一株轉(zhuǎn)化乳糖廢水合成乳糖酸的密孔菌及轉(zhuǎn)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及乳糖酸的制備方法，具體涉及一株密孔菌轉(zhuǎn)化乳糖廢水制備乳糖酸的 方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳糖酸（lactobionic acid)是第三代果酸，其集延緩衰老、保濕、抗氧化和促進(jìn)機(jī) 體更新等多種功效于一身。是目前最好的果酸代用品。由于其本身存在于有機(jī)體中，乳糖酸 不存在刺激性問題，具有優(yōu)異的抗氧化能力，可防止細(xì)胞和離體器官受到自由基的傷害；乳 糖酸還可避免細(xì)胞膜因氧化而受到的破壞，具有極佳的保水性，是化妝品中的重要組分。乳 糖酸是器官移植緩沖液中的重要組分，和金屬螯合后的產(chǎn)物可降低由于離子催化產(chǎn)生的羥 基對(duì)組織的損傷。乳糖酸還可增加大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的溶解度，如紅霉素的乳糖酸水溶液 的溶解度比紅霉素高出50-100倍；乳糖酸的鈣鹽的溶解度較高，可用來補(bǔ)充鈣的吸收，也 可用來做葡萄糖酸鈣的過飽和溶液。乳糖酸有較強(qiáng)的甜味，可以降低酸味，可作為食品的添 加劑使用。乳糖酸因其和水的高親和性還可作為洗滌劑的組分。在化妝品中加入乳糖酸， 可抗氧化，抗衰老，高保濕等功效。乳糖酸的CAS登錄號(hào)：96-82-2。
[0003] 目前乳糖酸的制備方法有化學(xué)催化合成法以及微生物轉(zhuǎn)化法。微生物轉(zhuǎn)化法又包 括細(xì)菌轉(zhuǎn)化法，真菌轉(zhuǎn)化法?；瘜W(xué)催化合成法有許多不利的因素，例如產(chǎn)生多種副產(chǎn)物和化 學(xué)污染物，而形成的眾多副產(chǎn)物又使分離，純化步驟變得復(fù)雜化。微生物轉(zhuǎn)化法具有很大的 優(yōu)勢(shì)，高效，低成本，轉(zhuǎn)化率高，副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)，但是有些已報(bào)道的產(chǎn)乳糖酸的細(xì)菌不是安 全菌株，難于用于食品等行業(yè)的生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供利用真菌將乳糖轉(zhuǎn)化為乳糖酸的方法。具體內(nèi)容涉及利用密 孔菌轉(zhuǎn)化乳糖廢水制備乳糖酸的方法。本發(fā)明采用的微生物菌種能夠?qū)⑷樘寝D(zhuǎn)化為乳糖 酸，轉(zhuǎn)化率高、副產(chǎn)物少，通過發(fā)酵取得了顯著效果。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案；一株密孔菌轉(zhuǎn)化乳糖廢水制備乳糖酸的菌株，其分類命名為 密孔菌（Pycnoporus sp.)，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)， 保藏編號(hào) CCTCC NO : M 2015020。
[0006] -種用所述菌株轉(zhuǎn)化乳糖廢水制備乳糖酸的方法，以CCTCC NO : M 2015020為出 發(fā)菌株，以乳糖廢水中的乳糖為轉(zhuǎn)化底物，采用碳源、氮源及無機(jī)鹽組成發(fā)酵培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化 制備乳糖酸，其工藝為：
[0007] (1)菌株：采用CCTCC NO : M 2015020為出發(fā)菌株；
[0008] (2)菌株保藏：所用菌種保藏培養(yǎng)基上保存，3-6個(gè)月轉(zhuǎn)接一次；保藏培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基；
[0009] (3)種子培養(yǎng)：從保藏培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基活化1次，30°C下，200rmp搖瓶培養(yǎng) 2d ；
[0010] 種子培養(yǎng)基的組分以g/L計(jì)為：葡萄糖20,新鮮土豆200,以蒸餾水配制，pH自然；
[0011] ⑷微生物轉(zhuǎn)化：將CCTCC NO: M 2015020菌株添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，利用微生物 產(chǎn)的脫氫酶、漆酶將乳糖廢水中的乳糖轉(zhuǎn)化為乳糖酸；
[0012] 發(fā)酵培養(yǎng)基組分以g/L計(jì)為：碳源20-50,有機(jī)氮源6-10,無機(jī)氮源4-10,磷酸 二氫鉀1，硫酸鎂0. 3,氯化鈣0. 08,七水硫酸鋅0. 005,四水硫酸錳0. 0015,六水氯化鈷 0. 0015
[0013] 七水硫酸鐵0.005。
[0014] 所述碳源為乳糖廢水中乳糖，以10% v/v添加，所述氮源為：黃豆粉和磷酸氫二 銨；
[0015] (5)在發(fā)酵過程中需要加入弱酸調(diào)節(jié)pH，優(yōu)選的是琥珀酸緩沖液。通過添加酸類 物質(zhì)琥珀酸，使得發(fā)酵過程中PH4. 5-4. 8保持恒定，以此提高乳糖的轉(zhuǎn)化率。
[0016] 所述真菌轉(zhuǎn)化乳糖廢水制備乳糖酸的方法，轉(zhuǎn)化底物乳糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度 優(yōu)選為3% -5%，在30°C，200rmp的條件下培養(yǎng)7d。
[0017] 乳糖酸應(yīng)理解為乳糖酸及其鹽類，如乳糖酸鈣。
[0018] 檢測(cè)乳糖酸的方法如下：
[0019] 取發(fā)酵液離心，上清液經(jīng)微孔濾膜過濾（0. 22 μ m)，濾液經(jīng)HPLC分析。HPLC條件： 高效液相色譜儀日立chromaster;色譜柱：BI〇-RAD Aminex ΗΡΧ_87Η(7· 8X300);流動(dòng)相 為0. 005Μ H2SO4;檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，210nm，柱溫：50°C，流速：0. 4mL/min，進(jìn)樣量：10yL， 乳糖酸標(biāo)樣濃度：1%。
[0020] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了一種利用真菌轉(zhuǎn)化制備乳糖酸的方法，表明密 孔菌（Pycnoporus sp.)SYBC LlO在加入的乳糖廢水為20%v/v(乳糖廢水中乳糖濃度為 25 % )時(shí)培養(yǎng)7d轉(zhuǎn)化率能達(dá)到60 %，加入的乳糖廢水為40 % v/v時(shí)培養(yǎng)9d，轉(zhuǎn)化率達(dá)到 45%〇
[0021] 生物材料樣品保藏：密孔菌（Pycnoporus sp.) SYBC LlO已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng) 物保藏中心，地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)，簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏日期：2015年1月7號(hào)，保藏編號(hào) CCTCC NO : M 2015020。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 通過實(shí)驗(yàn)，得到了影響發(fā)酵轉(zhuǎn)化乳糖酸產(chǎn)率的主要因素：
[0023] 實(shí)施例1.培養(yǎng)基配制過程中加入乳糖對(duì)乳糖產(chǎn)量的影響
[0024] 按說明書所述的發(fā)酵條件，培養(yǎng)基中加入乳糖廢水，發(fā)酵液中的乳糖的終濃度 為5%。通過對(duì)對(duì)乳糖產(chǎn)乳糖酸的檢測(cè)，發(fā)酵7d(纖維二糖脫氫酶在第七天達(dá)到穩(wěn)定期） 發(fā)現(xiàn)乳糖酸的產(chǎn)量?jī)H為I. 3g/L。又通過乳糖添加時(shí)間對(duì)乳糖酸產(chǎn)量的影響發(fā)現(xiàn)，乳糖對(duì) pycnoporus sp. SYBC LlO發(fā)酵產(chǎn)乳糖酸有抑制作用。故應(yīng)在發(fā)酵一定的時(shí)間添加乳糖廢 水。
[0025] 實(shí)施例2.乳糖添加時(shí)間對(duì)乳糖酸產(chǎn)量的影響
[0026] 按說明書所述的發(fā)酵條件，通過對(duì)pycnoporus sp. SYBC LlO在不同發(fā)酵時(shí)間產(chǎn)乳 糖酸的檢測(cè)，因乳糖對(duì)密孔菌產(chǎn)纖維二糖脫氫酶有一定的抑制作用，經(jīng)檢測(cè)CDH的酶活，發(fā) 現(xiàn)菌體在第4d開始產(chǎn)酶，第7天達(dá)到穩(wěn)定期，所以從第三天開始加入乳糖廢水（乳糖含量 為25% )，使發(fā)酵液中的乳糖的終濃度為5%，發(fā)酵到第10天停止。
[0027] 表1、乳糖添加時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化乳糖酸的影響
[0029] 實(shí)施例3底物濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響
[0030] 起始pH4. 5,溫度30°C，200rmp，發(fā)酵5天后加入乳糖廢水，發(fā)酵液中的乳糖含量 為5%，pycnoporus sp. SYBC LlO培養(yǎng)到第10天停止發(fā)酵，乳糖轉(zhuǎn)化為乳糖酸的轉(zhuǎn)化率為 71. 6%〇
[0031] 起始pH4. 5,溫度30°C，200rmp，發(fā)酵5天后加入乳糖廢水，發(fā)酵液中的乳糖含量 為10%，pycnoporus sp. SYBC LlO培養(yǎng)到第10天停止發(fā)酵，乳糖轉(zhuǎn)化為乳糖酸的轉(zhuǎn)化率為 58%〇
[0032] 起始pH4. 5,溫度30°C，200rmp，發(fā)酵5天后加入乳糖廢水，發(fā)酵液中的乳糖含量 為15%，pycnoporus sp. SYBC LlO培養(yǎng)到第10天停止發(fā)酵，乳糖轉(zhuǎn)化為乳糖酸的轉(zhuǎn)化率為 42%〇
[0033] 起始pH4. 5,溫度30°C，200rmp，發(fā)酵5天后加入乳糖廢水，發(fā)酵液中的乳糖含量 為20%，pyCn 〇p〇rus sp. SYBC LlO培養(yǎng)到第10天停止發(fā)酵，乳糖轉(zhuǎn)化為乳糖酸的轉(zhuǎn)化率為 30%〇
[0034] 表2底物濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株轉(zhuǎn)化乳糖廢水合成乳糖酸的密孔菌及轉(zhuǎn)化方法，其特征在于利用分類命名為密 孔菌（Pycnoporussp. )SYBC-L10,保藏編號(hào)CCTCCNO:Μ2015020的密孔菌轉(zhuǎn)化乳糖廢水 制備乳糖酸，工藝為： (1) 菌種：采用CCTCCNO:Μ2015020為出發(fā)菌株； (2) 菌種保藏：所用菌株在保藏培養(yǎng)基上保藏，3-6個(gè)月轉(zhuǎn)接一次； 保藏培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基； (3) 種子培養(yǎng)：從保藏培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基需活化1次，每次30°C下培養(yǎng)4d; (4) 微生物轉(zhuǎn)化：將CCTCCNO:Μ2015020菌株添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，利用微生物產(chǎn)的 纖維二糖脫氫酶和漆酶將乳糖轉(zhuǎn)化為乳糖酸； 發(fā)酵培養(yǎng)基的組分以g/L計(jì)為：碳源20-50,有機(jī)氮源6-10,無機(jī)氮源4-10,磷酸二氫 鉀1，硫酸鎂〇. 3,氯化鈣0. 08,七水硫酸鋅0. 005,四水硫酸錳0. 0015,六水氯化鈷0. 0015 七水硫酸鐵〇. 005 ; 所述的碳源為乳糖廢水中乳糖，所述的氮源為有機(jī)氮源黃豆粉，無機(jī)氮源為磷酸氫二 銨； 轉(zhuǎn)化底物乳糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為3% -5%W/V，種子液以10%的接種量，接入 添加不同氮源以及無機(jī)鹽組成的發(fā)酵培養(yǎng)基中，250mL三角瓶裝液量為50mL;在28-30°C， 200-220rmp的條件下培養(yǎng)7d，得到含乳糖酸的發(fā)酵液； (5) 在發(fā)酵過程中通過添加琥珀酸緩沖液，使得發(fā)酵過程中pH4. 5-5. 0保持恒定，以此 提高乳糖廢水的轉(zhuǎn)化率。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一株轉(zhuǎn)化乳糖廢水合成乳糖酸的密孔菌及轉(zhuǎn)化方法，其特征 在于轉(zhuǎn)化底物乳糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為3% -5%W/V，在28-30°C，200-220rpm的條件 下培養(yǎng)7d。
【專利摘要】本發(fā)明提供一株用于轉(zhuǎn)化乳糖廢水制備乳糖酸的密孔菌，其分類命名為密孔菌(Pycnoporus？sp.)SYBC-L10，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC？NO：M2015020。用密孔菌(Pycnoporus？sanguineus)SYBC-L10微生物作為菌種，以乳糖廢水為轉(zhuǎn)化底物，添加氮源、無機(jī)鹽及誘導(dǎo)劑組成發(fā)酵培養(yǎng)基，微生物轉(zhuǎn)化制備乳糖酸。在發(fā)酵過程中通過添加琥珀酸緩沖液，使得發(fā)酵過程中pH保持恒定，提高乳糖廢水的轉(zhuǎn)化率，優(yōu)化條件下轉(zhuǎn)化率達(dá)到85％以上。對(duì)于乳糖酸的研究，我國(guó)在此方面的研究尚屬空白。本發(fā)明轉(zhuǎn)化的乳糖廢水中，根據(jù)高效液相色譜法檢測(cè)其中的乳糖含量為25％左右。CCTCC NO: M201502020150107
【IPC分類】C12N1/14, C12R1/645, C12P7/58
【公開號(hào)】CN105400699
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510125457
【發(fā)明人】廖祥儒, 馮圓圓, 李韻雅, 張永, 蔡宇杰, 管政兵, 樊濤
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開日】2016年3月16日
【申請(qǐng)日】2015年3月23日