雞白痢沙門菌spiC-rfc雙基因敲除減毒株及其DIVA疫苗應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于禽沙門菌病的防治領(lǐng)域，具體涉及一種雞白痢沙門菌spiC-rfc雙基因 敲除減毒株及其DIVA疫苗應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞白痢是由雞白痢沙門菌(Salmonella Pullorum)引起的一種多發(fā)性傳染病，對(duì) 我國的養(yǎng)雞業(yè)危害極大。該病原菌除了能夠水平傳播，還可經(jīng)蛋垂直傳播而導(dǎo)致孵化率和 出雛率的降低，多侵害20日齡以內(nèi)雛雞，以白色下痢為特征，表現(xiàn)急性敗血癥經(jīng)過，發(fā)病率 和病死率相當(dāng)高;成年雞多為慢性或隱性感染，一般無明顯臨診癥狀。防治此病的傳統(tǒng)方法 是使用抗生素類藥物，長期使用易引起藥物殘留和細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)等諸多影響，因此，以疫 苗預(yù)防雞白痢的研究頗受重視。
[0003] 根據(jù)長期以來對(duì)雞白痢沙門菌防控措施的探索和實(shí)踐，雞白痢沙門菌的控制依賴 一個(gè)地區(qū)的感染程度。感染水平低或可實(shí)施檢疫淘汰制度的地區(qū)可采取血清學(xué)檢測(cè)和撲殺 的辦法控制雞白痢，感染水平高或者無法進(jìn)行淘汰撲殺的地區(qū)考慮使用疫苗。因此，理想的 雞白痢沙門菌減毒活疫苗除了應(yīng)具備安全性和有效性外，最好還應(yīng)具備D I V A (Differentiation of Infected and Vaccinated Animals, DIVA)的特點(diǎn)，即通過簡(jiǎn)單有 效的血清學(xué)檢測(cè)方法，就能區(qū)分疫苗免疫動(dòng)物和自然感染動(dòng)物，以指導(dǎo)生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)的疫苗使 用。〇-抗原是革蘭陰性菌細(xì)胞最外層結(jié)構(gòu)脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)的主要組成部 分，不僅是病原菌的致病因子，其特異多糖重復(fù)單元的數(shù)目差異也是〇-血清分型的依據(jù)。基 于LPS特異性的玻板凝集試驗(yàn)以其簡(jiǎn)單易行的操作特點(diǎn)，目前在國內(nèi)外被廣泛用于雞白痢 的檢疫診斷。綜上所述，〇-抗原可作為新型雞白痢沙門菌減毒活疫苗的操作靶點(diǎn)和選擇標(biāo) 志，用以構(gòu)建DIVA疫苗。
[0004] DIVA活疫苗已在畜禽中成功應(yīng)用于防止病毒感染。
[0005] 重組自殺質(zhì)粒技術(shù)和Red同源重組技術(shù)作為基因突變方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌 的基因敲除與基因替換。沙門菌spiC與致病性密切相關(guān)，rfc參與細(xì)菌LPS的生物合成。雙基 因敲除極大地降低了減毒活疫苗在實(shí)際應(yīng)用過程中發(fā)生回復(fù)突變的可能性，在不影響免疫 原性的前提下，最大程度的規(guī)避毒力返祖的風(fēng)險(xiǎn)，保證了疫苗的安全性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于以上現(xiàn)有技術(shù)的情況，本發(fā)明的目的在于提供一種雞白痢沙門菌spiC-rfc雙 基因敲除減毒株及其制備與應(yīng)用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的以及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明的第一方面，提供一種雞白痢沙門菌spiC-rfc雙基因敲除減毒株，為spiC 基因和rfc基因都不表達(dá)的雞白痢沙門菌。
[0009] 優(yōu)選的，所述雞白痢沙門菌spiC-rfc雙基因敲除減毒株，為spiC基因和rfc基因都 被敲除的雞白痢沙門菌。
[0010] 雞白痢沙門菌為現(xiàn)有技術(shù)，具體信息為:Accession:NC_021984.1;GI:529218781。 spiC基因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)，具體信息為Accession :JN673268.1;GI :374304599dfc基因?yàn)楝F(xiàn)有 技術(shù)，具體信息為:ACCESSI0N:CP006575;REGI0N: 1181776 …1182999。
[0011]只要將雞白痢沙門菌中的spiC基因和rfc基因都進(jìn)行敲除，使得spiC基因和rfc基 因都不表達(dá)，即可獲得雞白痢沙門菌spiC-rfc雙基因敲除減毒株。
[0012] 優(yōu)選地，本發(fā)明一實(shí)施例中，被敲除的spiC基因的序列如SEQ ID NO. 1所示，具體 為：
[0013] TCTGAGGAGGGATTCATGCTGGCAGTTTTAAAAGGCATTCCATTAATTCAGGATATCAAGGCCGAAGGTAATAGCCG ATCCTGGATAATGACTATTGATGGGCATCCTGCCAGAGGAGAAATTTTCTCAGAAGCATTTTCTATTTCTTTGTTCT TAAATGACCTGGAAAGCTTACCTAAGCCTTGTCTTGCCTATGTGACACTACTGCTTGCAGCACACCCGGACGTACAT GATTATGCTATACAGCTCACAGCGGATGGGGGATGGTTAAACGGTTATTATACCACAAGTAGTAGCTCTGAGCTTAT TGCTATTGAGATAGAAAAACACCTGGCTTTAACTTGCATTTTAAAAAATGTAATACGCAATCACCATAAACTTTATT CGGGTGGGGTATAA〇
[0014] 優(yōu)選地，本發(fā)明一實(shí)施例中，被敲除的rfc基因的序列如SEQ ID NO. 2所示，具體 為：
[0015] ATGCTTATAATTTCATACATTGTATTATGCTTATTATTTATAGTTTATCTCTATACTCTTTCCGTAAGAATTGAGGG AAAAATAATAAATGTAATGGTCCCATACCTGATAATAACAGTGCCTACACTGTACGTGTTTGAAGGTATATTTGTAT ACCTCTCAGAGGTGCGGAAGTATACAGTGGAATATTTGTTTTTCTATACTTGCTATATAACATACATAGCATCATTT GTTATTTCTTATCTTTACACACAAAGAAAACCCATATACAACAAATCAAACACAAAAAATAAACCAAGGTATGTGTT TACTTCATTGTTATTCACCTTCCTTGCTTTTATCATTTACCTTCCAGTGTTGATGGAGTTCAGAGAGTACATACTTA GCCCAAGAAGAATATACGAATTAACCAGAACAGGGTATGGTATATACTTCTATCCTTCATTAATGTTTTCTCTTGTC GCTTCTATTTGCGCGTTCTTTACATACAAAAAATCAAAGTTATTTTGTATTTCCATAGTTTTATTTAACTGTATACT TATTTTCTTGCATGGTAACAAAGGACCAATATTTAGTATATTTATAGCATTCATCCTTTATCTTTCATATATTGAAA ATAAAAAAATTAAATTTATGTTCCTGGTGAAATCGTTTGCTGTTATAGCAGTCATTGTAACGGCATTCTTTGCATAT ACGTTTACTGATGGGAATCCGATAGAAAATATGGCGAATTACTCGGATTATACCCGTAATGCTGTTCTTGTTGCCTC CTCAAACTTTGACTTTATGTACGGAAAATTACTAATGGAGAGCGAGGTTTACTCGAGAATTCCGAGGGCTATTTGGC CTGATAAGCCTGAAGATTTTGGCGCATTGTATCTGGCAAAAGTATTTTTCCCTGATGCATTCTACAGGAATCAGGGC GCTCCTGCTTTCGGGTATGGTGAACTATACGCAGATTTCGGGCTTTTTACACCAGTTTGGTTAGTTATATCTGGAGT ATTTAAAGGCGTCCTGGCTAAGTATTTCTCCAATAAAACTCAGGAAACAAAGTCAGCGCATTATTTCATAATGTTCC TATTTTGCATTGGAATAAGTGTGATTCCTGTTAGCATGGGATGGTTGTTCCCTGAGCATTTGATGATTGCCTTTATA GTATACATTGCATCTTCCTTTGTTTTTTCAGCGCATATAAGATTCGTTTTACTAAGAAGCGATAAATAA。
[0016] 進(jìn)一步地，所述減毒株還可經(jīng)過其他基因改造。
[0017] 所述的其他基因改造是指除spiC基因和rfc基因雙敲除以外的基因改造。所述其 他基因改造可以是單個(gè)目標(biāo)基因的改造或者為多個(gè)感興趣目標(biāo)基因的改造。感興趣目標(biāo)基 因并不特指，可以根據(jù)研究需要設(shè)定并改造。例如，可以是一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)以上目標(biāo)基因的 改造。理論上可以不斷對(duì)其進(jìn)行基因改造，對(duì)于目標(biāo)基因的改造數(shù)量可以按照需要操作，沒 有特別限制。
[0018]基因改造具體是指通過生物或化學(xué)或物理的手段使基因相比改造前在結(jié)構(gòu)上發(fā) 生變化。這種變化主要是指堿基對(duì)組成的變化，包括但不限于一個(gè)或多個(gè)堿基