溶解性結(jié)果
[0327]
[0328] 從表13可以看出，本發(fā)明的部分化合物經(jīng)過成鹽后溶解度比拉帕替尼大大增加， 克服了拉帕替尼溶解性差這一缺點(diǎn)。其中，化合物72在水中的溶解性可以達(dá)到15. 89mg/ mL，可以做成注射劑型給藥。
[0329] 實(shí)施例82:HER-2激酶抑制劑活性測(cè)定
[0330] 目的：
[0331] 利用MobilityShiftAssay的方法在KmATP的情況下，檢測(cè)化合物對(duì)激酶HER-2 的抑制活性篩選。
[0332]背景：
[0333] 在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)體外激酶Her2進(jìn)行化合物的篩選，每個(gè)化合物從3μΜ起始，3倍 稀釋，10濃度點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)（2復(fù)孔）。采用化合物staurosporine(Sigma,彡95% )作為標(biāo) 準(zhǔn)對(duì)照。
[0334] 實(shí)驗(yàn)方法：
[0335]I.配制IX激酶緩沖液和終止液
[0336] 1.IX激酶緩沖液
[0337] 50mMHEPES(Sigma),pH7. 5
[0338] 0. 0015%Brij-35 (Sigma)
[0339]lOmMMgCl2
[0340]2mMDTT(二硫蘇糖醇）
[0341] 2.終止液
[0342] 100mMHEPES(Sigma),pH7. 5
[0343] 0. 015%Brij-35 (Sigma)
[0344] 0· 2%CoatingReagent#3(caliper公司）
[0345] 50mMEDTA
[0346]II.化合物配制
[0347] 1)化合物稀釋
[0348] 1、化合物檢測(cè)終濃度為起始3μM，首先配置成50倍濃度，即150μM。
[0349] 2、在96孔板中Α行第2個(gè)孔加入100μ1溶解于100 %DMS0的化合物，3倍稀釋 該化合物，共10個(gè)濃度。操作為除第2個(gè)孔以外每個(gè)孔加入60μ1 100%DMS0,從第2個(gè) 孔中取30μ1化合物到第3個(gè)孔，依次類推，稀釋到第11孔，共10個(gè)濃度。
[0350] 2)轉(zhuǎn)移5倍化合物到反應(yīng)板
[0351] 1、從上述96孔板的每一孔取10μ1到另一塊96孔板中，加入90μ1IX的激酶 緩沖液。因此，化合物溶解于10%DMS0中。在振板機(jī)上振蕩10分鐘，混勻。
[0352] 2、從上述96孔板中取出5μ1到一塊384孔反應(yīng)板。每行設(shè)陰性對(duì)照孔和陽性對(duì) 照孔各2個(gè)。96孔板中Α行化合物以左右復(fù)孔的形式轉(zhuǎn)入384孔板Α行第13-24孔。因 此，384孔反應(yīng)板中就有5μ1的10%DMS0溶解的5倍化合物。
[0353]III.激酶反應(yīng)
[0354] 1)配制2. 5倍酶溶液
[0355] 將激酶（Carna公司，45ηΜ)加入1X激酶緩沖液，形成2. 5倍酶溶液。
[0356] 2)配制2. 5倍的底物溶液
[0357] 將FAM標(biāo)記的多肽（吉爾生化公司，3μΜ)和ATP(Sigma, 7. 5μΜ)加入1X激酶 緩沖液，形成2. 5倍底物溶液。
[0358] 3)向384孔板中加入酶溶液
[0359] 1、384孔反應(yīng)板中已有5μ1的10 %DMS0溶解的5倍化合物。
[0360] 2、在384孔反應(yīng)板中加入10μ1的2. 5倍酶溶液。
[0361] 3、室溫下孵育10分鐘。
[0362] 4)向384孔板中加入底物溶液
[0363] 在384孔反應(yīng)板中加入10μ1的2. 5倍底物溶液。
[0364] 5)激酶反應(yīng)和終止
[0365]1、28°C下孵育1小時(shí)。
[0366]2、加25μ1終止液終止反應(yīng)。
[0367]IV.Caliper讀取數(shù)據(jù)
[0368]Caliper上讀取轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)。
[0369] V.IC5。值計(jì)算
[0370]1、從Caliper上復(fù)制轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)。
[0371] 2、把轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化成抑制率數(shù)據(jù)。其中max是指DMS0對(duì)照的轉(zhuǎn)化率，min是指無酶 活對(duì)照的轉(zhuǎn)化率。
[0372]抑制率=(max-化合物轉(zhuǎn)化率）/(max-min) *100。
[0373] 3、抑制率數(shù)據(jù)用GraphPad5. 0(美國(guó)Caliper公司生產(chǎn)）獲得IC5。值。
[0374] Y=最小值+ (最大值-最小值）八1+10~((LogICM-X)*斜率））
[0375] 表14本發(fā)明化合物對(duì)HER-2激酶抑制活性
[0376]
[0377] 由表14中的數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明的部分化合物HER-2激酶活性強(qiáng)于對(duì)照藥拉帕 替尼，其中部分化合物比對(duì)照藥強(qiáng)3倍以上。
[0378] 實(shí)施例83:EGFR和HER-4激酶抑制劑活性測(cè)定
[0379] 按照實(shí)施例82相同的方法，可以測(cè)得化合物EGFR(Carna，45nM)和 HER-4(Carna，45nM)激酶抑制劑活性。
[0380] 表15本發(fā)明化合物對(duì)EGFR和HER-4激酶抑制活性
[0381]
[0382] 由表15中的數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明的部分化合物EGFR和HER-4激酶活性強(qiáng)于對(duì) 照藥拉帕替尼，其中部分化合物比對(duì)照藥強(qiáng)3倍以上。表明該系列化合物具有很強(qiáng)的激酶 活性。
[0383] 實(shí)施例84:化合物9,13,14, 21，29, 52, 53和55大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)
[0384] 實(shí)驗(yàn)方法：
[0385] 健康SD大鼠24只，雄性，隨機(jī)分成8組（每組3只），給藥劑量均為5mg/kg。
[0386] 試驗(yàn)前禁食12h，自由飲水。給藥容積均為10mL/kg，以5 %DMS0+95 % (0. 5 % MethylCellulose)配制。采血時(shí)間點(diǎn)及樣品處理：給予受試物前（Ohr)和給予受試物后 1511^11、301^11、111、211、411、611、811和2411每只動(dòng)物每次通過眼眶取0.151^血液40了41(2抗凝， 置肝素化試管中，5000rpm離心lOmin，分離血漿，于-80°C冰箱中冷凍。以液相色譜-串聯(lián) 質(zhì)譜法測(cè)定血漿中化合物的濃度，根據(jù)血漿濃度-時(shí)間曲線求出相應(yīng)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
[0387] 表16化合物9、13、14、21、29、52、53和55大鼠灌胃給予51^/1^的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)
[0388]
[0389] 由上表數(shù)據(jù)可以看出，上述化合物均具有的較好藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，尤其是化合物 13、21和53,其藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)更加優(yōu)異，這表明本發(fā)明化合物有很好的成藥性，很可能發(fā) 展成為有效的腫瘤治療藥物。
[0390] 實(shí)施例85:化合物對(duì)hERG鉀離子通道抑制作用試驗(yàn)
[0391] 穩(wěn)定表達(dá)hERG的HEK-293細(xì)胞（法國(guó)CreacellTM)，在室溫下，用全細(xì)胞膜片鉗技 術(shù)記錄hERG鉀通道電流。尖端電阻為1-4ΜΩ左右的玻璃微電極連接至Axon200A膜片鉗 放大器。鉗制電壓和數(shù)據(jù)記錄由clampex9.2軟件經(jīng)AxonDigiData1322AA/D轉(zhuǎn)換器通 過電腦控制，細(xì)胞鉗制在_80mV，誘發(fā)hERG鉀電流（IhEJ的步階電壓從-80mV給予一個(gè)2s 的去極化電壓到+20mV，再?gòu)?fù)極化到-40mV，持續(xù)4s后回到-80mV。分別在給藥前后給予此 電壓步階誘發(fā)出hERG鉀電流。
[0392] 數(shù)據(jù)分析處理米用PatchMaster,GraphPadPrism5和Excel軟件。不同化合物 濃度對(duì)hERG鉀電流（_50mV時(shí)誘發(fā)的hERG尾電流峰值）的抑制程度用以下公式計(jì)算：
[0393] Fractional block% = [1- (I/I0)]X100%
[0394] 其中，F(xiàn)ractional block代表化合物對(duì)hERG鉀電流的抑制百分率，I和Ιο分別表 示在加藥后和加藥前hERG鉀電流的幅度。
[0395] 化合物的IC5。使用以下方程進(jìn)行擬合計(jì)算得出：
[0396]I/Io=l/{l+([C]/IC50)'n}
[0397] 其中，Io和I分別表示加藥前和加藥后hERG鉀電流的幅度。[C]為化合物的濃 度，η為Hill系數(shù)。
[0398] 表17化合物13、14和21對(duì)hERG的抑制
[0399]
[0400] 表17表明，化合物13、14和21對(duì)hERG鉀電流的抑制IC5。均大于50μΜ，表明本 發(fā)明化合物對(duì)心血管系統(tǒng)具有很好的安全性。
[0401] 實(shí)施例86:化合物對(duì)對(duì)SK-BR-III細(xì)胞荷瘤裸鼠模型的抗腫瘤效果
[0402] 細(xì)胞和動(dòng)物：31(-81?-111細(xì)胞購(gòu)自八1〇：，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，青霉素和鏈 霉素（各l〇〇U/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基中；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone。6-8周裸小 鼠雌鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，自由飲食。
[0403] SK-BR-III荷瘤裸鼠模型的建立：將5X 106細(xì)胞與Matrigel (1:1)混合接種于 裸小鼠皮下。給藥后每周2次用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)和寬一次，按照公式V=(長(zhǎng)*寬* 寬）/2計(jì)算腫瘤體積。
[0404] 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：采用SK-BR-III荷瘤裸小鼠模型，每組8只，設(shè)陰性對(duì)照組，拉帕替 尼組，化合物13組和化合物21組，待腫瘤生長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，開始灌胃給藥，給藥劑量 為100mg/kg/day(藥物采用0. 5 %CMC-Na懸?。刻旖o藥一次，陰性對(duì)照組給0. 5 % CMC-Na(羧甲基纖維素鈉），給藥周期28天，每周測(cè)量腫瘤體積2次。
[0405] 數(shù)據(jù)分析：所有結(jié)果均采用Origin8.0軟件分析，數(shù)值采用Means土SEM表示。
[0406]結(jié)果：
[0407] 根據(jù)測(cè)量結(jié)果計(jì)算出相對(duì)腫瘤體積（relativetumorvolume,RTV)，RTV=Vt/V。。 其中V。為分籠給藥時(shí)（即d。）測(cè)量所得腫瘤體積，Vt為每一次測(cè)量時(shí)的腫瘤體積。
[0408] 抗腫瘤活性評(píng)價(jià)指標(biāo)為相對(duì)腫瘤增殖率T/C(% )
[0409]T/C%=TRTV/CRTVX100%
[0410]TRTV:治療組RTV;CRTV:陰性對(duì)照組RTV。
[0411]表18化合物13和化合物21的抗腫瘤結(jié)果
[0412]
[0413] 表18表明，化合物13和21和空白對(duì)照相比，能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。其中，化合物 21對(duì)抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果比對(duì)照樣拉帕替尼強(qiáng)1. 45倍，而化合物13的抑制腫瘤生長(zhǎng)的效 果比對(duì)照拉帕替尼強(qiáng)1.96倍。
[0414] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種喹唑啉類酪氨酸激酶抑制劑，其特征在于：其是通式（I)所示的化合物、其各種 光學(xué)異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽；通式⑴中，η單獨(dú)為1或2; L選自CO、S02、NHCO或化學(xué)鍵； X選自〇、S或N-R3,其中，R3為氫或C14烷基； Y和Z均選自C或N，且Y和Z相同或不同； R1選自如下基團(tuán)：其中，R4、R5 和 R6 分別獨(dú)立選自 H、F、Cl、Br、I、CH3、0CH3、N02、CN、NH 2、S02NH2、CF3 或 〇cf3； R7選自下列（1)~（3)中的任意一種： (1) 氧、Q 6烷基或C3 7環(huán)烷基，其中，所述烷基或環(huán)烷基是未取代的或被一至二個(gè)鹵素 取代； (2) 芳基亞甲基或雜芳基亞甲基，其是未取代的或被一至三個(gè)獨(dú)立選自下組的基團(tuán)所 取代： 鹵素、OH、NH2、N02、CH3、C2H 5、（CH3) 2CH、t-Bu、CN、CF3、0CH3 或 0CF3 ; (3) 芳基或雜芳基，其是未取代的或被一至三個(gè)獨(dú)立選自下組的基團(tuán)所取代： 鹵素、OH、NH2、N02、CH3、C2H 5、（CH3) 2CH、t-Bu、CN、CF3、0CH3 或 0CF3 ; R2選自氧原子、G 6烷基、C2 6烯基或C3 7環(huán)狀烷基，其中，所述烷基是未取代的或被一 至三個(gè)獨(dú)立選自下組的基團(tuán)所取代： 鹵素、OH、CN、0、S、SO、S02、CO、RSR9N、R SR9NC (0) -、RSC (0) N (R9) -、RsR9NS (02)-或 RsS (02) N(R9)-;其中，所述Rs和R9分別獨(dú)立選自氫原子、Q 6烷基或者能進(jìn)一步形成5-6元環(huán)，該 5-6元環(huán)中還能含有一個(gè)或多個(gè)氮、氧或硫原子。2. 如權(quán)利要求1所述的喹唑啉類酪氨酸激酶抑制劑，其特征在于：所述藥學(xué)上可接受 的鹽包括：通式（I)所示的化合物與酸形成的鹽； 其中，酸包括：無機(jī)酸、有機(jī)酸或酸性氨基酸； 所述無機(jī)酸包括：鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、硫酸、硝酸或磷酸； 有機(jī)酸包括：甲酸、乙酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、 蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、苦味酸、甲磺酸、對(duì)甲基苯磺酸、乙磺酸或苯磺酸； 酸性氨基酸包括：天冬氨酸或谷氨酸。3. 如權(quán)利要求1所述的喹唑啉類酪氨酸激酶抑制劑，其特征在于：所述喹唑啉類酪氨 '、，·、:Y Λs .、 > % \Λ ?t 、： :、 >\ 、 > .、4. 一種如權(quán)利要求1所述的喹唑啉類酪氨酸激酶抑制劑的制備方法，其特征在于，其 流程包括： (一）流程I :中間體I-4a-I-4u的制備式（I-2a-I-2u)、（I-3a-I-3u)和（I-4a-I-4u)中，R 為如下基團(tuán)中的一種：.、 (1-1)化合物1-1在極性溶劑中，并在中性或堿性條件下，于-20°c~100°C或回流溫度 下，與胺進(jìn)行反應(yīng)1~12小時(shí)，得到式中間體I-2a-I-2u ; 其中，極性溶劑選自甲醇、乙醇、異丙醇、叔丁醇、乙腈或DMF ; 堿性條件中的堿選自無機(jī)堿、有機(jī)堿中的一種或多種，其中，所述無機(jī)堿包括：碳酸氫 鈉、碳酸鈉或碳酸鉀；有機(jī)堿包括：1，8-二氮雜環(huán)[5, 4, 0] 十一烯-7、三乙胺、二異丙基乙 基胺或N-甲基嗎啉； 胺選自：(1-2)中間體I-2a-I-2u在極性非質(zhì)子性溶劑中，在20~120°C下，并在惰性氣體 和堿存在下，以鈀催化劑催化雙聯(lián)硼酸頻哪醇酯，經(jīng)偶聯(lián)反應(yīng)1~48小時(shí)，得到中間體 I-3a-I-3u;其中，極性非質(zhì)子性溶劑選自甲苯、1，4-二氧六環(huán)、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰 胺、N-甲基吡咯烷酮或二甲亞砜；堿選自碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸銫、乙酸鉀或乙酸鈉；鈀催化 劑選自[1，1' -雙（二苯基膦）二茂鐵]二氯化鈀、三（二亞芐基丙酮）二鈀、四（三苯基 膦）鈀、醋酸鈀或鈀碳； (1-3)在溶劑中，在20~150°C、惰性氣體和堿下，以鈀催化劑催化中間體I-3a-I-3u 和叔丁基4-(5-溴噻唑-2-基）哌嗪-1-羧酸酯，經(jīng)偶聯(lián)反應(yīng)1~48