ABpremix，10X buffer和ddH2〇;
[0057] 所述ABpremix為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品TfiqManKFastAdvancedMaster Mix;所述10Xbuffer為10倍濃度的緩沖液，緩沖液中含有Mg2+。
[0058] 本發(fā)明還提供了以上所述用于檢測人類PIK3CA基因5種突變的試劑盒的使用方 法，首先提取待檢樣品的基因組DNA，分別加入到各檢測反應(yīng)體系和質(zhì)控反應(yīng)體系，進(jìn)行熒 光定量PCR反應(yīng);另外設(shè)置非模板對照和各突變相應(yīng)的陽性對照，與待檢樣品的基因組DNA 進(jìn)行同樣的操作;根據(jù)Ct值分析檢測結(jié)果：
[0059]首先需要滿足J0E信號Ct值< 25,非模板對照的FAM信號不起線，陽性對照的FAM信 號Ct值< 20; 9〈Ct廠< 18;然后按照ACt=Ct_-Ct廠判定：
[0060] 含有PIK3CA:E542K(c.l624G>A)突變的引物和探針的檢測反應(yīng)體系與質(zhì)控反應(yīng)體 系中FAM信號Ct值差值A(chǔ)Ct大于9.6為野生型，小于等于9.6為E542K(c. 1624G>A)突變型；
[0061] 含有PIK3CA:E545K(c.l633G>A)突變的引物和探針的檢測反應(yīng)體系與質(zhì)控反應(yīng)體 系中FAM信號Ct值差值A(chǔ)Ct大于9.1為野生型，小于等于9.1為E545K(c. 1633G>A)突變型； [0062] 含有PIK3CA:E54ro(c.l635G>T)突變的引物和探針的檢測反應(yīng)體系與質(zhì)控反應(yīng)體 系中FAM信號Ct值差值A(chǔ)Ct大于10.8為野生型，小于等于10.8為E545D(c.1635G>T)突變型； [0063] 含有PIK3CA:H1047R(c.3140A>G)突變的引物和探針的檢測反應(yīng)體系與質(zhì)控反應(yīng) 體系中FAM信號Ct值差值A(chǔ)Ct大于10.2為野生型，小于等于10.2為H1047R(c.3140A>G)突變 型；
[0064] 含有PIK3CA:H1047L(c.3140A>T)突變的引物和探針的檢測反應(yīng)體系與質(zhì)控反應(yīng) 體系中FAM信號Ct值差值A(chǔ)Ct大于11.2為野生型，小于等于11.2為H1047L(c. 3140ΑΧΓ)突變 型；
[0065]所述Ct_a為待檢樣品的基因組DNA在上述5種檢測反應(yīng)體系中進(jìn)行熒光定量PCR獲 得的Ct值，所述為待檢樣品的基因組DNA在質(zhì)控反應(yīng)體系中進(jìn)行熒光定量PCR獲得的Ct 值。
[0066] 優(yōu)選地，以上所述的用于檢測人類PIK3CA基因5種突變的試劑盒的使用方法，熒光 定量PCR反應(yīng)的條件為：
[0067] 95〇C10min；
[0068] 92°C15sec，58°Clmin，共 15 個循環(huán)；
[0069] 92°C15sec，60°Clmin，共 30 個循環(huán);在 60°C時收集信號。
[0070]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0071] ⑴本發(fā)明采用了特異性突變引物和探針阻斷技術(shù)，可以檢測人類PIK3CA基因5種 突變類型。其中，特異性突變引物與突變序列匹配度高于相應(yīng)的野生型序列;在此基礎(chǔ)上， 阻斷探針與野生型序列特異性結(jié)合，有效抑制了野生型的非特異性擴(kuò)增，進(jìn)一步提高體系 的特異性水平，從而實(shí)現(xiàn)了在高野生型基因背景下對低含量突變序列的檢出。
[0072] (2)本發(fā)明建立了實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系實(shí)現(xiàn)對PIK3CA基因突變的快速檢測； 且操作簡單，結(jié)果易讀。其J0E信號Ct值反映了實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的相關(guān)信息(PCR反應(yīng)是否正常，操作過程是否準(zhǔn)確）。
[0073] (3)本方法靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)50拷貝突變基因的穩(wěn)定檢出；特異性好，20ng野生型 基因組DNA無非特異性擴(kuò)增，檢測能力高達(dá)1 %。
【附圖說明】
[0074]圖1為實(shí)施例1中內(nèi)控(1C)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0075]圖2為實(shí)施例1中非模板對照(NTC)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0076]圖3為實(shí)施例1中陽性對照(STD)樣本結(jié)果；
[0077]圖4為實(shí)施例1中靈敏度(H1047L檢測孔)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0078]圖5為實(shí)施例1中精密度(E542K檢測孔)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0079]圖6為實(shí)施例2中陰性(野生型)樣本實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0080]圖7為實(shí)施例2中陽性(E54?突變)樣本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0081]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的 理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對本發(fā)明的限定。
[0082] 實(shí)施例1
[0083] 1、用于檢測人類PIK3CA基因7種突變的檢測試劑盒的引物和探針：
[0084]根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的PIK3CA基因（NCBIReferenceSequence:ΝΜ_006218· 2)野 生型序列，以10號外顯子E542K(P頂1)、E545K(P頂2)和E545D(P頂3)突變位點(diǎn)，21號外顯子 H1047R(PIM4)和H1047L(PIM5)突變位點(diǎn)為參考，設(shè)計(jì)特異性Ε542Κ突變引物和探針（見表 2)、特異性E545K突變引物和探針（見表3)、特異性E545D突變引物和探針（見表4)、特異性H1047R突變引物和探針(見表5)和特異性H1047L突變引物和探針(見表6)。以基因工程構(gòu)建 的突變質(zhì)粒和野生型質(zhì)粒為模板，建立了實(shí)時熒光PCR突變(Mutation)檢測體系，實(shí)現(xiàn)對 PIK3CA基因突變的高靈敏度和高特異性檢測。
[0085] (1)用于人類PIK3CA基因Ε542Κ(ΡΠ11)突變檢測的特異性引物和探針序列：
[0086]表2用于檢測Ε542Κ位點(diǎn)的特異性引物和探針組合

[0088] 其中，PIM1-F為突變上游ARMS引物，與E542K(c.l624G>A)位點(diǎn)突變序列特異性結(jié) 合，選擇性擴(kuò)增突變序列;PIW1-R為突變下游引物，與PIK3CA基因保守序列結(jié)合;PIW1-P為5'端標(biāo)記有FAM信號3'端標(biāo)記MGB的檢測探針，能與擴(kuò)增片段結(jié)合;PIW1-B1為5'端雙脫氧修 飾3'端MGB標(biāo)記的阻斷探針，能與E542K位點(diǎn)野生型序列特異性結(jié)合，抑制野生型非特異擴(kuò) 增。
[0089] (2)用于人類PIK3CA基因E545K(P頂2)突變檢測的特異性引物和探針序列：
[0090]表3用于檢測E545K位點(diǎn)的特異性引物和探針組合[0091]
[0092] 其中，PIM2-F為突變上游ARMS引物，與E545K(c.l633G>A)位點(diǎn)突變序列特異性結(jié) 合，選擇性擴(kuò)增突變序列;PIW1-R為突變下游引物，與PIK3CA基因保守序列結(jié)合;PIW1-P為5'端標(biāo)記有FAM信號3'端標(biāo)記MGB的檢測探針，能與擴(kuò)增片段結(jié)合;PIW1-B2為5'端雙脫氧修 飾3'端MGB標(biāo)記的阻斷探針，能與E545K位點(diǎn)野生型序列特異性結(jié)合，抑制野生型非特異擴(kuò) 增。
[0093] (3)用于人類PIK3CA基因E545D(PB13)突變檢測的特異性引物和探針序列：
[0094]表4用于檢測E54?位點(diǎn)的特異性引物和探針組合
[0096] 其中，PIM3-F為突變上游ARMS引物，與E545D(c.l635G>T)位點(diǎn)突變序列特異性結(jié) 合，選擇性擴(kuò)增突變序列;PIW1-R為突變下游引物，與PIK3CA基因保守序列結(jié)合;PIW1-P為5'端標(biāo)記有FAM信號3'端標(biāo)記MGB的檢測探針，能與擴(kuò)增片段結(jié)合;PIW1-B2為5'端雙脫氧修 飾3'端MGB標(biāo)記的阻斷探針，能與E545D位點(diǎn)野生型序列特異性結(jié)合，抑制野生型非特異擴(kuò) 增。
[0097] (4)用于人類PIK3CA基因H1047R(PIM4)突變檢測的特異性引物和探針序列：
[0098]表5用于檢測H1047R位點(diǎn)的特異性引物和探針組合

[0100] 其中，PIW2-F為突變上游引物，與PIK3CA基因保守序列結(jié)合;PM4-R為突變下游 ARMS引物，與H1047R(c.3140A>G)位點(diǎn)突變序列特異性結(jié)合，選擇性擴(kuò)增突變序列；PIW2-P 為5 '端標(biāo)記有FAM信號3 '端標(biāo)記MGB的檢測探針，能與擴(kuò)增片段結(jié)合;PIW2-B為5 '端雙脫氧 修飾3 '端MGB標(biāo)記的阻斷探針，能與H1047R位點(diǎn)野生型序列特異性結(jié)合，抑制野生型非特異 擴(kuò)增。
[0101] (5)用于人類PIK3CA基因H1047L(PIM5)突變檢測的特異性引物和探針序列：
[0102]表6用于檢測H1047L位點(diǎn)的特異性引物和探針組合
[0104] 其中，PIW2-F為突變上游引物，與PIK3CA基因保守序列結(jié)合;PM5-R為突變下游 ARMS引物，與H1047L(c.3140A>T)位點(diǎn)突變序列特異性結(jié)合，選擇性擴(kuò)增突變序列；PIW2-P 為5 '端標(biāo)記有FAM信號3 '端標(biāo)記MGB的檢測探針，能與擴(kuò)增片段結(jié)合;PIW2-B為5 '端雙脫氧 修飾3 '端MGB標(biāo)記的阻斷探針，能與H1047L位點(diǎn)野生型序列特異性結(jié)合，抑制野生型非特異 擴(kuò)增。
[0105] 2、質(zhì)控引物(外控和內(nèi)控）引物和探針
[0106] (1)用于人類PIK3CA基因突變檢測樣本質(zhì)控的外控引物和探針序列：
[0107]根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的PIK3CA基因（NCBIReferenceSequence:NM_006218.2)21 號外顯子保守序列，設(shè)計(jì)外控引物和探針(見表7)。以基因工程構(gòu)建的外控質(zhì)粒為模板，建 立了實(shí)時熒光PCR外控(ExternalControl)檢測體系，對待測樣本基因組DNA的質(zhì)量和上樣 量進(jìn)行質(zhì)控。
[0108]表7用于樣本質(zhì)控的外控引物和探針組合
[0110] 其中，PIR-F和PIR-R為外控上下游引物，擴(kuò)增PIK3CA基因保守序列（>gi 224589815:178951951-178952350段堿基序列）；PIR-P為5'端標(biāo)記有FAM信號3'端標(biāo)記MGB的檢測探針，能與擴(kuò)增片段結(jié)合。
[0111] (2)用于實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系內(nèi)部質(zhì)控的內(nèi)控引物和探針序列：
[0112] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的matK基因（NCBIReferenceSequence:NC_001666.2)保守 序列(non-humanDNA)，設(shè)計(jì)內(nèi)控引物和探針(見表8)。以基因工程構(gòu)建的內(nèi)控質(zhì)粒為模板， 建立了實(shí)時熒光PCR內(nèi)控(I