一種促進(jìn)微生物產(chǎn)聚乙烯醇降解酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種促進(jìn)微生物產(chǎn)聚乙烯醇降解酶的方法，屬于紡織技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]聚乙烯醇(PVA)是一種人工合成的水溶性高分子聚合物。因其具有pH穩(wěn)定、混溶性好及乳化能力強(qiáng)等優(yōu)良特性，同時(shí)對(duì)天然纖維和一般的合成纖維具有較好的粘附性、成膜性和耐磨性，是目前滌棉織物經(jīng)紗上漿中的主要漿料。采用PVA上漿的織物，在紡織前處理過(guò)程中必須經(jīng)過(guò)退漿處理才能增加其吸水性。傳統(tǒng)的退漿方法是使用70?90°C的熱水對(duì)棉織物進(jìn)行洗脫，洗脫下的PVA隨廢水排出。這樣不僅水耗、能耗大，而且容易對(duì)棉纖維造成損傷;更嚴(yán)重的是由于PVA化學(xué)耗氧量大，可生化性較差，給水體造成了嚴(yán)重的污染。
[0003]隨著人們對(duì)紡織工業(yè)清潔生產(chǎn)的關(guān)注，在退漿工藝中實(shí)現(xiàn)對(duì)PVA的生物降解受到研究者么的重視。PVA降解酶退漿條件溫和，不僅能大大減少PVA廢水的排放，而且能夠避免傳統(tǒng)退漿過(guò)程中高溫和氧化造成的棉纖維的損傷。
[0004]實(shí)現(xiàn)對(duì)PVA生物降解的關(guān)鍵在于能夠篩選到能夠高效降解PVA的微生物，但PVA降解菌在種類(lèi)和分布上不多，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，酶活低，提取不易，這些都成為了阻礙PVA降解酶在實(shí)際生產(chǎn)上應(yīng)用的重要因素。
[0005]目前產(chǎn)聚乙烯醇降解酶多以高聚合度聚乙烯醇、葡萄糖為碳源和誘導(dǎo)物，且多以單菌為主。而且采用高聚合度聚乙烯醇作為誘導(dǎo)劑時(shí)，存在高聚合度聚乙烯醇極易絮凝、會(huì)影響微生物對(duì)聚乙烯醇的降解、進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)酶量降低的缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種提高微生物產(chǎn)聚乙烯醇降解酶的方法，是以小分子多元醇作為誘導(dǎo)劑，促使其產(chǎn)生胞內(nèi)酶。
[0007]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述小分子多元醇包括以下任意一種或者多種混合:丙二醇、1，3-丁二醇、1，2，4-丁二醇。
[0008]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述小分子多元醇是4?6g/L的1，3_丁二醇。
[0009]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述誘導(dǎo)劑添加量為2?6g/L。
[0010]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述微生物為混合菌群，主要包括以下幾種菌屬:Stenotrophomonas sp.^Pseudomonas sp.、Sphingopyxis sp.^Ochrobactrum sp.、Shinella sp.、Castellaniella sp.、Microbacterium sp.0
[0011]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述混合菌群，來(lái)自受PVA污染的紡織廠曝氣池中的污泥。
[0012]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述混合菌群中的Stenotrophomonas sp.可以是以下任意一種:CGMCC No 6393, CGMCC No 9046 ； Pseudomonas sp.可以是以下任意一種:CGMCC Nol0601，CGMCC No 6446 ； Sphingopyxis sp.可以是以下任意一種:CGMCC No10900,CGMCC No 9098 ；Ochrobactrum sp.可以是以下任意一種:CGMCC No 10564,CGMCCNo 10477；Shinella sp.可以是以下任意一種:CGMCC No 6838；Castellanie 11a sp.可以是以下任意一種:CGMCC No 10715,CGMCC No 10720；Microbacterium sp.可以是以下任意一種:CGMCC No6777，CGMCC No 10251。
[0013]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述混合菌群中還可以含有Bosea sp.、Delftiasp.、Phenylobacterium sp.、Devosia sp.、Rhizobium sp.、Pseudoxanthobacter sp.、Leucobacter sp.等菌種，這些菌種的存在不會(huì)對(duì)所產(chǎn)粗酶液在PVA降解中產(chǎn)生不利影響。
[0014]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法:以含有小分子多元醇作為誘導(dǎo)劑的肉湯培養(yǎng)基對(duì)混合菌群進(jìn)行培養(yǎng)，促使其產(chǎn)生胞內(nèi)酶。
[0015]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法，是將混合菌群(按菌質(zhì)量比，Stenotrophomonas sp:Pseudomonas sp.:Sphingopyxis sp.:Ochrobactrum sp.:Shinella sp.:Castellaniella sp:Microbacterium sp.約為5817:1568:24:39:36:7:31;或者還含有少量其他菌株，M icrobacter i um sp.、Bosea sp:Delftia sp.、Phenylobacterium sp.、Devosia sp:Rhizobium sp、Pseudoxanthobacter sp.、Leucobacter sp.)于肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)制備種子液，然后接種于含有4?6g/L的小分子多元醇的肉湯培養(yǎng)基中，于30°C發(fā)酵3天，然后收集細(xì)胞、破壁，離心取上清液為粗酶液。
[0016]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法還包括對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)酶后的細(xì)胞進(jìn)行破壁處理，破壁完成后離心取上清即為所產(chǎn)胞內(nèi)酶的粗酶液。該粗酶液中含有PVA氧化酶(一種仲醇氧化酶)、PVA水解酶(一種β-雙酮水解酶)。
[0017]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述肉湯培養(yǎng)基，含有蛋白胨10.0?15.0g/L、牛肉粉3.0?5.0g/L、2?6g/L的小分子多元醇、氯化鈉5.0?6.0g/L,pH 7.2±0.2。
[0018]本發(fā)明的有益效果:
[0019](1)采用添加小分子多元醇作為誘導(dǎo)劑，顯著提高了混合菌群所產(chǎn)粗酶液的PVA降解酶酶活，有效降低了在降解聚乙烯醇漿料時(shí)所需要的粗酶液用量，節(jié)約了制備粗酶液的培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)成本，適合工業(yè)上應(yīng)用。
[0020](2)對(duì)于產(chǎn)聚乙烯醇降解酶的微生物培養(yǎng)，普遍的方法是以聚合度1700左右的聚乙烯醇為碳源和誘導(dǎo)物，但是高聚合度的聚乙烯醇在培養(yǎng)基中降解不完全，酶提取過(guò)程中會(huì)和酶蛋白一起沉淀產(chǎn)生不能溶解的絮凝物，導(dǎo)致得不到PVA降解酶產(chǎn)品。本發(fā)明以肉湯培養(yǎng)基加小分子多元醇作為誘導(dǎo)物對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)，既避免了絮凝的出現(xiàn)，又解決了 PVA降解酶分離困難的問(wèn)題。
[0021 ] (3)粗酶液中含有PVA氧化酶(仲醇氧化酶)、PVA水解酶(β-雙酮水解酶)等多種協(xié)同降解PVA的酶系，該酶液可用來(lái)有效降解高聚合度的聚乙烯醇，獲得的粗酶液對(duì)PVA1799的降解酶酶活達(dá)1.985U/mL。葡萄糖誘導(dǎo)不出酶。
【具體實(shí)施方式】
[0022]酶活測(cè)定方法:
[0023]以lg/L的PVA1799為底物進(jìn)行酶活測(cè)試。
[0024]酶活測(cè)定:在25mL比色管中加入lmL粗酶液和lmL lg/L的PVA溶液，將此混合體系于30°C的振蕩水浴鍋中反應(yīng)6h，分別測(cè)定反應(yīng)前后混合液所對(duì)應(yīng)的PVA含量的吸光度。每分鐘吸光度下降0.001定義為一個(gè)酶活單位。
[0025]超聲細(xì)胞破碎:
[0026]培養(yǎng)完成的菌體離心(lOOOOr/min)，去除上清，用去離子水洗滌沉淀，充分振蕩后離心(10000r/min)，去除上清，重復(fù)以上操作多次，將沉淀物懸浮于磷酸鹽緩沖溶液(pH7.2，2011111101/1)，質(zhì)量比約為1:5，用超聲破碎(4°(3，400￥，工作38，間隙28，201^11)并離心收集上清液，即為所產(chǎn)的胞內(nèi)酶粗酶液。
[0027]實(shí)施例1:混合菌群產(chǎn)粗酶液(不誘導(dǎo))
[0028]將混合菌群于肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)制備種子液，然后再接種于肉湯培養(yǎng)基中，于30°C發(fā)酵3天;然后收集細(xì)胞、破壁，離心取上清液為粗酶液。
[0029]所述肉湯培養(yǎng)基，含有蛋白胨10.0?15.0g/L、牛肉粉3.0?5.0g/L、氯化鈉5.0?6.0g/L,pH 7.2±0.2。
[0030]收集細(xì)胞破壁后測(cè)定酶活，未檢出PVA降解酶活性。
[0031]實(shí)施例2:添加1，3-丁二醇誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)混合菌群產(chǎn)酶
[0032]將混合菌群于肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)制備種子液，然后再接種于含有4?6g/L的1，3_丁二醇誘導(dǎo)的肉湯培養(yǎng)基中，于30°C發(fā)酵3天;然后收集細(xì)胞、破壁，離心取上清液為粗酶液。
[0033]所述肉湯培養(yǎng)基，含有蛋白胨10.0g/L、牛肉粉5.0g/L、氯化鈉5.0g/L，1，3_ 丁二醇4-6g/L，pH 7.2±0.2。
[0034]測(cè)定粗酶液中酶活，結(jié)果顯示可達(dá)1.985U/mL。
[0035]實(shí)施例3:添加丙二醇誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)混合菌群產(chǎn)酶
[0036]將混合菌群于肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)制備種子液，然后再接種于含有2?5g/L的丙二醇的肉湯培養(yǎng)基中，于30°C發(fā)酵3天，然后收集細(xì)胞、破壁，離心取上清液為粗酶液。
[0037]所述肉湯培養(yǎng)基，含有蛋白胨15.(^/1、牛肉粉3.(^/1、氯化鈉6.(^/1，丙二醇2-5g/L，pH 7.2 ± 0.2。測(cè)定粗酶液中酶活，結(jié)果顯示可達(dá)1.32U/mL。
[0038]實(shí)施例4:添加1，2，4_ 丁三醇誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)混合菌群產(chǎn)酶
[0039]將混合菌群于肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)制備種子液，然后再接種于含有2_4g/L的1，2，4_丁三醇的肉湯培養(yǎng)基中，于30°C發(fā)酵3天;然后收集細(xì)胞、破壁，離心取上清液為粗酶液。
[0040]所述肉湯培養(yǎng)基，含有蛋白胨12.(^/1、牛肉粉3.0?5.(^/1、氯化鈉5.0?6.(^/1，1,2,4-丁三醇2-4g/L，pH 7.2±0.2。測(cè)定粗酶液中酶活，結(jié)果顯示可達(dá)1.364U/mL。
[0041 ] 對(duì)照例:
[0042](1)將實(shí)施例2中的1，3-丁二醇換成3g/L的PVA1799，也可以誘導(dǎo)產(chǎn)酶，但酶活僅1.02U/mL，而且高聚合度的聚乙烯醇在培養(yǎng)基中降解不完全，酶提取過(guò)程中會(huì)和酶蛋白一起沉淀產(chǎn)生不能溶解的絮凝物，導(dǎo)致得不到PVA降解酶產(chǎn)品。
[0043](2)使用葡萄糖代替實(shí)施例2中的1，3_ 丁二醇，得到的發(fā)酵液中沒(méi)有PVA降解酶酶活。
[0044]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種提高微生物產(chǎn)聚乙烯醇降解酶的方法，其特征在于，所述方法是以小分子多元醇作為誘導(dǎo)劑，促使其產(chǎn)生胞內(nèi)酶。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述小分子多元醇包括以下任意一種或者多種混合:丙二醇、1，3-丁二醇、1，2，4-丁三醇。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)劑添加量為4?6g/L。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物為混合菌群，主要包括以下幾種菌屬:Stenotrophomonas sp.；Pseudomonas sp.； Sphingopyxis sp.；Ochrobactrumsp.；Shinella sp.；Castellaniella sp.；Microbacterium sp.。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是以加有小分子多元醇作為誘導(dǎo)劑的肉湯培養(yǎng)基對(duì)混合菌群進(jìn)行培養(yǎng)，促使其產(chǎn)生膜上和胞內(nèi)酶。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法:是將混合菌群于肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)制備種子液，然后再接種于含有4?6g/L的小分子多元醇的肉湯培養(yǎng)基中，于30°C發(fā)酵3天。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)酶后的細(xì)胞進(jìn)行破壁處理，破壁完成后離心取上清即為所產(chǎn)的粗酶液。8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述肉湯培養(yǎng)基，含有蛋白胨10.0?15.0g/L、牛肉粉3.0?5.0g/L、氯化鈉5.0?6.0g/L、小分子多元醇4_6g/L，pH 7.2±0.2。9.按權(quán)利要求1-7任一所述方法得到的聚乙烯醇降解酶。10.權(quán)利要求9所述聚乙烯醇降解酶在紡織領(lǐng)域的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種促進(jìn)微生物產(chǎn)聚乙烯醇降解酶的方法，屬于紡織技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)采用添加小分子多元醇作為誘導(dǎo)劑，顯著提高了混合菌群所產(chǎn)粗酶液的PVA降解酶酶活，有效降低了在降解聚乙烯醇漿料時(shí)所需要的粗酶液用量，節(jié)約了制備粗酶液的培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)成本，適合工業(yè)上應(yīng)用。本發(fā)明方法避免了高聚合度的聚乙烯醇誘導(dǎo)劑導(dǎo)致的絮凝以及PVA降解酶分離困難的問(wèn)題。
【IPC分類(lèi)】C12N9/14, D06L1/14, C12N9/04, D06M101/06, D06M16/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105462940
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510961865
【發(fā)明人】張穎, 王強(qiáng), 范雪榮, 張潔, 王平, 袁久剛, 余圓圓, 崔莉
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年4月6日
【申請(qǐng)日】2015年12月18日