酸序列在該位置的殘基）?？梢允褂美缫韵滤龅闹亟M CBS生產(chǎn)的新方法產(chǎn)生這樣的變體。
[0044] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的任何上述CBS變體、包括任何截短CBS蛋白，包含 的氨基酸序列與SEQ ID N0: 2代表的野生型氨基酸序列或與其生物活性截短物具有至少 大約50%同一性、或至少大約55%同一性、或至少大約60%同一性、或至少大約65%同一性、或 至少大約70%同一性、或至少大約75%同一性、或至少大約80%同一性、或至少大約85%同一 性、或至少大約90%同一性、或至少大約95%同一性、或至少大約96%同一性、或至少大約97% 同一性、或至少大約98%同一性、或至少大約99%同一性;尤其包括非血紅素-結(jié)合或非S-腺 苷甲硫氨酸(AdoMe t)結(jié)合，其中所述變體保留催化活性(例如，其中在AdoMet存在時(shí)某些截 短形式的CBS的活性甚至可超過全長CBS)。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的人CBS變體是截 短的重組人CBS (rhCBSAC)同型二聚體酶，其中C-末端調(diào)節(jié)區(qū)已被移除（SEQ ID N0: 3)。 在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的人CBS變體是截短的重組人CBS酶，其中氨基酸位置15的半胱 氨酸已突變?yōu)榻z氨酸(SEQ ID N0: 13)。
[0045] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的CBS蛋白包含與SEQ ID NO: 2具有小于100%同一性 的氨基酸序列，尤其是具有美國專利號8,007,787中給出的截短變體的氨基酸序列的其截 短實(shí)施方案，和尤其是本文給出的SEQ ID N0: 3和SEQ ID N0: 13,和在具體的實(shí)施方案中 在美國專利號8，007,787給出的截短變體的增長中具有小于99%序列同一性、小于98%序列 同一性、小于97%序列同一性、小于96%序列同一性、小于9 5%序列同一性、小于94%序列同一 性、小于93%序列同一1性、小于92%序列同一1性、小于91%序列同一 1性、小于90%序列同一1性等 等，和尤其是本文給出的SEQ ID N0: 3和SEQ ID N0: 13。
[0046] 除非另有說明，否則本文使用的同一性百分率(％同一性）的提及是指使用包括但 不限于以下的序列比對工具或程序而進(jìn)行的對同源物的評價(jià)：（1) BLAST 2.0 Basic BLAST同源性搜索，對氨基酸搜索使用blastp，對核酸搜索使用blastn，用標(biāo)準(zhǔn)缺省參數(shù)，其 中對于低復(fù)雜度區(qū)通過缺省來過濾查詢序列；（2) BLAST 2比對(使用下述參數(shù)）；（3)和/或 PSI-BLAST，用標(biāo)準(zhǔn)缺省參數(shù)（位置-特異性重復(fù)BLAST)。注意，因?yàn)樵贐LAST 2.0 Basic BLAST和BLAST 2之間的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的一些差異，所以，兩種特定序列在使用BLAST 2程序時(shí)可 能被識別為具有顯著同源性，而在BLAST 2.0 Basic BLAST中使用所述序列中的一個(gè)作為 查詢序列進(jìn)行搜索，可能不會確定該第二序列是最佳匹配。另外，PSI-BLAST提供了自動化、 易于使用的"profile"搜索形式，這是尋找序列同源物的靈敏方式。該程序首先進(jìn)行空位 BLAST數(shù)據(jù)庫搜索。PSI-BLAST程序采用來自任何重要比對的信息，返回構(gòu)建位置特異性打 分矩陣，其替代查詢序列進(jìn)行下一輪數(shù)據(jù)庫搜索。因此，應(yīng)當(dāng)知道，可通過使用這些程序的 任一種來確定%同一 1性。
[0047] CBS衍生物包括在本發(fā)明范圍中。這類衍生物是經(jīng)化學(xué)修飾的CBS多肽組合物，其 中CBS多肽與聚合物連接。所選的聚合物通常是水溶性的，使得與其連接的蛋白質(zhì)在水性環(huán) 境中不沉淀并使得CBS酶在生物液體例如生理環(huán)境中具有生物活性。所述聚合物可以是任 何分子量，并且可以是分枝或不分枝的。CBS多肽聚合物的范圍中包括聚合物混合物。在具 體的實(shí)施方案中，對于終產(chǎn)物制劑的治療用途，所述聚合物將是藥學(xué)上可接受的。
[0048]所述水溶性聚合物或其混合物可以是選自例如，聚乙二醇(PEG)、單甲氧基-聚乙 二醇、葡聚糖(例如低分子量葡聚糖，例如大約6 kDa的低分子量葡聚糖）、纖維素、或其它基 于碳水化合物的聚合物、聚-(N-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化 乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如，甘油）、聚水楊酸和聚乙烯醇。本發(fā)明也包括雙功能PEG 交聯(lián)分子，其可用于制備共價(jià)連接的CBS多肽多聚體。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚乙二醇分子選 自不分枝的和分枝的聚乙二醇，其中聚乙二醇分子的分子量等于或大于2000道爾頓。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，聚乙二醇分子的分子量范圍為2 - 100kD、5 - 80 kD或10 - 40 kD。在再 一個(gè)實(shí)施方案中，聚乙二醇分子選自腿-20(^六08、]^-0201^、]\^-4001^、61^-4001^、61^4-400獻(xiàn)、61^-800獻(xiàn)、]\^-05065、]\^-20065、]\^-20(^1^或1^?厶-201'。
[0049] 在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供截短的重組人CBS (rhCBSAC)同型二聚體酶， 其中C-末端調(diào)節(jié)區(qū)已被移除（SEQ ID N0: 3)，所述酶已經(jīng)通過與聚乙二醇(PEG)共價(jià)連接 而化學(xué)修飾，所述酶包括本文給出的"聚乙二醇化種類"。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，本發(fā) 明的人CBS變體是截短的重組人CBS酶，其中氨基酸位置15的半胱氨酸已突變?yōu)榻z氨酸(SEQ ID N0: 13)，所述酶已經(jīng)通過與聚乙二醇(PEG)共價(jià)連接而化學(xué)修飾，所述酶包括本文給出 的"聚乙二醇化種類"。
[0050] 用于聚乙二醇化反應(yīng)以產(chǎn)生修飾的聚乙二醇化種類的各種PEG試劑的具體的實(shí)施 方案見表1。
[0051] 表 1 CBS多肽的聚乙二醇化可通過本領(lǐng)域已知的任何聚乙二醇化反應(yīng)來進(jìn)行。聚乙二醇化 可以經(jīng)由與如下所述的反應(yīng)性聚乙二醇分子(或類似的反應(yīng)性水溶性聚合物）的?；磻?yīng) 或烷基化反應(yīng)來進(jìn)行。對于?；磻?yīng)，所選聚合物應(yīng)具有單一反應(yīng)性酯基團(tuán)。對于還原性烷 基化，所選聚合物應(yīng)具有單一反應(yīng)性醛基團(tuán)。反應(yīng)性醛是例如，聚乙二醇丙醛，其是水穩(wěn)定 性的，或其單心-心^烷氧基或芳氧基衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚乙二醇分子經(jīng)由選 自以下的連接基團(tuán)與CBS連接:N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、胺、和由單醛組成的醛、單酸的單 酯、單胺、單硫醇、單二硫化物、單溴碳酸苯酯、單氯碳酸苯酯、單氟碳酸苯酯、單硝基碳酸苯 酯、單羰基咪挫、單酰肼、單碘乙酰胺、單馬來酰亞胺、單鄰二硫吡啶(monoorthopyridyl disulfide)、單Η虧、單苯基乙二醛、單噻唑燒-2-硫酮、單硫酯、單三嗪和單乙稀砜。
[0052]本文使用的一種水溶性聚合物是聚乙二醇，縮寫為PEG。本文使用的聚乙二醇意圖 包括已用于衍生其它蛋白質(zhì)的任何形式的PEG，例如單-(Q-Ck))烷氧基-或芳氧基-聚乙二 醇。
[0053] -般而言，化學(xué)衍生可在用于使生物活性物與活化聚合物分子反應(yīng)的任何合適條 件下進(jìn)行。制備聚乙二醇化的CBS多肽的方法通常包含以下步驟：（a)在使CBS多肽與一個(gè) 或多個(gè)PEG基團(tuán)連接的條件下使所述多肽與聚乙二醇(例如PEG的反應(yīng)性酯、胺、醛或馬來酰 亞胺衍生物)反應(yīng)，和(b)得到反應(yīng)產(chǎn)物。一般而言，?；磻?yīng)的最佳反應(yīng)條件是根據(jù)已知 參數(shù)和所需結(jié)果而決定。例如，PEG:蛋白質(zhì)的比例越大，聚-聚乙二醇化的產(chǎn)物的百分率就 越大。在一個(gè)具體方面，CBS多肽衍生物將在氨基端具有單個(gè)PEG部分。在具體的實(shí)施方案 中，本發(fā)明提供的聚乙二醇化的CBS酶具有共價(jià)連接在所述組合物中的每個(gè)酶亞基上的平 均大約1至大約10、更尤其是2至大約5和更尤其是3至5個(gè)PEG分子。
[0054] 本發(fā)明的蛋白優(yōu)選地是以"基本純的"形式而回收、獲得、和/或使用。本文使用的 "基本純的"是指允許所述蛋白在體外、離體或在體內(nèi)依照本發(fā)明而有效使用的純度。對于 依照本發(fā)明用于在體外、離體或在體內(nèi)方法的蛋白而言，它基本上不含污染物、其它蛋白 和/或可能干擾或?qū)蓴_其在本發(fā)明公開方法中的用途的化學(xué)物質(zhì)，或當(dāng)用于本發(fā)明公 開的方法時(shí)至少對包含CBS蛋白（包括同源物）是不合需要的化學(xué)物質(zhì)。這樣的方法包括酶 促反應(yīng)(例如，產(chǎn)生胱硫醚）、治療用組合物的制備、治療用組合物的給予、和本文公開的所 有其它方法。本文提及的"基本純的"蛋白，是可通過任何方法（即通過自天然來源直接純 化、經(jīng)重組、或合成）產(chǎn)生的并且從其它蛋白組分中純化的蛋白，使得在指定組合物中所述 蛋白包含總蛋白重量的至少大約80%重量(例如，所述CBS蛋白在溶液/組合物/緩沖液中為 大約80%蛋白），和更優(yōu)選地在指定組合物中總蛋白重量的至少大約85%，和更優(yōu)選地至少大 約90%，和更優(yōu)選地至少大約91%，和更優(yōu)選地至少大約92%，和更優(yōu)選地至少大約93%，和更 優(yōu)選地至少大約94%，和更優(yōu)選地至少大約95%，和更優(yōu)選地至少大約96%，和更優(yōu)選地至少 大約97%，和更優(yōu)選地至少大約98%，和更優(yōu)選地至少大約99%重量。在重組細(xì)菌中產(chǎn)生的所 述CBS蛋白或其截短變體的實(shí)施方案中，術(shù)語"純化的"或"基本純的"將被理解為包括從脂 多糖和其它熱原性化合物中純化。
[0055] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將會知道，使用重組DNA技術(shù)可通過操縱以下方面而改善對轉(zhuǎn)染 的核酸分子的表達(dá)控制:例如通過操縱宿主細(xì)胞中的核酸分子的拷貝數(shù)、所述核酸分子轉(zhuǎn) 錄的效率、所得轉(zhuǎn)錄本的翻譯效率、和翻譯后修飾效率。另外，可對啟動子序列進(jìn)行遺傳工 程改造以改善相比天然啟動子而言的表達(dá)水平。
[0056] 用于控制核酸分子表達(dá)的重組技術(shù)包括但不限于將核酸分子整合到一個(gè)或多個(gè) 宿主細(xì)胞染色體，將載體穩(wěn)定性序列加入質(zhì)粒、轉(zhuǎn)錄控制信號（例如，啟動子、操縱子、增強(qiáng) 子)的取代或修飾，翻譯控制信號(例如，核糖體結(jié)合位點(diǎn)、Shine-Dalgarno序列）的取代或 修飾，將核酸分子修飾為符合宿主細(xì)胞的密碼子使用，以及使破壞轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性的序列缺 失。
[0057] 又一方面，本發(fā)明涉及用于重組產(chǎn)生和純化人胱硫醚β-合酶的方法。所述方法包 括以下步驟:將編碼人CBS酶或其截短的或突變的變體的核酸序列克隆到表達(dá)載體中，所述 序列如美國專利號8,007,787給出的和尤其是本文的SEQ ID N0: 4。在某些實(shí)施方案中，人 CBS-編碼序列已經(jīng)修飾以利用用于在微生物例如大腸桿菌中表達(dá)的經(jīng)優(yōu)化的密碼子。在其 它實(shí)施方案中，所述載體包括：（a)將融合配偶體(例如，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶或GST)與有待 表達(dá)的核酸序列連接在一起的克隆位點(diǎn)，和(b)蛋白酶切割識別位點(diǎn)，用于人鼻病毒3C蛋白 酶(例如，可得自GE Healthcare，是被稱為PreScission蛋白酶的融合蛋白）或用于使用類 似切割位點(diǎn)的蛋白酶，用于在重組融合蛋白表達(dá)后從CBS蛋白上切割融合配偶體。作為本發(fā) 明的一部分，表達(dá)載體首先經(jīng)遺傳修飾，用于特別引入CBS-編碼核酸序列，其將導(dǎo)致CBS-融 合蛋白的表達(dá)，其可經(jīng)人鼻病毒3C蛋白酶切割，使得產(chǎn)生僅具有一個(gè)額外的非CBS的N-末端 氨基酸殘基的CBS蛋白。該結(jié)果不可能使用市售載體中的未經(jīng)修飾的多克隆位點(diǎn)。將CBS-編 碼核酸序列引入經(jīng)遺傳修飾的載體，表達(dá)重組融合蛋白并將其純化，使用常規(guī)方法或適合 CBS生產(chǎn)的那些方法(參見例如美國專利號5,635,375，出處同上），最終，融合配偶體和除 了非CBS氨基酸殘基以外都從CBS蛋白中切割，得到高度純化的幾乎完整的人重組CBS蛋白， 其對于人用治療用途而言是理想的。在特別有利的實(shí)施方案中，編碼人CBS蛋白的核苷酸經(jīng) 工程改造為重組細(xì)胞的密碼子使用頻率，所述重組細(xì)胞是經(jīng)重組制備的。這類實(shí)施方案的 非限制性實(shí)在本文作為SEQ ID NO: 4給出，其中CBS-編碼核酸經(jīng)改造以適合在大腸桿菌中 優(yōu)化重組表達(dá)。
[0058] 本發(fā)明的一些方面包括組合物，其包含本文所述的任何CBS變體，用于體外的胱硫 醚或半胱氨酸的產(chǎn)生，以便在體外移除或產(chǎn)生硫化氫，或用于體內(nèi)的治療用途(例如，治療 或預(yù)防高胱氨酸尿癥和與其相關(guān)的病況）。因此，本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及組合物，其包 含分離的CBS蛋白和尤其是美國專利號8,007,787給出的其截短變體和尤其是本文所述的 SEQ ID N0: 3或SEQ ID N0: 13。所述組合物典型地也包含藥學(xué)上可接受的載體。所述組合 物及其組分可用于本文所述的本發(fā)明的任何體外或治療性實(shí)施方案。
[0059] 本文使用的"H0"小鼠是傳統(tǒng)高胱氨酸尿癥的一種新的小鼠模型，其中所述小鼠 cbs基因被滅活并表現(xiàn)出在人CBS啟動子控制下的低水平的人CBS轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。該小鼠模 型的Hcy、甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、和S-腺苷高半胱氨酸的血漿和組織水平同時(shí)表現(xiàn)出 嚴(yán)重升高并伴有半胱氨酸的血漿和肝水平的減少。參見Maclean等人，2010 1〇1.6〇11的· Metab. 101:153-62)〇
[0060] 本發(fā)明的組合物可用于在體外產(chǎn)生胱硫醚和半胱氨酸或用于治療可從增加的CBS 活性獲益的個(gè)體(例如，患有高胱氨酸尿癥的個(gè)體）。
[0061 ]依照本發(fā)明，"藥學(xué)上可接受的載體"包括藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或藥學(xué)上可 接受的遞送媒介物，其適用于所述組合物給予至合適的體外、離體或體內(nèi)部位。合適的體 外、體內(nèi)或離體部位優(yōu)選包含其中需要調(diào)節(jié)CBS活性的任何部位。藥學(xué)上可接受的載體能夠 將本發(fā)明蛋白或重組核酸分子保持這樣的形式:在蛋白或重組核酸分子到達(dá)培養(yǎng)物或個(gè)體 中的靶細(xì)胞或組織時(shí)，所述蛋白或重組核酸分子能夠與其靶(例如，CBS的底物)相互作用。
[0062] 本發(fā)明的合適的賦形劑包括轉(zhuǎn)運(yùn)或有助于轉(zhuǎn)運(yùn)、但不會將組合物特異性靶向細(xì)胞 的賦形劑或制劑(在本文中也稱為非靶向載體）。藥學(xué)上可接受的賦形劑的實(shí)例包括但不限 于水、磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、含血清的溶液、Hank ' s溶液、其它水性的 生理平衡溶液、油、酯和二醇。水性載體可包含接近受者的生理?xiàng)l件所需的合適的輔助物 質(zhì)，例如通過增強(qiáng)化學(xué)穩(wěn)定性和等滲性來