改造核糖體結(jié)合位點(diǎn)提高基因工程菌株生產(chǎn)重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因技術(shù)和微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因工程菌株生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物領(lǐng)域中的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)改造技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)是一類酸性糖蛋白，屬轉(zhuǎn)化生長因子超家族成員，這種蛋白質(zhì)具有使未分化間充質(zhì)定向分化為成骨細(xì)胞，并進(jìn)而合成膠原、形成鈣化骨組織能力。天然BMP能夠誘導(dǎo)促進(jìn)骨和軟骨的形成，并可以與多種載體形成骨修復(fù)材料，廣泛的應(yīng)用于治療新鮮骨折、骨缺損、骨不連、脊椎融合、股骨頭壞死等骨科臨床治療。在已知的近20種BMP中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)的誘導(dǎo)成骨活性最強(qiáng)，被研究和應(yīng)用的最為廣泛。但是天然BMP-2含量稀少、提取成本高昂，臨床應(yīng)用嚴(yán)重受限。
[0003]近年來的研究表明重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(rhBMP_2)具有較高的安全性和有效性，它由114個氨基酸殘基組成，具有顯著的成骨誘導(dǎo)能力，體外試驗(yàn)無細(xì)胞毒性，生物相容性良好，美國FDA于2002年7月批準(zhǔn)rhBMP-2上市用于治療脊椎融合。現(xiàn)在rhBMP-2已被應(yīng)用于外科整形手術(shù)誘導(dǎo)骨再生，在骨組織工程及骨修復(fù)領(lǐng)域展現(xiàn)了巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值，成為臨床骨科創(chuàng)傷疾病防治研究的熱點(diǎn)。
[0004]本發(fā)明提供了改造核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)提高基因工程菌株生產(chǎn)rhBMP-2的產(chǎn)量的方法，以及1株RBS改造后的的基因工程菌株大腸桿菌SHJBMP02，該菌株生產(chǎn)rhBMP-2的產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了 48%左右，達(dá)到136.3mg/L，遺傳性狀穩(wěn)定，培養(yǎng)和發(fā)酵條件適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的
[0006]提供了改造RBS提高基因工程菌株生產(chǎn)rhBMP-2的產(chǎn)量的方法，以及1株RBS改造后的基因工程菌株大腸桿菌SHJBMP02，該菌株生產(chǎn)rhBMP-2的產(chǎn)量比RBS改造前的出發(fā)菌株sHJBMPOl提高了 48%左右，遺傳性狀穩(wěn)定，培養(yǎng)和發(fā)酵條件適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007]技術(shù)方案
[0008]大腸桿菌密碼子優(yōu)化后的rhBMP-2基因，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1。
[0009]新的RBS，其核苷酸序列為SEQ ID N0.2。
[0010]同時含有核苷酸序列為SEQ ID N0.1的DNA和含有核苷酸序列為SEQ ID N0.2的DNA 的菌株 SHJBMP02。
[0011 ] 改造RBS構(gòu)建基因工程菌株大腸桿菌SHJBMP02的方法，將具有SEQ ID N0.1序列的DNA克隆到質(zhì)粒pET28a中得到質(zhì)粒pHJBMPOl ;將pHJBMPOl中的RBS改變?yōu)榫哂蠸EQ IDN0.2序列的DNA得到質(zhì)粒pHJBMP02 ;將pHJBMPOl和pHJBMP02分別導(dǎo)入大腸桿菌BL21得到2株基因工程菌株sHJBMPOl和sHJBMP02，2個菌株均可以生產(chǎn)rhBMP-2。
[0012]本發(fā)明的有益效果:提供了 1株RBS改造后的基因工程菌株SHJBMP02，該菌株生產(chǎn)rhBMP-2的產(chǎn)量穩(wěn)定在136.3mg/L左右，比RBS改造前的出發(fā)菌株sHJBMPOl提高了 48%左右，該菌株生長速度快，遺傳性狀穩(wěn)定，適合于在工業(yè)化生產(chǎn)rhBMP-2。
【附圖說明】
[0013]圖1是質(zhì)粒pHJBMPOl的構(gòu)建示意圖(A)和質(zhì)粒pHJBMP02的構(gòu)建示意圖⑶。
[0014]圖2是通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 (rhBMP-2)的生產(chǎn)與分離純化各個過程。(A) sHJBMPOl生產(chǎn)rhBMP-2以及分離純化；(B) SHJBMP02生產(chǎn)rhBMP-2以及分離純化。泳道Μ:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:全菌蛋白；2:Buffer A溶解的蛋白；3:Buffer B溶解的蛋白;4-Solut1n I溶解的蛋白；5:Solut1n I溶解的蛋白經(jīng)過鎳離子親和層析柱的流出液；6:用Solut1n II洗滌鎳離子親和層析柱的流出液；7:用Solut1n III洗脫鎳離子親和層析柱的流出液組分一 ；8:用Solut1n III洗脫鎳離子親和層析柱的流出液組分二 ；9:用Solut1n III洗脫鎳離子親和層析柱的流出液組分三。
【具體實(shí)施方式】
[0015]本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例中所使用的液體LB培養(yǎng)基成分:蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%,ρΗ 7.0，所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例中所使用的固體LB培養(yǎng)基成分，在液體LB培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂(質(zhì)量百分含量)。
[0016]實(shí)施例1 rhBMP-2基因的獲得
[0017]rhBMP-2基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1，由上海生工生物工程公司合成。
[0018]實(shí)施例2 sHJBMPOl的獲得
[0019]SEQ ID N0.1的DNA序列通過DNA人工合成得到，合成后的5’端帶有Ndel粘性末端，3’端帶有Xhol粘性末端，把SEQ ID N0.1的DNA克隆到質(zhì)粒pET28a (購自Novagen公司)的Ndel/Xhol位點(diǎn)之中得到質(zhì)粒pHJBMPOl (圖1A);把質(zhì)粒pHJBMPOl轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (購自上海浩然生物技術(shù)有限公司)中得到菌株sHJBMPOl，。
[0020]實(shí)施例3 SHJBMP02的獲得
[0021]通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)得到pHJBMP02，其反應(yīng)液成分為:pHJBMP01，50ng ;寡
S (DNA 歹!J ataattttgtttaactttaaacaggaaacataccatgggcagcagccat，JaL SEQNO:3),0.3 μM ;寡核苷酸片段(DNA 序列 atggctgctgcccatggtatgtttcctgtttaaagttaaacaaaattat,見 SEQ NO:4)，0.3 μ M ；dNTP (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)，各 0.2mM ;MgS04，1.5mM ；KOD-Plus-Neo (Τ0Υ0Β0 公司)，1U;10XPCR Buffer for KOD-Plus-Neo (Τ0Υ0Β0 公司)，5μ1 ;加水將總體積補(bǔ)至 50 μ 1。其 PCR 反應(yīng)條件為:94°C，2min ;98°C，10sec，68°C，4min，重復(fù) 30 個循環(huán)；68°C，lOmin。以上反應(yīng)液加入 Dpnl (New England B1labs 公司)lOunits，37°C，lhouro取5 μ 1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑選單克隆菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)過DNA測序正確的質(zhì)粒命名為pHJBMP02，含有pHJBMP02的BL21命名為菌株sHJBMP02。
[0022]實(shí)施例4 sHJBMPOl 和 sHJBMP02 生產(chǎn) rhBMP-2
[0023]分別將sHJBMPOl和sHJBMP02接種到含有50 μ g/L卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)箱中過夜；分別挑選單克隆接種到5mL含有50 μ g/L卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm，培養(yǎng)16小時；再分別接種至lOOmL含有50 μ g/L卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，接種量1 %，37°C，200rpm，培養(yǎng)至0D6。。為0.6左右，分別加入IPTG至終濃度為0.4mM，37°C，200rpm 培養(yǎng) 5 小時。
[0024]實(shí)施例5 rhBMP-2的分離純化
[0025]分別將sHJBMPOl和sHJBMP02的發(fā)酵液lOOmL離心取菌體；菌體加入10mLBuffer A(50mMTris_HCl，ρΗ8.0)，超聲破菌，離心取沉淀；沉淀加入10mL Buffer B(含有2M尿素的Buffer A)洗滌，離心取沉淀；沉淀加入10mL Solut1n I(8M尿素，100mMNaH2P04，lOmMTris-HCl, pH8.0)洗滌，離心取上清；取0.5mL上清加入0.2mL鎳離子親和樹脂(N1-NTA，購自Novagen公司)，混勾，離心棄去上清；鎳離子親和樹脂用lmL Solut1n
II(8M 尿素，100mM NaH2P04，10mMTris-HCl, ρΗ6.3)洗滌 2 次；鎳離子親和樹脂用 lmLSolut1n III (8M 尿素，100mM NaH2P04，10mMTris-HCl，pH4.2)洗脫 4 次，分別收集上清。
[0026]以上各個步驟的組分通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析其純度和回收率，純化后的rhBMP-2通過Bradford蛋白定量試劑確定蛋白濃度。所得蛋白質(zhì)經(jīng)檢測是正確的氨基酸序列，與標(biāo)準(zhǔn)品rhBMP-2序列一致。
[0027]實(shí)施例4 sHJBMPOl和sHJBMP02生產(chǎn)rhBMP-2的穩(wěn)定性
[0028]含有20 %甘油的sHJBMPOl和sHJBMP02菌液，在-80°C保存6個月；分別接種到含有50 μ g/L卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)箱中過夜；分別挑選單克隆接種到5mL含有50 μ g/L卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm，培養(yǎng)16小時；再分別接種至100mL含有50 μ g/L卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，接種量1 %，37°C，200rpm，培養(yǎng)至0D6。。為
0.6左右，分別加入IPTG至終濃度為0.4mM，37°C，200rpm培養(yǎng)5小時。sHJBMPOl和sHJBMP02生產(chǎn)rhBMP-2的發(fā)酵單位分別穩(wěn)定在92.2mg/L和136.3mg/L左右。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS，其核苷酸序列為SEQID N0.2。2.一種含有權(quán)利要求1所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)的質(zhì)粒PHJBMP02。3.一種構(gòu)建權(quán)利要求2所述的工程菌株的方法，其特征在于按如下步驟實(shí)現(xiàn):將具有SEQ ID N0.1序列的DNA克隆到質(zhì)粒pET28a中得到質(zhì)粒pHJBMPOl ;將pHJBMPOl中的RBS改變?yōu)闄?quán)利要求1所述RBS，得到質(zhì)粒pHJBMP02 ;將pHJBMPOl和pHJBMP02分別導(dǎo)入大腸桿菌BL21得到2株基因工程菌株sHJBMPOl和sHJBMP02。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的工程菌株的方法，其特征在于所述的質(zhì)粒pHJBMP02由如下方法獲得:pHJBMP01 作為模板，以引物ataattttgtttaactttaaa cag gaaacatac cat ggg cagcagcca t 和 atggctgctgcc cat ggtatgtttcctgtttaaagttaaacaaaatta t，通過 PCR 反應(yīng)得到 pHJBMP02o5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的工程菌株的方法，其特征在于所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)反應(yīng)液成分為:pHJBMP01，50 ng ;權(quán)利要求4所述的2條引物，各0.3 yM;dNTP，各0.2 mM ；MgS04，1.5 mM ;KOD-Plus-Neo，1 U ；10 X PCR Buffer for KOD-Plus-Neo，5 μ 1 ;加水將總體積補(bǔ)至 50 μ 1 ;PCR 反應(yīng)條件為:94 °C，2 min ；98°C,10 sec，68 °C，4 min，重復(fù) 30 個循環(huán);68 °C，10 min。
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因技術(shù)和微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因工程菌株生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物領(lǐng)域中的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）改造技術(shù)。將大腸桿菌密碼子優(yōu)化后的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（rhBMP-2）基因（具有SEQ？ID？NO.？1核苷酸序列的DNA）克隆到質(zhì)粒pET28a中得到質(zhì)粒pHJBMP01；將pHJBMP01中RBS改變?yōu)樾碌腞BS（具有SEQ？ID？NO.？2核苷酸序列的DNA）得到質(zhì)粒pHJBMP02；將pHJBMP01和pHJBMP01分別導(dǎo)入大腸桿菌BL21得到sHJBMP01和sHJBMP02本發(fā)明提供的RBS改造后的sHJBMP02生產(chǎn)rhBMP-2的發(fā)酵單位提高到136.3mg/L。
【IPC分類】C12N15/70, C12N15/12, C12N15/31, C12N1/21, C12R1/19
【公開號】CN105400795
【申請?zhí)枴緾N201510964178
【發(fā)明人】江輝
【申請人】南京江輝生物科技有限公司
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2015年12月21日