靶向抗生素敏感性測(cè)試的方法
【專利說(shuō)明】靶向抗生素敏感性測(cè)試的方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求標(biāo)題為"祀向抗生素敏感性測(cè)試的方法"并于2013年7月3日提交的美 國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/842827號(hào)的優(yōu)先權(quán)，通過(guò)引用將其整體內(nèi)容并入本文。
[0003] 背景
[0004] 本公開涉及確定樣品中微生物細(xì)胞的抗生素敏感性的方法。本公開還涉及測(cè)量微 生物細(xì)胞中的RNA的方法。
[0005] 耐藥性病原體的出現(xiàn)是一種全球性醫(yī)療危機(jī)，其迫使醫(yī)生使用更昂貴、更有效，有 時(shí)是毒性更強(qiáng)的抗生素來(lái)治療常見的傳染病。不幸的是，新抗生素的藥物開發(fā)已迅速減緩， 從而導(dǎo)致缺乏新的藥劑來(lái)治療某些具有多重耐藥性的生物體。主流的臨床微生物學(xué)是緩慢 且昂貴的，這是因?yàn)槠淙砸蕾囉诩?xì)菌在瓊脂板上生長(zhǎng)形成菌落，這一耗時(shí)且勞動(dòng)密集型方 法需要熟練的技術(shù)人員，而這些技術(shù)人員正日益供不應(yīng)求。樣本采集后2-3天通常無(wú)法獲得 抗生素敏感性數(shù)據(jù)，這已太晚而切實(shí)影響了抗生素的選擇。迫切需要新的快速臨床微生物 學(xué)方法，其能夠直接對(duì)臨床標(biāo)本中所發(fā)現(xiàn)的病原體進(jìn)行鑒定并進(jìn)行抗生素敏感性測(cè)試 (AST)，這為臨床醫(yī)生提供了實(shí)時(shí)信息來(lái)應(yīng)對(duì)傳染病。
[0006] 在沒(méi)有迅速的微生物學(xué)診斷時(shí)，臨床醫(yī)生通常啟用"經(jīng)驗(yàn)性"抗生素治療，即基于 潛在的生物體的知識(shí)及其抗生素耐受模式來(lái)選擇抗生素。用于菌血癥的經(jīng)驗(yàn)性抗生素通常 是廣譜抗生素以治療多種可能的細(xì)菌病原體。廣譜抗生素的過(guò)度使用通過(guò)向患者的微生物 群施加選擇性壓力，并促進(jìn)耐受生物體的定植而導(dǎo)致抗生素耐受性的出現(xiàn)。例如，將共同使 用萬(wàn)古霉素(vancomycin)和哌拉西林-他佐巴坦(piperaci 11 in-tazobactam)作為經(jīng)驗(yàn)療 法已直接導(dǎo)致廣泛出現(xiàn)耐受萬(wàn)古霉素的腸球菌(VRE)以及產(chǎn)生廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)的大 腸桿菌和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)生物體。相比之下，真菌血癥并不經(jīng)常被 懷疑或被治療，直至接受抗菌劑的患者沒(méi)有反應(yīng)或經(jīng)歷臨床惡化。有證據(jù)表明，使用早期且 有效的抗生素療法會(huì)改善患者的療效并縮短住院時(shí)間。因此，快速鑒定致病生物體并施用 適當(dāng)?shù)目股丿煼ǖ哪芰?yīng)導(dǎo)致改善患者的療效，并降低醫(yī)療系統(tǒng)的整體成本。
[0007] 概述
[0008] 提供了基于檢測(cè)來(lái)自暴露于抗生素之后的微生物細(xì)胞中的RNA(如核糖體RNA或轉(zhuǎn) 運(yùn)信使RNA)來(lái)進(jìn)行抗生素敏感性測(cè)試的方法。在一些實(shí)施方案中，從樣品中獲得等分試樣， 其中之一含有所選擇的抗生素。將含有生長(zhǎng)培養(yǎng)基的等分試樣在適合于微生物生長(zhǎng)的條件 下孵育，并將各個(gè)等分試樣中的微生物細(xì)胞移出并裂解，將裂解物逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增來(lái)推斷所 選擇的抗生素對(duì)微生物細(xì)胞的效果。在一個(gè)實(shí)施方案中，在存在所選擇的抗生素的情況下 孵育含有微生物細(xì)胞的樣品并提供刺激以誘導(dǎo)微生物細(xì)胞產(chǎn)生mRNA。隨后裂解微生物細(xì) 胞，在裂解物中的mRNA基本不降解，并且檢測(cè)mRNA以確定抗生素對(duì)微生物細(xì)胞的效果。
[0009] 因此，在第一個(gè)方面中，提供了進(jìn)行快速抗生素敏感性測(cè)試的方法，所述方法包 括：
[0010] 在第一裂解物上進(jìn)行多重鑒定測(cè)試組，第一裂解物獲自懷疑含有微生物細(xì)胞的第 一樣品；
[0011] 從懷疑含有微生物細(xì)胞的第二樣品中獲得至少一個(gè)主等分試樣和參考等分試樣， 其中主等分試樣和參考等分試樣含有生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并且其中第一樣品和第二樣品來(lái)自共同 的受試者；
[0012] 向主等分試樣加入至少一種所選擇的抗生素，所選擇的抗生素至少部分地基于多 重鑒定測(cè)試組的結(jié)果而選擇；
[0013]在適合于促進(jìn)微生物生長(zhǎng)的條件下孵育主等分試樣和參考等分試樣，以測(cè)試所選 擇的抗生素的效力；
[0014] 從主等分試樣中分離微生物細(xì)胞并將所分離的微生物細(xì)胞重懸，以獲得主懸浮 物；
[0015] 從參考等分試樣中分離微生物細(xì)胞并將所分離的微生物細(xì)胞重懸，以獲得參考懸 浮物；
[0016] 裂解主懸浮物和參考懸浮物中的微生物細(xì)胞，從而獲得主裂解物和參考裂解物；
[0017] 對(duì)主裂解物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，以檢測(cè)與通過(guò)多重鑒定測(cè)試組可檢測(cè)的微生物細(xì) 胞相關(guān)的核酸，從而獲得主分析信號(hào)；
[0018] 對(duì)參考裂解物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，以檢測(cè)與通過(guò)多重鑒定測(cè)試組可檢測(cè)的微生物 細(xì)胞相關(guān)的核酸，從而獲得參考分析信號(hào)；
[0019] 比較主分析信號(hào)和參考分析信號(hào)，以獲得所選擇的抗生素對(duì)微生物細(xì)胞的效力的 量度。
[0020] 在另一個(gè)方面中，提供了進(jìn)行快速抗生素敏感性測(cè)試的方法，所述方法包括：
[0021] 從懷疑含有微生物細(xì)胞的樣品中獲得至少一個(gè)主等分試樣和參考等分試樣，其中 主等分試樣和參考等分試樣含有生長(zhǎng)培養(yǎng)基；
[0022] 向主等分試樣加入至少一種所選擇的抗生素；
[0023]在適合于促進(jìn)微生物生長(zhǎng)的條件下孵育主等分試樣和參考等分試樣，以測(cè)試所選 擇的抗生素的效力；
[0024] 從主等分試樣中分離微生物細(xì)胞并將所分離的微生物細(xì)胞重懸，以獲得主濃縮懸 浮物；
[0025] 從參考等分試樣中分離微生物細(xì)胞并將所分離的微生物細(xì)胞重懸，以獲得參考濃 縮懸浮物；
[0026] 裂解主濃縮懸浮物和參考濃縮懸浮物中的微生物細(xì)胞，從而獲得主裂解物和參考 裂解物；
[0027]對(duì)主裂解物和參考裂解物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，以檢測(cè)與微生物測(cè)試組成員相關(guān)的 核酸，從而獲得主分析信號(hào)和參考分析信號(hào)；
[0028] 比較主分析信號(hào)和參考分析信號(hào)，以獲得所選擇的抗生素對(duì)微生物細(xì)胞的效力的 量度。
[0029] 在另一個(gè)方面中，提供了進(jìn)行快速抗生素敏感性測(cè)試的方法，所述方法包括：
[0030] 從懷疑含有微生物細(xì)胞的樣品中獲得多個(gè)主等分試樣和參考等分試樣，其中主等 分試樣和參考等分試樣含有生長(zhǎng)培養(yǎng)基；
[0031] 向各個(gè)主等分試樣加入至少一種所選擇的抗生素，使得至少兩個(gè)主等分試樣含有 不同的所選擇的抗生素；
[0032] 在適合于促進(jìn)微生物生長(zhǎng)的條件下孵育主等分試樣和參考等分試樣，以測(cè)試所選 擇的抗生素的效力；
[0033] 從主等分試樣中分離微生物細(xì)胞并將所分離的微生物細(xì)胞重懸，以獲得多個(gè)主懸 浮物；
[0034] 從參考等分試樣中分離微生物細(xì)胞并將所分離的微生物細(xì)胞重懸，以獲得參考懸 浮物；
[0035] 裂解主懸浮物和參考懸浮物中的微生物細(xì)胞，從而獲得多個(gè)主裂解物和參考裂解 物；
[0036] 對(duì)主裂解物和參考裂解物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，以檢測(cè)與微生物組成員相關(guān)的核 酸，從而獲得多個(gè)主分析信號(hào)和參考分析信號(hào)；
[0037] 比較主分析信號(hào)和參考分析信號(hào)，以獲得所選擇的抗生素對(duì)微生物細(xì)胞的效力的 量度。
[0038] 在另一個(gè)方面中，提供了進(jìn)行快速抗生素敏感性測(cè)試的方法，所述方法包括：
[0039]從懷疑含有微生物細(xì)胞的樣品中獲得至少一個(gè)主等分試樣和參考等分試樣，其中 主等分試樣和參考等分試樣含有生長(zhǎng)培養(yǎng)基；
[0040]向主等分試樣加入至少一種所選擇的抗生素；
[0041]在適合于促進(jìn)微生物生長(zhǎng)的條件下孵育主等分試樣和參考等分試樣，以測(cè)試所選 擇的抗生素的效力；
[0042] 使主等分試樣和參考等分試樣中的微生物細(xì)胞接受經(jīng)配置以誘導(dǎo)產(chǎn)生靶mRNA的 刺激，其中選擇刺激使得敏感的和/或耐受的微生物細(xì)胞的mRNA產(chǎn)生由于微生物細(xì)胞暴露 于所選擇的抗生素而改變；
[0043] 裂解主等分試樣和參考等分試樣中的微生物細(xì)胞，獲得主裂解物和次裂解物，其 中以適合于避免各裂解物中的mRNA大量降解的方式進(jìn)行裂解，并且其中在與微生物細(xì)胞中 響應(yīng)刺激所產(chǎn)生的mRNA的壽命相關(guān)的時(shí)間段進(jìn)行裂解；
[0044] 對(duì)主裂解物和參考裂解物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增以檢測(cè)與微生物測(cè)試組成員相關(guān)的 mRNA，從而獲得主分析信號(hào)和參考分析信號(hào)；
[0045] 比較主分析信號(hào)和參考分析信號(hào)，以獲得所選擇的抗生素對(duì)微生物細(xì)胞的效力的 量度。
[0046] 在另一個(gè)方面中，提供了進(jìn)行抗生素敏感性測(cè)試的方法，所述方法包括：
[0047]從懷疑含有微生物細(xì)胞的樣品中獲得至少一個(gè)主等分試樣和參考等分試樣；
[0048] 向主等分試樣加入至少一種所選擇的抗生素；
[0049] 裂解獲自主等分試樣和參考等分試樣的微生物細(xì)胞，從而獲得主裂解物和參考裂 解物；
[0050] 對(duì)主裂解物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，以檢測(cè)與測(cè)試組成員相關(guān)的tmRNA，從而獲得主分 析信號(hào)；
[0051] 對(duì)參考裂解物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增以檢測(cè)與測(cè)試組成員相關(guān)的核酸，從而獲得參考 分析信號(hào)；
[0052] 比較主分析信號(hào)和參考分析信號(hào)，以獲得所選擇的抗生素對(duì)微生物細(xì)胞的效力的 量度。
[0053]可以通過(guò)參考以下詳述和附圖來(lái)進(jìn)一步理解本公開的功能和優(yōu)勢(shì)。
【附圖說(shuō)明】
[0054]現(xiàn)僅通過(guò)示例的方式，并參考附圖描述實(shí)施方案，其中：
[0055] 圖IA是流程圖，其示出了用于確定樣品中的微生物細(xì)胞的抗生素敏感性的方法的 實(shí)施例，其中微生物細(xì)胞的身份最初是基于鑒定組確定的，之后，將樣品等分試樣暴露于一 種或多種抗生素，其中所述一種或多種抗生素是基于先前所確定的微生物細(xì)胞的身份選擇 的。在從等分試樣中分離微生物細(xì)胞并裂解所分離的微生物細(xì)胞之后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增 分析，并將分析信號(hào)與獲自參考等分試樣的參考分析信號(hào)相比較來(lái)確定抗生素的效力。
[0056] 圖IB是流程圖，其示出了用于確定樣品中的微生物細(xì)胞的抗生素敏感性的方法的 另一實(shí)施例，其中用于進(jìn)行抗生素敏感性測(cè)試的樣品最初在鑒定測(cè)試期間用生長(zhǎng)培養(yǎng)基預(yù) 孵育。
[0057] 圖IC是流程圖，其示出了用于確定樣品的抗生素敏感性的方法的實(shí)施例，其中用 于進(jìn)行抗生素敏感性測(cè)試的樣品最初用抗生素吸收劑預(yù)孵育以去除最初存在于樣品中的 抗生素。
[0058]圖ID是流程圖，其示出了用于確定全血樣品的抗生素敏感性的方法的實(shí)施例，其 中最初去除懸浮有微生物細(xì)胞的液體中的至少一部分，以降低最初存在于樣品中的抗生素 的濃度。
[0059] 圖IE是流程圖，其示出了用于確定全血樣品的抗生素敏感性的方法的實(shí)施例，其 中用于進(jìn)行抗生素敏感性測(cè)試的樣品最初用抗生素吸收劑預(yù)孵育以去除最初存在于樣品 中的抗生素。
[0060] 圖2A是流程圖，其示出了用于確定樣品中的微生物細(xì)胞的抗生素敏感性的方法的 實(shí)施例，其中在一種或多種抗生素以及生長(zhǎng)培養(yǎng)基存在的情況下，孵育樣品等分試樣，以及 其中隨后將微生物細(xì)胞分離、裂解并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。通過(guò)比較分析信號(hào)和從參考等分 試樣獲得的參考分析信號(hào)，確定抗生素的效力。
[0061 ]圖2B是流程圖，其示出了用于確定樣品中的微生物細(xì)胞的抗生素敏感性的方法的 實(shí)施例，其中在一種或多種抗生素以及生長(zhǎng)培養(yǎng)基存在的情況下，孵育樣品等分試樣，以及 其中隨后將微生物細(xì)胞裂解并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增以檢測(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)信使RNA(tmRNA)。通過(guò)比較分 析信號(hào)和從參考等分試樣獲得的參考分析信號(hào)，確定抗生素的效力。
[0062] 圖2C是流程圖，其示出了基于將微生物細(xì)胞體內(nèi)暴露于一種或多種抗生素進(jìn)行抗 生素敏感性測(cè)試的示例方法。
[0063] 圖3提供了流程圖，其示出了用于確定樣品中的微生物細(xì)胞的抗生素敏感性的快 速mRNA分析方法的實(shí)施例，其中mRNA的產(chǎn)生與暴露于抗生素之后所施加的刺激相關(guān)。
[0064]圖4A和4B示意性地描述了在存在相應(yīng)的基因組DNA(gDNA)的情況下優(yōu)先擴(kuò)增mRNA 的方法。
[0065]圖5是鑒定測(cè)試組，其中鑒定組的成員具有一種或多種對(duì)應(yīng)的與其相關(guān)的抗生素。 在一些實(shí)施方案中，此類鑒定-抗生素對(duì)應(yīng)信息(任選地還根據(jù)樣品類型、感染類型(醫(yī)院或 社區(qū)所獲得的）和醫(yī)院病房來(lái)源來(lái)進(jìn)行分類)可以用于選擇一種或多種用于抗生素敏感性 測(cè)試(作為反應(yīng)測(cè)試)的抗生素而不需要醫(yī)生來(lái)提供信息。
[0066]圖6繪制了通過(guò)處理全血樣品所獲得的肺炎克雷伯菌(K. pneumoniae)的核糖體 RNA(rRNA)和tmRNA檢測(cè)的實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR(實(shí)時(shí)RT-PCR)信號(hào)，此方法包括裂解血細(xì)胞并添 加生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并隨后預(yù)孵育2小時(shí)。
[0067] 圖7示出了通過(guò)處理全血樣品所獲得的肺炎克雷伯菌rRNA和tmRNA的實(shí)時(shí)RT-PCR 的Ct值的表，此方法包括裂解血細(xì)胞并添加生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并隨后預(yù)孵育2小時(shí)。
[0068]圖8繪制了通過(guò)處理全血樣品所獲得的肺炎克雷伯菌rRNA檢測(cè)的實(shí)時(shí)RT-PCR信 號(hào)，此方法包括裂解血細(xì)胞并添加生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并隨后預(yù)孵育2小時(shí)，之后在暴露于或沒(méi)有 暴露于8yg/mL諾氟沙星或四環(huán)素的條件下孵育2小時(shí)。
[0069]圖9示出了通過(guò)處理全血樣品所獲得的肺炎克雷伯菌rRNA檢測(cè)的實(shí)時(shí)RT-PCR的Ct 值的表，此方法包括裂解血細(xì)胞并添加生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并隨后預(yù)孵育2小時(shí)，之后在暴露于或 沒(méi)有暴露于8yg/mL諾氟沙星或四環(huán)素的條件下孵育2小時(shí)。
[0070] 圖10繪制了用不同探針對(duì)DnaK mRNA進(jìn)行檢測(cè)時(shí)所對(duì)應(yīng)的實(shí)時(shí)RT-PCR和PCR信號(hào)。
[0071] 圖11繪制了將微生物細(xì)胞暴露于不同劑量的抗生素2小時(shí)之后所對(duì)應(yīng)的實(shí)時(shí)RT-PCR和PCR信號(hào)。
[0072] 詳細(xì)描述
[0073]參考下述討論的細(xì)節(jié)對(duì)本發(fā)明的各種實(shí)施方案和方面進(jìn)行描述。下述描述和附圖 是說(shuō)明性的，不應(yīng)理解為限制本發(fā)明。在此描述了許多具體細(xì)節(jié)以提供對(duì)本發(fā)明的各種實(shí) 施方案的透徹理解。然而，在某些情況下，為了提供本發(fā)明的實(shí)施方案的簡(jiǎn)潔描述，本發(fā)明 并未提及公知常識(shí)或常規(guī)細(xì)節(jié)。
[0074]如本文所用，術(shù)語(yǔ)"包含（comprises)"和"包含（comprising)"將被解釋為包括性 的和開放式的，而不是排他的。具體而言，在本說(shuō)明書和權(quán)利要求中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"包含 (compri ses)"和"包含(compri sing)"及其變型意味著包括指定的特征、步驟或組分。這些 術(shù)語(yǔ)不應(yīng)被解釋為排除了其它特征、步驟或組分的存在。
[0075] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"示例性"意味著"作為實(shí)例、例子或說(shuō)明"，且不應(yīng)被解釋為優(yōu)于 或勝過(guò)本文所公開的其它配置。
[0076] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"約"和"大約"意味著涵蓋可能存在于數(shù)值范圍的上限和下限中 的變化，如在性質(zhì)、參數(shù)和尺寸中的變化。除非另有規(guī)定，術(shù)語(yǔ)"約"和"大約"是指加或減 25%或以下。
[0077] 應(yīng)當(dāng)理解的是，除非另有說(shuō)明，任何指定的范圍或組都是所提及的單獨(dú)的范圍或 組中的每個(gè)成員，以及其中所涵蓋的每個(gè)可能的子范圍或子組和與其中的任意子范圍或子 組相類似的情況的簡(jiǎn)略形式。除非另有規(guī)定，本公開涉及且明確包含子范圍或子組的各個(gè) 和每個(gè)特定成員和組合。
[0078] 如本文所用，當(dāng)與數(shù)量或參數(shù)一起使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"大約"是指跨越規(guī)定數(shù)量或參數(shù) 約十分之一至十倍的范圍。
[0079]如本文所用，術(shù)語(yǔ)"抗生素敏感性測(cè)試"是指測(cè)試抗生素對(duì)微生物細(xì)胞的效果，這 是為了提供可以用于估計(jì)或確定涉及抗生素的體內(nèi)療法的成功的可能性的量度。
[0080]本公開提供了多種對(duì)基于微生物細(xì)胞鑒定而選擇的抗生素進(jìn)行快速抗生素敏感 性測(cè)試的示例方法。本公開的一些示例性實(shí)施方案支持在培養(yǎng)結(jié)果可用之前于短時(shí)間內(nèi)直 接從患者樣品中估計(jì)或確定敏感性或耐受性，從而切實(shí)影響在常規(guī)鑒定和抗生素敏感性結(jié) 果可用之前的抗微生物療法。