基于平行分離模式制備色譜分離棘豆中新化合物方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種化合物的制備方法，尤其涉及基于平行分離模式制備色譜分離棘 豆中新化合物方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 棘豆屬(Oxytropis D.C.)植物屬于豆科蝶形花亞科。該屬植物為多年生草本，半 灌木或灌木，全世界約為300多種，而我國(guó)有棘豆屬植物131種(藥用植物為20余種），分別分 布于甘肅、青海、內(nèi)蒙古、四川、西藏等地。棘豆屬藥用植物曾被收載于1977年版中國(guó)藥典， 其在我國(guó)分布廣泛，且民間常用于藏藥和蒙藥的復(fù)方之中。
[0003]藏藥棘豆（Oxytropis falcate Bunge)(藏藥名為莪達(dá)夏）是豆科（Leguminosae) 棘豆屬(Oxytropis D.C.)多年生草本植物。生長(zhǎng)在2700~4300 m的河灘、沙地、山坡、草甸， 產(chǎn)于青藏高原。棘豆主要具有抗炎止疼、清熱解毒、止血等功效，用于利便、除毒、清腫、止 血，可治療麻風(fēng)病、流感及扁桃體炎等多種病癥。由于其突出的療效，具有"草藥之王"的美 譽(yù)。棘豆是藏醫(yī)常用的三大抗炎藥之一，藏醫(yī)在臨床上使用廣泛，它是六味棘豆散、九味青 鵬散、奇正藏貼、奇正消痛貼膏的多種藏藥復(fù)方或藏成藥的主要藥物，是一味非常具有研究 和開(kāi)發(fā)價(jià)值的天然藥物。
[0004] 甘肅棘豆(Oxytropis kansuensis Bunge)是棘豆屬有毒植物品種之一，同時(shí)具有 較強(qiáng)的藥理活性，尤其在藏藥中使用較多，具有解毒醫(yī)瘡，止血利尿，治療各種內(nèi)出血癥。 [0005] 多葉棘豆(Oxytropis myriophylla (Pall) DC.)在蒙藥中使用較多，主要用于痕 疫、炎癥、丹毒、腮腺炎、麻疹、痛風(fēng)、各種刺疼和出血等癥。
[0006] 目前，各國(guó)學(xué)者對(duì)棘豆屬20多種藥用植物分離得到了 140多個(gè)化合物，其中多以黃 酮類(lèi)、三萜類(lèi)和生物堿類(lèi)化學(xué)成分居多，，沒(méi)有系統(tǒng)深入地研究棘豆中活性物質(zhì)的作用機(jī) 制，僅對(duì)其進(jìn)行了初步的藥理活性研究。同時(shí)，也無(wú)法穩(wěn)定獲得純度為98%以上的化學(xué)對(duì)照 品，不能滿(mǎn)足棘豆新藥創(chuàng)制及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制要求，從而制約了棘豆藥材的藥用開(kāi)發(fā) 研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種工藝簡(jiǎn)單、重復(fù)性高、回收率高的基于平 行分離模式制備色譜分離棘豆中新化合物方法。
[0008] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所述的基于平行分離模式制備色譜分離棘豆中新化合物 方法，包括以下步驟： ⑴制備棘豆提取物浸膏： 將棘豆用體積濃度為5~95%的乙醇或體積濃度為5~100%的甲醇進(jìn)行微波提取，得到提 取液;所述提取液經(jīng)減壓濃縮后得到棘豆提取物浸膏； ⑵萃?。?將所述棘豆提取物浸膏用其質(zhì)量卜10倍的去離子水溶解后，依次用石油醚、乙酸乙酯 進(jìn)行萃取，分別得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位； (3)所述水部位注入大孔樹(shù)脂層析柱中，依次用5~50倍柱體積且體積濃度為20%、40%、 60%、80%的乙醇進(jìn)行洗脫，分別得到20%、40%、60%、80%的洗脫部位； ⑷將所述40%的乙醇部位干燥至恒重后，得到40%乙醇部位干燥粉末； (5)將所述40%乙醇部位干燥粉末用其質(zhì)量的1~30倍的去離子水溶解后，注入到具有平 行分離模式的制備色譜裝置中，經(jīng)過(guò)一級(jí)制備色譜柱分離并用20倍柱體積、體積濃度為40% ~60%甲醇沖洗樣品、在線(xiàn)紫外檢測(cè)，得到目標(biāo)化合物組分，該目標(biāo)化合物組分經(jīng)捕集設(shè)備進(jìn) 行富集濃縮，然后進(jìn)入二級(jí)制備色譜柱，經(jīng)二級(jí)制備色譜柱分離、體積濃度為40%~60%的甲 醇洗脫、在線(xiàn)紫外檢測(cè)，即得符合化學(xué)對(duì)照品要求且純度>98%的新化合物1^_?€從 〇13-〇-a-L-rhamnopyranosy1-(1^2)-[6-0-(3-hydroxy-3-methylglutaryl)-b~D-glucopyranoside0
[0009] 所述步驟⑴中棘豆為鐮形棘豆、甘肅棘豆、多葉棘豆中一種。
[0010] 所述步驟⑴中微波提取的條件是指料液比為1 g:5 mL~30 mL，提取溫度為60~95 °C，提取次數(shù)1~4次，每次1~4 h，微波功率為1~100KW。
[0011]所述步驟⑴中減壓濃縮的條件是指壓力為〇. 02~0.07MPa。
[0012]所述步驟⑷中干燥的條件是指溫度為50~80°C。
[0013]所述步驟(5)中一級(jí)制備色譜柱的分離條件是指流速為20~60mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 200~400nm〇
[0014] 所述步驟(5)中一級(jí)制備色譜柱中的色譜填料為C18或C8鍵合相填料，填料粒徑為5~ 20um〇
[0015] 所述步驟(5)中捕集設(shè)備吸附填料為聚苯乙烯或甲基丙烯酸-二乙烯基苯聚合物。
[0016] 所述步驟(5)中二級(jí)制備色譜柱中的色譜填料為Sephadex LH-20。
[0017] 所述步驟(5)中二級(jí)制備色譜柱的分離條件是指流動(dòng)相為體積濃度為40%~60%的甲 醇，流速為〇 · 5~5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為200~400nm〇
[0018] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1、本發(fā)明采用具有平行分離模式的制備色譜裝置分離制備新化合物，不但工藝簡(jiǎn)單， 實(shí)用性高，而且實(shí)現(xiàn)了樣品的快速分離制備；同時(shí)，在保證高效分離的前提下，提高了樣品 的化學(xué)品產(chǎn)量，可以獲得克級(jí)純度在98%以上的化學(xué)對(duì)照品（參見(jiàn)圖1、圖2)。
[0019] 2、采用本發(fā)明方法獲得的新化合物具有較好抗炎活性，為以后的藥物研發(fā)提供了 理論依據(jù)。
[0020] 【抗炎實(shí)驗(yàn)】 ⑴實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明種小鼠，雌性，6~8周齡，體重20~25g，分為5組，每組10只。
[0021 ]⑵受試藥物及實(shí)驗(yàn)材料：二甲苯、新化合物1^611^€61'〇13-0-3-1^-rhamnopyranosyl-(1^2)-[6-0-(3-hydroxy-3-methylglutaryl)-b-D-glucopyranoside0
[0022]⑶實(shí)驗(yàn)方法： 小鼠隨機(jī)分組，連續(xù)給藥一周，每鼠于右耳廓均勻涂10~15ul二甲苯，左耳作對(duì)照。2小 時(shí)后脫椎處死，剪下小鼠耳廓，用9_的穿孔器將耳廓圓片取下，稱(chēng)重。
[0023]⑷結(jié)果： 表1新化合物對(duì)二甲苯所致的小鼠耳腫脹的抑制作用
注：*p〈0.05，*p〈0.01，*p〈0.001vsmodel〇
[0024]該新化合物能明顯抑制二甲苯所致的小鼠急性炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)出很好的量效關(guān) 系。
[0025]【新化合物應(yīng)用實(shí)驗(yàn)】 ⑴實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SD大鼠，雄雌性兼?zhèn)洌?~8周齡，體重120~150kg，分為5組，每組10只。
[0026] ⑵實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果： 選用健康SD大鼠50只，雄雌各半，體重150±30g，隨機(jī)分為5組，分別為空白對(duì)照組、陽(yáng) 性對(duì)照組和新化合物的高中低劑量組，按照表2所列計(jì)量與途徑給藥?？瞻讓?duì)照組灌胃等容 積的生理鹽水，每日給藥1次，連續(xù)給藥7d實(shí)驗(yàn)前于每只大鼠左后足關(guān)節(jié)處做標(biāo)記，用外徑 千分尺測(cè)定大鼠左后足厚度。末次給藥30min后于大鼠左后足拓皮下注射10%蛋清0.1ml致 炎。在致炎后1、2、3、4小時(shí)分別測(cè)定大鼠左后足厚度，計(jì)算各大鼠致炎前后左右后足厚度變 化，以腫脹度(致炎后足厚度值與致炎前足厚度之差值)判斷藥物的抗炎效果。結(jié)果見(jiàn)表2。
[0027] 表 2
3、本發(fā)明簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性高，易于推廣。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0029]圖1為本發(fā)明中新化合物色譜圖。其中液相條件為0~30min，40%甲醇~70%甲醇，流 速為lml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm。
[0030]圖2為本發(fā)明中新化合物的光譜圖。
[0031]圖3為本發(fā)明中新化合物的C譜圖。
[0032]圖4為本發(fā)明中新化合物的Η譜圖。
[0033]圖5為本發(fā)明中新化合物的BC譜圖。
[0034]圖6為本發(fā)明中新化合物的QC譜圖。
[0035]圖7為本發(fā)明中新化合物的COSY譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 實(shí)施例1基于平行分離模式制備色譜分離棘豆中新化合物方法，包括以下步驟： ⑴制備棘豆提取物浸膏： 將鐮形棘豆用體積濃度為5%的乙醇進(jìn)行微波提取，得到提取液；提取液在壓力為 0.02MPa的條件下經(jīng)減壓濃縮后得到棘豆提取物浸膏。
[0037] 其中：微波提取的條件是指料液比為1 g:5 mL，提取溫度為60°C，提取次數(shù)1次，每 次lh，微波功率為1KW。
[0038] ⑵萃取： 將棘豆提取物浸膏用其質(zhì)量1倍的去離子水溶解后，依次用石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃 取，分別得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位。
[0039] ⑶水部位注入大孔樹(shù)脂層析柱中，依次用5倍柱體積且體積濃度為20%、40%、60%、 80%的乙醇進(jìn)行洗脫，分別得到20%、40%、60%、80%的洗脫部位。