單位作為信號輸出，如圖2所示。
[0117] 圖2中的結果表明，該信號輸出與鏈霉親和素偶聯(lián)濃度的升高有關。該結果證實， 與金屬復合物活化表面偶聯(lián)時，所述捕獲劑，如鏈霉親和素的量可以通過偶聯(lián)過程中簡單 的蛋白質(zhì)滴定步驟來控制，而無需額外調(diào)整pH或時間或化學變化。
[0118] C.小鼠 IgG和鏈霉親和素的共偶聯(lián)
[0119] 根據(jù)實施例2部分A制備金屬復合物活化的納米粒子。在偶聯(lián)緩沖液(25mM MES pH 6)中制備蛋白質(zhì)，最終偶聯(lián)濃度見下頁表格：
[0120]
[0122] 含蛋白質(zhì)混合物的試管作低速(利用IKA Vortex GENIUS 3,3號設置)連續(xù)渦旋， 同時將40yL的金屬復合物活化的顆粒緩慢加入60yL蛋白質(zhì)溶液中以達到上表所列濃度。將 該顆粒溶液(10mg/mL)渦旋10秒，并且水浴超聲1分鐘。在室溫下將該顆粒溶液旋轉(zhuǎn)(旋轉(zhuǎn)器 設定Cl-速度50rpm)溫育1小時。然后用儲存緩沖液（50mM TBS，0 · 01 %Tween 20，0 · 05% ProClin 300，pH8)洗滌顆粒2次，在4°C下儲存在100yL儲存緩沖液中。通過連接生物素-小 鼠以6分析樣品（2.2、2.5、2.6、2.7和2.12)，由偶聯(lián)于辣根過氧化物酶的山羊抗小鼠抗體 (GAM-HRP)進行檢測，用多模分光光度計(TECAN infinite M200PR0)讀數(shù)，以相對化學發(fā)光 單位作為信號輸出，如圖3所示。
[0123] 圖3中的結果表明，該信號輸出與小鼠 IgG偶聯(lián)濃度的升高有關。負對照（100yg鏈 霉親和素/每mg顆粒)和正對照(60yg小鼠 IgG/每mg顆粒)都顯示出了期望的背景和特異性 信號強度。該結果也證明了，當與金屬復合物活化表面共偶聯(lián)時，大分子例如小鼠 IgG的量 可以通過偶聯(lián)過程中簡單的蛋白質(zhì)滴定步驟來控制，而無需額外調(diào)整pH或時間或化學變 化。
[0124] 通過連接生物素-RPE分析樣品（2.2、2.8、2.9、2.10、2.11和2.12)，用多模分光光 度計(TECAN infinite M200PR0)讀數(shù)，以相對化學發(fā)光單位作為信號輸出，如圖4所示。
[0125] 圖4和圖5中的結果表明，該信號輸出與小鼠 IgG或鏈霉親和素偶聯(lián)濃度的升高有 關。圖4中，陽性對照（100yg鏈霉親和素/每mg顆粒)和陰性對照(60yg小鼠 IgG/每mg顆粒)運 行良好，并且分別顯示預期的信號強度和背景噪音。在圖5中，陰性對照（100yg鏈霉/每mg顆 粒)和陽性對照（60yg小鼠 IgG/每mg顆粒)都分別顯示預期的背景和信號強度。這一結果也 表明，在偶聯(lián)至金屬復合物活化表面過程中所用的大分子(如鏈霉親和素和小鼠 IgG)的量 可以通過偶聯(lián)過程中簡單的蛋白質(zhì)滴定步驟來控制，而無需額外調(diào)整pH或時間或化學變 化。
[0126] D.對與200nm磁顆粒共偶聯(lián)的鏈霉親和素和小鼠 IgG進行凝集試驗
[0127] D-1.制備蛋白質(zhì)偶聯(lián)M270顆粒
[0128] 利用根據(jù)實施例2的A部分制備的75mM(終濃度)金屬復合物活化M270羧化磁性顆 粒（Dynal)來共偶聯(lián)生物素化山羊抗人IgG和BSA與金屬復合物活化的M270I270顆粒 (25mg/mL)在室溫下活化60分鐘。所述顆粒用25mM MES pH 6洗滌3次。所述抗體以2.5yg抗 體/每mg活化顆粒作包覆。包覆的抗體在室溫下溫育60分鐘。隨后在室溫下，將抗體包覆-顆 粒在25mM MES pH 6的緩沖液配制的0.1%BSA中封閉60分鐘，在TBS pH 8緩沖液中洗滌3 次，并且在4°C下，在TBS pH 8緩沖液中儲存。由鏈霉親和素偶聯(lián)HRP進行檢測，用多模分光 光度計(TECAN infinite M200PR0)讀數(shù)，以相對化學發(fā)光單位作為信號輸出，如圖6和7所 不。
[0129] 圖6和7中所示的化學發(fā)光測定結果（使用HRP偶聯(lián)鏈霉親和素作為檢測分子， Lumigen PS-ATT0作為試驗底物）中，金屬復合物活化顯示出了強特異性信號，同時還產(chǎn)生 了低背景非特異性信號（平均信噪比為9067x)。金屬復合物活化的M270免疫磁珠(與25yg/ mL的生物素-羊抗人抗體偶聯(lián)，用0.1 %BSA封閉），在lmg顆粒/mL的濃度下，以40x放大率作 顯微鏡檢測，只發(fā)現(xiàn)輕微的、無關緊要的凝聚。檢測加載在金屬復合物活化M270免疫磁珠上 的生物素化-山羊抗人抗體的早先滴定和試驗反映出，當在高于25yg抗體/mL顆粒的濃度下 偶聯(lián)至顆粒時，顆粒并未顯示出信號的增加，從而表明加載的抗體在25yg/mL濃度飽和。該 加載濃度對于凝集試驗是理想的，因為在這些顆粒上很少有或者沒有金屬復合物連接位點 可用于與其他類型顆粒相互作用。
[0130] D-2.制備金屬復合物-活化MyOne顆粒以與小鼠 IgG和BSA偶聯(lián)
[0131] 利用根據(jù)實施例2的A部分制備的75mM(終濃度)金屬復合物活化MyOne羧化磁性顆 粒(Dynal)，將山羊抗小鼠抗體和BSA共偶聯(lián)于金屬復合物活化的MyOne顆粒。MyOne顆粒 (10mg/mL)在室溫下活化60分鐘。用25mM MES pH6洗滌顆粒3次。所述抗體在每mg金屬復合 物活化MyOne顆粒40yg抗體、20yg抗體加20yg BSA或10yg抗體和30yg BSA的濃度下發(fā)生共 偶聯(lián)。包覆的顆粒在室溫下溫育60分鐘。然后洗滌顆粒并在4°C下儲存在10mM TBS pH 8中。 在顯微鏡觀察下，蛋白質(zhì)-包覆顆粒為單分散的（數(shù)據(jù)未顯示）。顆粒通過連接至小鼠抗兔 HRP進行檢測，用多模分光光度計(TECAN infinite M200PR0)讀數(shù)，以相對化學發(fā)光單位作 為信號輸出，如圖8所示。
[0132] 圖8的結果顯示，信號輸出的強度與山羊抗小鼠 IgG偶聯(lián)濃度的增加有關。該結果 證明，偶聯(lián)至金屬復合物活化顆粒時，大分子的加載量可以通過偶聯(lián)過程中簡單的蛋白質(zhì) 滴定步驟來控制，而無需額外調(diào)整pH或時間或化學變化。選取MyOne顆粒(20yg抗體和20yg BSA)在凝集試驗(D-3部分，實施例2)中使用。
[0133] D-3.凝集試驗
[0134] 凝集試驗中使用三種顆粒。它們?yōu)棣?703μπι顆粒(25yg/mL生物素化的-山羊抗人免 疫磁珠，用〇· 1%BSA封閉）、My0ne Ιμπι顆粒(Dynal lym，20yg/mg山羊抗小鼠，與20yg/mg BSA MyOne免疫磁珠共偶聯(lián)：自制），和Merck 200nm顆粒(樣品2.11，10yg/mg鏈霉親和素，與 10yg/mg小鼠 IgG Merck Ml-020/50Estapor顆粒共偶聯(lián)）。該顆粒在 10mM PBS緩沖液pH 7.4 或10mM TBS pH 8中進行試驗，M270顆粒的終濃度為6mg/mL，My0ne顆粒為2mg/mL，Merck 200nm顆粒為2π^/ηιΙ^Μ270顆粒與MyOne顆粒以1:1的顆粒比混合。Merck顆粒與M270顆粒和 MyOne顆粒的混合物以1:1的顆粒比混合。在4x稀釋度下，在顯微鏡（ΙΟΟΟχ放大率)下觀察顆 粒樣品和混合物。結果不于圖9和圖10。
[0135] 由于顆粒上分子之間的反應性，預計顆粒間發(fā)生凝集。如果Merck顆粒確實通過金 屬復合物活化已經(jīng)與鏈霉親和素和小鼠 IgG共偶聯(lián)，并且保留了活性，那么Merck珠上的鏈 霉親和素應該與M270顆粒上的生物素連接，Merck顆粒的小鼠 IgG應該與MyOne顆粒的山羊 抗小鼠 IgG連接。預期結果是三種類型的顆粒會凝集，從而引起明顯更多的團塊。然而，如果 鏈霉親和素和小鼠 IgG未成功地共偶聯(lián)至Merck顆粒上，和/或大分子的活性或構型被金屬 復合物共偶聯(lián)相互作用所抑制，則顆粒間不應有連接。
[0136] 比較所有三種顆粒的混合物與四個對照樣品（偶聯(lián)于金屬復合物活化M270免疫磁 珠的生物素化-山羊抗-人抗體、偶聯(lián)于金屬復合物活化MyOne磁珠的山羊抗小鼠抗體、與小 鼠 IgG共偶聯(lián)于金屬復合物活化MerckMl-020/50200nm顆粒的鏈霉親和素、和MyOne與Merck 顆粒的混合物）。使用400倍放大倍率的顯微鏡測量M270顆粒，1000倍放大倍率測量MyOne、 Merck和混合珠樣品，在溫育10分鐘、30分鐘、和1小時并作旋轉(zhuǎn)和攪拌后，檢查凝集現(xiàn)象。
[0137] 所有三種對照顆粒都為單分散的，幾乎都沒有呈現(xiàn)出結塊。同樣地，M270和MyOne 顆粒的對照顆?；旌衔镆脖憩F(xiàn)出非常少的凝集，這表明三種顆粒的混合物中的任何結塊都 不能歸因于這兩種顆粒間的相互作用（原始數(shù)據(jù)視頻呈現(xiàn)出，MyOne珠在一些M270顆粒周圍 移動，但拒絕與它們連接;視頻未提供）。另一方面，M270、My0ne和Merck顆粒的混合物甚至 在溫育10分鐘之后仍表現(xiàn)出大量凝集，表明Merck顆粒上的兩種大分子的活性并未受妨礙， 它們能夠成功地連接至M270和MyOne顆粒上的那些。
[0138] 用兩種緩沖液來稀釋顆粒。比較在PBS中稀釋的顆粒和顆?；旌衔?，與在TBS中稀 釋的同一樣品并沒有顯示出不同。在兩種緩沖液中的三種不同顆粒的凝集表明，共偶聯(lián)大 分子在兩種環(huán)境中都是有活性的，可用于將來的化學發(fā)光測定法（需要TBS緩沖液)和熒光 測定法（需要PBS緩沖液）。這種凝集結果提供了直接的視覺證據(jù)以支持實施例2中C部分的 觀察結果，即兩種大分子(抗體和鏈霉親和素)成功地共偶聯(lián)至金屬復合物活化200nm磁性 顆粒。
[0139] 實施例3:偶聯(lián)抗體和鏈霉親和素至金屬復合物活化10-15nm超順磁氧化鐵納米粒
[0140]本實施例的目的是要證明，10_15nm氧化鐵超順磁性納米粒子可以被金屬復合物 活化，然后與兩種不同的大分子，如抗體和鏈霉親和素偶聯(lián)。
[0141 ] A.制備金屬復合物活化的氧化鐵納米粒子
[0142] 超順磁性氧化鐵(Fe3〇4)納米粒子購自美國SkySpring納米材料公司（SkySpring Nanomaterials，Inc，US)。使用探針超聲波儀(3 X 10秒，時間間隔10秒），形成在水中的氧化 鐵均勻懸浮液(440mg/ml)。在Eppendorf管中，向390yL的金屬復合物溶液(如實施例2的A部 分所述）中，緩慢加入l〇l〇yL的儲存的氧化鐵懸浮液，同時不斷低速渦旋。該顆粒渦旋30秒， 并在水浴中超聲處理5分鐘。將Eppendorf管旋轉(zhuǎn)溫育，1小時后，使用探針超聲波儀(3X10 秒，10秒作為一個間隔)形成均勻的懸浮液。使用磁體拉下顆粒，顆粒從上清液除去，并加入 400yL的40mM通用緩沖液pH 8(偶聯(lián)緩沖液）。將懸浮液渦旋5秒，水浴超聲處理1分鐘。除去 上清液，并加入400yL的40mM通用緩沖液pH 8,該過程總計重復三次。在顯微鏡下檢查顆粒。 [0143]