一種水稻胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子pOsPYL8的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]
本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)和植物基因工程領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明提供了一種水稻胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子P0SPYL8。
【背景技術(shù)】
[0002]
水稻是我國乃至世界上最主要的糧食作物之一。胚乳是稻米的食用部分，其主要成分為淀粉，也包含微量脂肪、蛋白質(zhì)、纖維素等，為人類提供營養(yǎng)和能量物質(zhì)。植物生物技術(shù)和基因工程的發(fā)展，使得人們能夠定向調(diào)控胚乳中淀粉、脂肪或蛋白質(zhì)等相關(guān)合成、代謝基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)稻米品質(zhì)及營養(yǎng)價(jià)值的改良。
[0003]在水稻胚乳定向遺傳改良中，利用胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)相關(guān)基因的超表達(dá)或抑制是一種理想的策略。這一策略在高效調(diào)控胚乳組織中相關(guān)基因表達(dá)的同時(shí)，由于胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)在其它組織部位不表達(dá)，因此，一般不影響其它組織部位的生長發(fā)育。目前，國內(nèi)外研究工作者已分離了一些水稻胚乳特異性啟動(dòng)子，但這類啟動(dòng)子的數(shù)量依然有限，特別是胚乳特異性高效表達(dá)啟動(dòng)子更是甚少，難以完全滿足植物基因工程多方面應(yīng)用的需求。隨著水稻基因組測序完成、各種基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的公開，借助公共數(shù)據(jù)庫可以篩選到在水稻胚乳組織中特異性高效表達(dá)的功能基因。這些胚乳特異表達(dá)功能基因的上游DNA序列，為分離鑒定胚乳特異表達(dá)的啟動(dòng)子提供了基礎(chǔ)。
[0004]水稻胚乳特異強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子的分離對(duì)利用基因工程改良水稻稻米品質(zhì)以及利用水稻胚乳作為生物反應(yīng)器表達(dá)相關(guān)重要蛋白產(chǎn)物具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]
本發(fā)明的目的是提供一種水稻胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子及其應(yīng)用。該啟動(dòng)子來源于水稻基因的上游啟動(dòng)子區(qū)，具有驅(qū)動(dòng)目的基因在水稻胚乳中特異表達(dá)的功能。
[0006]本發(fā)明所提供的水稻胚乳特異性啟動(dòng)子，為下述DNA序列之一:
(1)具有SEQID N0.1所示的DNA序列；
(2)在SEQID N0.1所示序列的基礎(chǔ)上對(duì)序列中間片段或堿基進(jìn)行插入、缺失或替換改變所產(chǎn)生的，并且具有胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子活性的DNA序列；
(3)在SEQID N0.1所示序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行Y -或者:V _缺失所產(chǎn)生的，并且具有胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子活性的DNA序列。
本發(fā)明通過對(duì)水稻根、莖、葉、小穗、種子等不同組織部位進(jìn)行表達(dá)譜分析，明確了水稻脫落酸(abscisic acid, ΑΒΑ)受體蛋白基因在種子中特異性高效表達(dá)；本發(fā)明進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因水稻植株報(bào)告基因表達(dá)分析，明確了啟動(dòng)子可控制目的基因在水稻胚乳組織中特異表達(dá)，其在水稻根、莖、葉、小穗、胚等組織部位不表達(dá)。本發(fā)明提供的pOsPYL嗚動(dòng)子可應(yīng)用于基因工程改良稻米胚乳相關(guān)性狀以及在水稻胚乳中特異性表達(dá)重組蛋白。
【附圖說明】
[0007]圖1，基因在根、莖、葉、小穗、種子等水稻不同組織部位中的表達(dá)模式，采用定量Real-time PCR分析，以水稻Mi識(shí)/iii/?基因?yàn)閮?nèi)參。
[0008]圖2，植物表達(dá)載體pC-p0sPYL8-GUS示意圖，其中，A為T-DNA線性結(jié)構(gòu)示意圖；B為 pC-p0sPYL8-GUS 載體圖。
[0009]圖3，轉(zhuǎn)pC-p0sPYL8_GUS結(jié)構(gòu)的水稻轉(zhuǎn)基因植株不同組織部位的⑶S組織化學(xué)檢測結(jié)果，其中，WT為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辏籶35S-gus為轉(zhuǎn)化了組成型啟動(dòng)子P35S的報(bào)告基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植株；pPYL8-gus為轉(zhuǎn)化了 p0sPYL8驅(qū)動(dòng)的⑶S報(bào)告基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植株。
【具體實(shí)施方式】
[0010]
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明但不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0011]實(shí)施例1水稻表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫檢索基因表達(dá)模式
植物/??基因家族是一類脫落酸(abscisic acid，ABA)受體蛋白基因，它編碼的蛋白與ΑΒΑ結(jié)合并介導(dǎo)ΑΒΑ信號(hào)途徑。不同植物PYLs基因可在植物不同組織部位中組成性表達(dá)或特異性表達(dá)。在水稻中，基因家族存在12個(gè)同源基因。通過分析水稻表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(http://ricexpr0.dna.affrc.g0.jp/)發(fā)現(xiàn)，OsPYLS (genbank 序列號(hào):0s06g0527800)只在水稻胚乳中高效表達(dá)，而在其它組織器官中基本不表達(dá)。
[0012]實(shí)施例2熒光定量PCR (Real-time PCR)分析水稻不同組織部位中的表達(dá)模式
利用Trizol (Invitrogen公司)分別提取水稻品種日本晴的根、莖、葉、小穗、種子等不同組織部位的總RNA，實(shí)驗(yàn)步驟參照Invitrogen公司的Trizol使用說明書；Trizol法獲得總RNA后，利用DNasel (TAKARA公司)在37 °(:條件下消化所提取的總RNA，以充分降解樣品中可能存在的基因組DNA ;隨后，進(jìn)一步以氣仿/異戊醇(24:1)抽提純化總RNA。
[0013]取不同組織部位提取的總RNA (?1 yg)，用Thermo#K1622試劑盒(Thermo公司)反轉(zhuǎn)錄成單鏈的cDNA (具體步驟參照Thermo#K1622試劑盒說明書)；以所獲得的cDNA為模板，對(duì)基因在水稻不同組織部位中的表達(dá)模式進(jìn)行熒光定量PCR分析。其中，OsPYLS^ 因的特異引物為 q0sPYL8 +:5 ' -CGGGAGGAAGAGATGGAGTA-3 '，q0sPYL84?: 5' -GGCTGATCAAACCTCCTCAC-3';內(nèi)參基因 Mi識(shí)的引物序列為 qUb1-F:5' -cagcagcggctcatctt-3'，qUb1-R:5' -gcttcttgggcttggtgta-3'。分析平臺(tái)是ABI 公司的 PRISMTM 7500 Sequence Detector。采用 TAKARA 公司的 SYBR Premix Ex TaqTMCTliRNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa Code:DDR820)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及檢測，反應(yīng)體系為20 μ L:SYBR Premix Ex TaqTM (2X ) 10 yL，引物 F和 R (10 μ M)各 0.4 μ L，R0X ReferenceDye II (50X)0.4 μ L, cDNA 1 μ L，ddH20補(bǔ)足體積至20 yL。每個(gè)樣本進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)。實(shí)施例結(jié)果表明，基因水稻種子中高效表達(dá)，而在根、莖、葉、小穗等其它組織中幾乎檢測不到表達(dá)(附圖1)。
[0014]實(shí)施例3水稻啟動(dòng)子的克隆
基于genbank公共數(shù)據(jù)庫中基因的上游啟動(dòng)區(qū)序列，設(shè)計(jì)并合成了特異性引物 p0sPYL8-F: 5 ' -GTTTCATGTTAGGTTTGTCCGC-3 ' ， p0sPYL8_R:5丨-CTCCGGTACACAGTAGCAGCAG-3丨，以水稻品種日本晴的基因組DNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為 50yL:TaKaRa LA Taq 酶(5 U/yL)0.5 yL，2XLA PCR Buffer II 5yL (含 MgCl2)，dNTP (2.5 mM) 8 yL，引物 F/R (10 μΜ)各 1 yL, DNA 2 yL，ddH20 補(bǔ)齊至 50 μ L，擴(kuò)增程序?yàn)?94 °C，5min; 94°C 30min，60°C 30S，72°C 2.5min，共 30 個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10 min。PCR擴(kuò)增獲得了一條2055 bp的條帶。進(jìn)一步以DNA回收試劑盒(DP209，天根公司)從瓊脂糖凝膠中回收擴(kuò)增條帶，并進(jìn)行測序，獲得了序列為SEQ IDN0.1所示的DNA片段，其為因翻譯起始位點(diǎn)(ATG)的上游2055 bp區(qū)段。
[0015]實(shí)施例4植物表達(dá)載體pC-p0sPYL8_GUS的構(gòu)建
為了驗(yàn)證/^/??前啟動(dòng)子活性，進(jìn)一步構(gòu)建了 p0sPYL8關(guān)6K5報(bào)告基因的植物表達(dá)載體。所用基礎(chǔ)載體pCXGUS-P (genbank序列號(hào):FJ905224)包含一個(gè)6K5報(bào)告基因。6K5報(bào)告基因的上游，具有兩個(gè)ZcM位點(diǎn)，經(jīng)ZcM酶切后，可產(chǎn)生兩個(gè)3' -T末端，能克隆兩端帶有A末端的PCR片段。
[0016]以pCXGUS-PAfcM為載體骨架，與實(shí)施例3獲得的啟動(dòng)子片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)，進(jìn)一步酶切鑒定、測序驗(yàn)證獲得了融合的植物表達(dá)載體，命名為pC-p0sPYL8-GUS。所構(gòu)建載體如附圖2所示。
[0017]實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因水稻植株培育及⑶S表達(dá)檢測
采用電激法將pC-p0sPYL8-GUS轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404，進(jìn)一步以攜帶pC-p0sPYL8_GUS的農(nóng)桿菌侵染水稻品種日本晴的愈傷組織，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，并最終篩選、獲得轉(zhuǎn)基因水稻T。植株。
[0018]將轉(zhuǎn)pC-p0sPYL8-GUS的水稻材料種植于溫室內(nèi)(氣溫30°C，光照12小時(shí)以上)，同時(shí)種植陰性植株(非轉(zhuǎn)基因野生型日本晴)和陽性植株(轉(zhuǎn)化了一個(gè)組成型啟動(dòng)子/^仍驅(qū)動(dòng)6K5報(bào)告基因表達(dá)結(jié)構(gòu)p35S-gus的轉(zhuǎn)基因植株)。取生長正常植株的根、莖、葉、小穗及種子等組織材料，按Jefferson (1987)的方法，將待測樣品浸入⑶S染色液中，37°C保溫2小時(shí)，用75%乙醇對(duì)葉片、莖等綠色組織進(jìn)行脫色處理，顯微鏡下觀察并拍照記錄⑶S的染色結(jié)果。
[0019]實(shí)施例的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)pC-p0sPYL8-GUS植株的胚乳部位能夠明顯檢測到⑶S染色，其根、莖、葉、小穗、胚等組織部位均無⑶S染色(附圖3)，說明啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)目的基因在水稻胚乳中特異性高效表達(dá)。在對(duì)照試驗(yàn)中，非轉(zhuǎn)基因植株的所有組織部位均無⑶S染色，轉(zhuǎn)p35S-gus植株的各個(gè)組織部位中均能觀察到⑶S染色(附圖3)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種水稻胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子，其特征在于:來源于水稻基因的上游啟動(dòng)子區(qū)，為下述DNA序列之一: (1)具有SEQID N0.1所示的DNA序列； (2)在SEQID N0.1所示序列基礎(chǔ)上對(duì)序列中間片段或堿基進(jìn)行插入、缺失或替換改變所產(chǎn)生，并且具有胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子活性的DNA序列； (3)在SEQID N0.1所示序列基礎(chǔ)上進(jìn)行5'-或者3'-缺失所產(chǎn)生，并且具有胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子活性的DNA序列。2.一種含有權(quán)利要求1所述的水稻胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體。3.如權(quán)利要求1所述的水稻胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子在水稻培育上的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種水稻胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子pOsPYL8，提供了一個(gè)水稻脫落酸（abscisic？acid，ABA）受體蛋白基因<i>OsPYL8</i>上游序列的啟動(dòng)子，命名為<i>pOsPYL8</i>啟動(dòng)子。本發(fā)明通過水稻不同組織部位表達(dá)譜分析及轉(zhuǎn)基因植株報(bào)告基因表達(dá)分析，證實(shí)<i>pOsPYL8</i>啟動(dòng)子可特異性地驅(qū)動(dòng)目的基因在水稻胚乳組織中表達(dá)。本發(fā)明提供的<i>pOsPYL8</i>啟動(dòng)子可應(yīng)用于基因工程改良稻米胚乳相關(guān)性狀及在胚乳中表達(dá)重組蛋白。
【IPC分類】C12N15/113, A01H5/00, C12N15/82
【公開號(hào)】CN105420242
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610017291
【發(fā)明人】陳松彪, 陳子強(qiáng), 王 鋒, 陳在杰
【申請(qǐng)人】福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
【公開日】2016年3月23日
【申請(qǐng)日】2016年1月12日