骨或組織時，在一些情況下，可以在具有一種或多種支持物的情況下如此提供。在具體實施方案中，支持物可再吸收。在一些方面，支持物由其軟骨形成功能完成期間和/或之后將由個體的身體再吸收的材料組成。在具體情況下，支持物不可再吸收。在某些實施方案中，支持物由可以留在身體內并且充當維持軟骨形狀和功能的支架的金屬或一種或多種其他材料組成。
[0043]向鼻、耳、膝、肩、肘或身體其他區(qū)域遞送來自脂肪細胞的軟骨或組織時，可以在個體需要結締組織的情況下這樣做。在一些情況下，不向關節(jié)遞送來自脂肪細胞的軟骨或組織。在具體實施方案中，不向脊椎盤遞送軟骨組織。
[0044]在本發(fā)明的多個方面，當脂肪細胞在體內經歷機械應變時，脂肪細胞在體內經歷步驟之前不經歷生長因子、基質分子、機械應變或其組合作用。在具體的實施方案中，向個體的關節(jié)遞送脂肪細胞。在一些情況下，個體患有椎間盤疾病。在具體實施方案中，向椎間盤遞送細胞。在一些實施方案中，遞送至關節(jié)之后，關節(jié)中存在脂肪細胞和軟骨細胞樣細胞的混合物。軟骨細胞樣細胞可以進一步限定為產生基質分子如膠原蛋白1、膠原蛋白I1、蛋白聚糖(如聚集蛋白聚糖)或其組合的細胞。膠原蛋白可以包括I型和II型膠原蛋白。
[0045]當脂肪細胞遞送至個體時，它可以存在于椎間盤之間。在特定方面，在內層纖維環(huán)中髓核和裂隙之間或其內部遞送脂肪細胞。
[0046]本發(fā)明的方法還可以包括從個體獲得脂肪細胞。在一些情況下，將獲得的脂肪細胞擴充，如至少I天。在一些情況下，將獲得的脂肪細胞傳代，如傳代不止一次。
[0047]在某些實施方案中，向個體的關節(jié)遞送脂肪細胞之后，多個脂肪細胞死亡。在具體實施方案中，脂肪細胞的死亡導致來自個體的內源關節(jié)細胞的細胞反應。在一些實施方案中，細胞反應包括刺激個體的內源關節(jié)細胞生長。在某些方面，向個體的關節(jié)遞送脂肪細胞之后，關節(jié)中形成疤痕組織。
[0048]在本發(fā)明的實施方案中，脂肪細胞相對于個體是自體的或同種異型的。
[0049]前文已經相當廣泛地概述本發(fā)明的特征和技術優(yōu)點，目的在于可以更好理解隨之而來的本發(fā)明的詳細描述。將在下文描述本發(fā)明的額外特征和優(yōu)點，這形成本發(fā)明權利要求的主題。本領域技術人員應當理解，可以容易地使用所公開的構思和具體實施方案作為修改或設計用于實施本發(fā)明相同目的其他結構的基礎。本領域技術人員也應當認識到，這類等同結構不脫離如所附權利要求書中所述的本發(fā)明精神和范圍。聯系附圖考慮時，將從以下描述中更好地理解就其組織和操作方法而言據信是本發(fā)明特征的新特性，連同其他目的和優(yōu)點。然而，將明確地理解，每張圖僅出于說明和描述目的而提供并且是不意在作為限制本發(fā)明的定義。
[0050]發(fā)明詳述
[0051]如本說明書在此所用，“一個”或“一種”可以意指一個(一種)或多個(多種)。如本文權利要求中所用，與詞“包含”結合使用時，詞“一個”或“一種”可以意指一個或多于一個。如本文所用，“另一個”可以意指至少第二個或更多個。在具體實施方案中，本發(fā)明的多個方面可以例如“基本上由本發(fā)明的一個或多個要素或步驟組成”或“由其組成”。本發(fā)明的一些實施方案可以由本發(fā)明的一個或多個要素、方法步驟和/或方法組成或基本上由其組成。構思了本文所述的任何方法或組合物可以相對于本文所述的任何其他方法或組合物來實施。
[0052]如本文所用的術語“脂肪細胞”(也可以稱作脂肪細胞(adipocyte)或脂肪細胞(lipocyte)或脂肪細胞(fat cell))指能夠合成并含有巨大脂肪球的結締組織細胞。包括以下兩種類型的脂肪細胞:I)具有巨大脂肪滴、少量細胞質和扁平狀不居中胞核的白色脂肪細胞;和2)具有大小各異的脂肪滴、大量細胞質、眾多線粒體和圓形居中胞核的褐色脂肪細胞。脂肪細胞脂肪的主要化學組分包括三酰甘油，它們是由甘油和一種或多種脂肪酸如硬脂酸、油酸或棕櫚酸組成的酯。
[0053]如本文所用的術語“軟骨細胞樣細胞”指不是原代軟骨細胞而例如從脂肪細胞衍生的細胞。這些軟骨細胞樣細胞具有軟骨細胞(軟骨的細胞)的表型，所述表型包括軟骨細胞的形狀(多邊形和/或長菱形細胞，例如)，和/或能夠聚集并產生軟骨基質組分，例如硫酸化蛋白聚糖和II型膠原蛋白。因此，軟骨細胞樣細胞的示例性標志物例如包括以下一種或多種:作為硫酸軟骨素和硫酸角質素蛋白聚糖的聚集蛋白聚糖、II型膠原蛋白、Sox-9蛋白、軟骨連接蛋白和作為硫酸類肝素蛋白聚糖的基底膜蛋白聚糖。
[0054]如本文所用的術語“關節(jié)”，指其中骨骼的兩根骨接合的體內區(qū)域。
[0055]如本文所用的術語“再分化的脂肪細胞”指這樣脂肪細胞，其已經歷多種條件作用以變成軟骨細胞樣細胞。這些條件可以屬于任何合適的種類，不過在具體實施方案中，機械條件包括靜水壓力(包括恒定或間歇靜水壓力)、低氧、流體剪應力等。
[0056]術語“流體剪應力”指流體在表面上導致剪應力產生的運動。剪應力是其中應力與表面平行的應力狀態(tài)。微流體支架允許流體在微流道中流動。這種流體流動在支架中接種的細胞上引起流體剪應力。
[0057]如本文所用，術語“密封的”指變成不透液，例如由融合或密封而不透液。尤其，密封膜不允許其內部的液體離開該膜，不過它允許氧和二氧化碳跨過膜(如允許氧進入膜并允許二氧化碳離開膜)。
[0058]術語“靜水壓力”指液體(例如，水)在靜息時發(fā)出或傳遞的壓力。在不同負載期間，椎間盤暴露于廣泛類型的椎間盤內靜水壓力并且在平躺或放松站立期間最小(約0.25MPa)并且在彎腰提起重物期間最大(約2.5至5MPa)。這些不同的負載幅度通過改變取決于其幅度的椎間盤基質周轉而影響椎間盤。已經進行眾多研究以確定體外施加至細胞以體外誘導細胞生軟骨分化的間歇靜水壓力(IHP)的最佳方案。已經檢驗了不同的方案。在這些研究中，以0.5MPa至約5MPa幅度范圍內和0.0lHz至IHz的頻率范圍施加IHP。在具體實施方案中，將包封裝置設計成傳遞體內靜水壓力至細胞-基質結構。在不同負載練習期間壓縮以液體(介質)填充的外囊;在這種壓縮下，液態(tài)介質經半透性內膜擴散，所述半透性內膜允許灌注細胞-基質結構并在細胞-基質結構內部產生靜水壓力。在這個系統中，適宜的生理的靜水壓力施加至細胞-基質結構，這可用于細胞的生軟骨分化。
[0059]如本文所用的術語“缺氧”指氧缺乏。在具體方面，它指小于約20%的氧張力。
[0060]如本文所用的術語“關節(jié)”，指其中骨骼的兩根骨接合的體內區(qū)域。
[0061 ] 1.一般實施方案
[0062]雖然可以通過本發(fā)明的方法至少部分地修復任何組織，包括任何軟骨組織，在特定的示例性實施方案中，修復椎間盤軟骨或關節(jié)軟骨。本發(fā)明的一般實施方案是使用脂肪細胞作為工程化椎間盤用新軟骨的細胞源。本發(fā)明涵蓋這些細胞分化成軟骨細胞樣細胞。
[0063]在本發(fā)明的具體實施方案中，脂肪細胞可以按多種方式之一分化成軟骨細胞樣細胞，所述方式包括離體、在體外和/或在體內方式。在具體實施方案中，特定條件用來促進從離體脂肪細胞分化出軟骨細胞，例如包括以下條件:I)三維度;2)低氧張力;和3)機械應力；4)間歇靜水壓力;5)流體剪應力;和/或6)有助于生軟骨分化的其他外部條件。
[0064]I1.本發(fā)明中所用的細胞
[0065]在本發(fā)明的某些實施方案中，可以使用任何細胞，只要這種細胞能夠分化成軟骨細胞或軟骨細胞樣細胞。然而，在具體實施方案中，細胞例如是脂肪細胞?？梢岳米泽w細胞，不過在可選實施方案中，使用同種異型細胞，在具體實施方案，已經分析同種異型細胞的疾病并且認為它們適于人類傳遞。在本發(fā)明的某些方面，細胞是自體的，不過在可選實施方案中，細胞是同種異型的。在細胞不是自體細胞的情況下，在本發(fā)明中使用之前，細胞可以由本領域標準手段處理以移除潛在有害的物質、病原體等。
[0066]可以例如使用手術切除或吸脂術，收獲脂肪細胞。
[0067]在具體方面，可以通過使用機械應變，促進人脂肪細胞的軟骨細胞樣分化。在本發(fā)明的具體實施方案中，從脂肪細胞分化時，所得到的細胞在體內包括表示I型和II膠原蛋白和蛋白聚糖的某些生物化學標志物的表達。
[0068]在具體方面，人脂肪細胞的軟骨細胞樣分化可以在體內發(fā)生，其中椎間盤的微觀環(huán)境有助于軟骨細胞分化。在具體的實施方案中，靜水壓力負載、缺氧、椎間盤中常駐性軟骨細胞的細胞間相互作用和椎間盤中的其他生物化學環(huán)境可以促進從脂肪細胞分化成軟骨細胞。在本發(fā)明的具體實施方案中，細胞移植之后椎間盤的細胞將是脂肪細胞和軟骨細胞的組合，其產生具有生物化學標志物I型和II型膠原蛋白和/或在軟骨和纖維組織中存在的眾多蛋白聚糖的脂肪組織和軟骨組織。
[0069]在一些實施方案中，脂肪細胞可以在軟骨細胞分化和軟骨產生之前和/或期間接種于基質中。在使用基質(它可以稱作支架)的實施方案中，基質可以由允許細胞結合至材料表面并形成三維組織的材料組成。這種材料可以是無毒的、生物相容的、生物可降解的，可再吸收的或其組合。在一些實施方案中，可以利用有機聚合物如聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、聚-ε-己內酯(PCL)、聚氨基酸、聚酐、聚原酸酯;天然水凝膠如膠原蛋白、透明質酸、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖；合成性水凝膠如聚(環(huán)氧乙烷)(PEO)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(丙烯酸)(ΡΑΑ)、聚(丙烯延胡索酸酯-共-乙二醇)[P(PF-共-EG)及其共聚物。在某些情況下，可以使用藻酸鹽珠作為支架。在一些實施方案中，可以在例如需要短暫或永久結構性支撐的某些情況下，使用陶瓷材料如羥基磷灰石和/或磷酸三鈣(TC