面部整形手術(shù)，促進(jìn)人皮膚的新陳代謝、減少皮膚畸形；也可在醫(yī)藥上治療皮膚外傷、術(shù)后創(chuàng)口、褥瘡、口腔潰瘍和壞疽、以及放射治療引起的皮炎等。它可以加速傷口和潰瘍面的愈合。
[0005]人表皮生長(zhǎng)因子廣泛存在人體多種組織，具有促進(jìn)角化細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞的生長(zhǎng)作用。對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞有趨化刺激作用，使其迀移向受損部位，還可促進(jìn)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白，在創(chuàng)傷修復(fù)中有一定的作用，但因組織中表皮生長(zhǎng)因子的含量普遍較低，即使所有積累在創(chuàng)面的內(nèi)源性表皮生長(zhǎng)因子均能與受體結(jié)合，其分子環(huán)境中的表皮生長(zhǎng)因子仍達(dá)不到最適水平，難以滿足細(xì)胞增殖和肉芽組織發(fā)育的最大需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目是提供了一種精制表皮生長(zhǎng)因子的方法。
[0007]本發(fā)明采用以下工藝方案予以實(shí)現(xiàn)上述目的:
健康青年男性尿液10L，加0.8%苯酚，12h內(nèi)處理。
[0008](1)超濾濃縮工序:取10L尿液，用50%Na0H調(diào)ρΗ8.2?8.8，靜置1.5h,虹吸上清液，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH6.2-6.8值，靜置0.5h，將上清液進(jìn)行超濾濃縮至2L，之后再用冰醋酸調(diào)節(jié)PH4.2-4.8值，最后放于4°C的環(huán)境中過(guò)夜。
[0009](2)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)沉淀工序:上清液加(順4)#04至飽和，4 °C靜置25~35h，離心后沉淀。
[0010](3)梯度洗脫工藝:陰離子交換柱用洗脫液B平衡，將上述離心液流經(jīng)平衡好的陰離子交換柱，流速控制在120~130ml/min左右；用洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120~130ml/min,得洗脫液；將洗脫液經(jīng)超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液。
[0011](4)沉淀工藝:超濾液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時(shí)，離心，固體再用無(wú)水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。
[0012](5)凍干:將沉淀物裝入盤進(jìn)凍干機(jī)，凍干即得表皮生長(zhǎng)因子。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，而不以任何方式限制。
[0014]實(shí)施例1
健康青年男性尿液10L，加0.8%苯酚，12h內(nèi)處理。
[0015]1)超濾濃縮工序:取10L尿液，用50%Na0H調(diào)ρΗ8.5，靜置1.5h,虹吸上清液，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH6.5值，靜置0.5h，將上清液進(jìn)行超濾濃縮至2L，之后再用冰醋酸調(diào)節(jié)PH4.5值，最后放于4°C的環(huán)境中過(guò)夜。
[0016]2)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)沉淀工序:上清液加(見(jiàn)14)2504至飽和，4°C靜置30h，離心后沉淀。
[0017]3)梯度洗脫法工序(以0.25L柱體為例)
3.1)稱取表皮生長(zhǎng)因子粗品1kg，用8.5L的洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液；
3.2)陰離子交換柱用2.5L的洗脫液B平衡，將上述離心液流經(jīng)平衡好的陰離子交換柱，流速控制在120ml/min左右；
3.3)用33L的洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120ml/min，得洗脫液；
3.4)將洗脫液經(jīng)超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。
[0018]4)沉淀
超濾液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時(shí)，離心，固體再用無(wú)水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。
[0019]5)凍干
將沉淀物裝入盤進(jìn)凍干機(jī)，凍干即得表皮生長(zhǎng)因子。
[0020]實(shí)施例2
健康青年男性尿液10L，加0.8%苯酚，12h內(nèi)處理。
[0021 ] 1)超濾濃縮工序:取10L尿液，用50%Na0H調(diào)ρΗ8.2，靜置1.5h,虹吸上清液，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH6.2值，靜置0.5h，將上清液進(jìn)行超濾濃縮至2L，之后再用冰醋酸調(diào)節(jié)PH4.2值，最后放于4°C的環(huán)境中過(guò)夜。
[0022]2)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)沉淀工序:上清液加(順4)#04至飽和，4 °C靜置25h，離心后沉淀。
[0023]3)梯度洗脫法工序(以0.25L柱體為例)
3.1)稱取表皮生長(zhǎng)因子粗品1kg，用8.5L的洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液；
3.2)陰離子交換柱用3.0L的洗脫液B平衡，將上述離心液流經(jīng)平衡好的陰離子交換柱，流速控制在130ml/min左右； 3.3)用33L的洗脫液B溶液洗脫，流速控制在130ml/min，得洗脫液；
3.4)將洗脫液經(jīng)超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。
[0024]4)沉淀
超濾液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時(shí)，離心，固體再用無(wú)水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。
[0025]5)凍干
將沉淀物裝入盤進(jìn)凍干機(jī)，凍干即得表皮生長(zhǎng)因子。
[0026]實(shí)施例3
取實(shí)施例2中制備的表皮生長(zhǎng)因子200萬(wàn)單位，稱取20g甘露醇，量取200ml甘油，加500ml注射用水溶解，混合后用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)Ph值至6.5，然后加注射用水至1000ml，聚醚砜超濾膜無(wú)菌過(guò)濾，分裝于1000個(gè)已處理好的西林瓶中，凍干、乳蓋即可。
[0027]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種人表皮生長(zhǎng)因子的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)超濾濃縮工序:取10L尿液，用50%Na0H調(diào)pH，靜置1.5h,虹吸上清液，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH值，靜置0.5h，將上清液進(jìn)行超濾濃縮至2L，之后再用冰醋酸調(diào)節(jié)PH值，最后放于4°C的環(huán)境中過(guò)夜； (2)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)沉淀工序:上清液加(見(jiàn)14)2504至飽和，4°C靜置，離心后沉淀； (3)梯度洗脫工藝:用洗脫液A溶解沉淀，攪拌、離心，留取離心液；用洗脫液B平衡陰離子交換柱，將上述離心液上柱；用洗脫液B溶液洗脫柱子；收集洗脫液；洗脫液經(jīng)超濾膜，超濾，得超濾液； (4)沉淀 超濾液中加入乙醇沉淀，離心，固體再用無(wú)水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物； (5)凍干 將沉淀物裝入盤進(jìn)凍干機(jī)，凍干即得表皮生長(zhǎng)因子。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人表面生長(zhǎng)因子的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，用50%Na0H溶液調(diào)溶液的PH值為8?9，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH值為6?7，之后再次用冰醋酸調(diào)節(jié)PH值為4?5。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人表面生長(zhǎng)因子的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，4°C靜置24?36 ho4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)其中洗脫液A可選用0.01-0.3mol/L醋酸鹽緩沖液，在PH值4.0-9.0的條件下洗脫。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)其中洗脫液B可選用0.01-0.5mol/L 醋酸鈉 +0.l~5mol/L NaCl，在 PH 值 3.0-8.0 的條件下洗脫。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)其中洗脫液D可選用0.01-0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，在PH值3.0-8.0的條件下洗脫。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中選用的陰離子交換柱包括:強(qiáng)陰離子交換柱Q-Sephadex A-25, Q-S印hadex A-50, Q-Sephadex C-25, Q-Sephadex C-50;弱陰離子交換柱DEAE-Cellulose DE-22，DEAE-Cellulose DE-23，DEAE-Cellulose DE-51，DEAE-CelluloseDE-52，DEAE-Cellulose DE-53。8.根據(jù)權(quán)利要求1~7所述制備的人表皮生長(zhǎng)因子，其特征在于:凍干后得到的蛋白質(zhì)0.61mg，充分證明了人尿是人表皮生長(zhǎng)因子的一個(gè)可用來(lái)源。9.一種藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1-8制備的人表皮生長(zhǎng)因子作為活性成分，還含有甘油、甘露醇。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種制備人表皮生長(zhǎng)因子的工藝的方法研究。具體的說(shuō)，就是以健康成年男性新鮮尿液為原料，經(jīng)過(guò)超濾、等電點(diǎn)沉淀以及梯度洗脫法等現(xiàn)代蛋白質(zhì)高端生化分離技術(shù)來(lái)制備人表皮生長(zhǎng)因子，可以從10L尿液中，得到初步電泳純的人表皮生長(zhǎng)因子0.61mg。
【IPC分類】C07K1/18, C07K1/30, A61K9/19, C07K1/36, A61P17/02, C07K1/34, C07K14/485, A61K38/18
【公開(kāi)號(hào)】CN105399812
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510806840
【發(fā)明人】劉乃山, 林曉磊, 劉翠珍
【申請(qǐng)人】青島康原藥業(yè)有限公司
【公開(kāi)日】2016年3月16日
【申請(qǐng)日】2015年11月21日