一種17β-羥基雌甾-4,9-二烯-3-酮的生物制備方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥和生物化工技術(shù)領域，尤其涉及一種17β-羥基雌留-4，9_二 烯-3-酮的生物制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 17β_羥基雌甾-4，9-二烯-3-酮(化合物1，如下，又名甲基雙烯醇酮），屬于4，9-雙 烯物的一種，是留體類抗孕激素藥物，如三烯高諾酮，米非司酮等的重要合成中間體。
[0003]
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中有部分文獻和專利公開了甲基雙烯酮及其類似物的合成方法，其中專 利EP0057115、US4386085、Ger 3231827、3231828、3347126及CN 1087090A公開了數(shù)種其類 似物化學合成的方法，但合成均為多步反應，過程繁瑣，總收率低。
[0005] 專利CN 104530165 Α和US2003/0109728A1公開了一種甲基雙烯酮的化學合成方 法，利用5(10)-雄甾烯-19-去甲基-17β-醇-3-酮作為原料(化合物3)合成甲基雙烯酮，如下 式所示：
[0006]
[0007]該方法需用到多種有機溶劑如：吡啶、丙酮、二氯甲烷和四氫呋喃等，尤其需要用 到高毒性、刺激性試劑4-二甲氨基吡啶(DMAP)作為親核?；噭?。
[0008] 文獻Tetrahedron Letters，1985,26(41) ,5033-5034中公開了一種利用微生物細 胞動力學拆分制備甲基雙烯酮的方法，但其底物濃度僅為〇. 2g/L，收率僅為42%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種17β_羥基雌甾-4,9_二烯-3-酮的生物制備方法，通過此 方法克服了現(xiàn)有技術(shù)中采用化學合成法制備甲基雙烯酮及其類似物過程中存在的步驟復 雜、總收率低的問題，同時也解決了使用高毒性、刺激性藥劑DMAP帶來的環(huán)境不友好問題； 同時克服了采用了微生物細胞動力學拆分制備甲基雙烯酮的過程中，底物濃度低，收率低 的問題。
[0010] 為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種17β-羥基雌甾-4,9-二烯-3-酮 的生物制備方法，以化合物2為底物，使其在氫供體、輔酶、助溶劑及羰基還原酶的作用下發(fā) 生還原反應，生成17β-羥基雌留-4，9-二烯-3-酮，所述的反應在pH為5.5~8.0的緩沖溶液 中進行，反應溫度為25~40°C，其中，所述的氫供體為異丙醇，所述的助溶劑為聚乙二醇辛 基苯基醚，所述的輔酶與化合物2的投料質(zhì)量比為0.01~0.1:1，
[0011] 所述的化合物2的結(jié)構(gòu)式為：
[0012]
0
[0013]優(yōu)選地，所述的輔酶為NDP。
[0014]優(yōu)選地，所述的輔酶與化合物2的投料質(zhì)量比為0.015~0.02:1，所述異丙醇的投 料體積為反應體系總體積的5~7.5%。
[0015]優(yōu)選地，所述反應在pH為6.0~7.0的磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖液中進行。 [0016]優(yōu)選地，在溫度30~35°C條件下進行所述反應。
[0017] 優(yōu)選地，所述的羰基還原酶為購自蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司的牌號為EW106的 羰基還原酶1與牌號為EW027的羰基還原酶2兩者的組合。
[0018] 進一步優(yōu)選地，所述的羰基還原酶1、羰基還原酶2與所述化合物2的投料質(zhì)量比分 別為 0.05 ~0.3:1、0.01 ~0.15:1。
[0019] 更進一步優(yōu)選地，所述的羰基還原酶1、羰基還原酶2與所述化合物2的投料質(zhì)量比 分別為 0.14~0.15:1、0.07 ~0.075:1。
[0020] 進一步優(yōu)選地，所述的羰基還原酶1與羰基還原酶2的投料質(zhì)量比為0.4~5:1。更 為優(yōu)選地，羰基還原酶1與羰基還原酶2的投料質(zhì)量比為2:1。
[0021] 優(yōu)選地，生物法制備17β_羥基雌甾-4,9_二烯-3-酮的具體實施過程如下:將所述 的化合物2、輔酶、助溶劑、羰基還原酶加入到裝有所述緩沖溶液的反應器中，并分批加入所 述氫供體，將所述反應器置于25~40°C的水浴鍋中攪拌反應，HPLC檢測反應進程，反應結(jié)束 后，將反應液真空濃縮至有水分蒸出，反應液過濾，收集濾餅，將濾餅溶解并加熱至60~80 °C回流，趁熱過濾，收集濾液，濾液濃縮、烘干得產(chǎn)品17β-羥基雌留-4，9-二烯-3-酮。
[0022] 由于上述技術(shù)方案的運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點：
[0023] 1)解決了采用化學合成法制備甲基雙烯酮及其類似物過程中，步驟多、過程繁瑣、 總收率低的問題；
[0024] 2)解決了以化合物3為底物，通過化學合成法制備甲基雙烯酮的過程中，采用多種 有機溶劑及高毒性、刺激性藥劑DMAP所帶來的環(huán)境不友好問題；
[0025] 3)解決了采用微生物細胞動力學拆分制備甲基雙烯酮的過程中，底物濃度低，收 率低的問題；
[0026] 4)本發(fā)明所采用的酶法還原化合物2得到化合物1，其步驟簡單、底物濃度高、酶用 量少、產(chǎn)物收率高，整個過程對環(huán)境友好。
【具體實施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明，但本發(fā)明并不限于以下實施 例。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體使用的不同要求做進一步調(diào)整，未注明的實施 條件為常規(guī)實驗中的條件。
[0028]實施例1( pH優(yōu)化）
[0029]向7個4mL反應小管中分別加入140mg化合物2,并分別加入1.7mL 0.1M不同pH的磷 酸鹽緩沖液，再在每一個小管中依次加入l〇〇yL異丙醇、100yL聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、2.8mg NAD、20mg羰基還原酶1(購自蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司，牌號EW106,下 同）、l〇mg羰基還原酶2(購自蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司，牌號EW027，下同）置于30°C水浴 鍋中攪拌24h，取樣檢測，底物轉(zhuǎn)化率如表1:
[0030] 表 1
[0031]
[0032]從表1中可看出，在其他條件不變的情況下，在pH為6.5的緩沖溶液中，化合物2的 轉(zhuǎn)化率最高。
[0033]實施例2(溫度條件的優(yōu)化）
[0034] 向5個4mL反應小管中依次加入140mg化合物2、1.7mL 0.1M ρΗ = 6·5磷酸鹽緩沖 液、100yL異丙醇、100yL Triton X-100、2.8mg NAD、20mg羰基還原酶l、10mg羰基還原酶2置 于不同溫度的水浴鍋中攪拌24h，取樣檢測，底物轉(zhuǎn)化率的結(jié)果如表2:
[0035] 表 2
[0036]
[0037] 從表2中可看出，在其他條件不變的情況下，在35°C反應溫度條件下，化合物2的轉(zhuǎn) 化率最高。
[0038] 實施例3 (異丙醇投料體積的優(yōu)化）
[0039] 向6個411^反應小管中依次加入14〇11^化合物2、0.謂？!16.5磷酸鹽緩沖液和異丙 醇（共1.9mL)，100yL Triton X_100、lmg NAD、20mg羰基還原酶l、10mg羰基還原酶2置于35 °C水浴鍋中攪拌24h，取樣檢測，底物轉(zhuǎn)化率的結(jié)果如表3:
[0040] 表 3
[0041]
[0042] 從表3中可看出，在其他條件不變的'青況下，異丙醇的投料體積占反應體系總體積 的7.5 %時，化合物2的轉(zhuǎn)化率最高。
[0043]實施例4(放大反應）
[0044] 向500mL三口反應瓶中依次加入12g化合物2、380mL 0.1M pH 6.5Tris-HCl緩沖液 和20mL異丙醇、20mL Triton X-100、200mg NAD、1700mg羰基還原酶l、700mg羰基還原酶2置 于35°C水浴鍋中攪拌6h再加入20mL異丙醇，反應24h，取樣檢測，轉(zhuǎn)化率為93.7 %。反應結(jié)束 后，于50°C條件下真空濃縮至有明顯水分蒸出即可。反應液經(jīng)三層濾紙過濾，收集濾餅。濾 餅用30倍體積的甲醇溶解并加熱至60°C回流30min，趁熱過濾，收集濾液。將上述反應液濃 縮至干，得白色固體，置于55°C烘箱過夜得產(chǎn)物1，類白色固體12. lg、純度95%。
[0045]上述實施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人 士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并加以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍，凡根據(jù)本發(fā)明 精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種17β-羥基雌甾-4,9-二烯-3-酮的生物制備方法，其特征在于，以化合物2為底 物，使其在氫供體、輔酶、助溶劑及羰基還原酶的作用下發(fā)生還原反應，生成17β_羥基雌甾-4，9-二烯-3-酮，所述的反應在pH為5.5~8.0的緩沖溶液中進行，反應溫度為25~40°C，其 中，所述的氫供體為異丙醇，所述的助溶劑為聚乙二醇辛基苯基醚，所述的輔酶與化合物2 的投料質(zhì)量比為0.01~0.1:1， 所述的化合物2的結(jié)構(gòu)式為：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的17β-羥基雌留-4，9-二烯-3-酮的生物制備方法，其特征在于： 所述的輔酶為NDP。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的17β-羥基雌留-4,9-二烯-3-酮的生物制備方法，其特征在 于:所述的輔酶與化合物2的投料質(zhì)量比為0.015~0.02:1，所述異丙醇的投料體積為反應 體系總體積的5~7.5%。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的17β-羥基雌留-4，9-二烯-3-酮的生物制備方法，其特征在于： 所述反應在pH為6.0~7.0的磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖液中進行。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的17β-羥基雌留-4，9-二烯-3-酮的生物制備方法，其特征在于： 在溫度30~35°C條件下進行所述反應。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的17β-羥基雌留-4，9-二烯-3-酮的生物制備方法，其特征在于： 所述的羰基還原酶為購自蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司的牌號為EW106的羰基還原酶1與牌 號為EW027的羰基還原酶2兩者的組合。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的17β-羥基雌留-4，9-二烯-3-酮的生物制備方法，其特征在于： 所述的羰基還原酶1、羰基還原酶2與所述化合物2的投料質(zhì)量比分別為0.05~0.3:1、0.01 ~0.15:1。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的17β-羥基雌留-4，9-二烯-3-酮的生物制備方法，其特征在于： 所述的羰基還原酶1、羰基還原酶2與所述化合物2的投料質(zhì)量比分別為0.14~0.15:1、0.07 ~0.075:1 〇9. 根據(jù)權(quán)利要求6至8任一權(quán)利要求所述的17β-羥基雌留-4,9-二烯-3-酮的生物制備 方法，其特征在于:所述的羰基還原酶1與羰基還原酶2的投料質(zhì)量比為0.4~5:1。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的7β_羥基雌留-4，9-二烯-3-酮的生物制備方法，其特征在于， 具體實施過程如下:將所述的化合物2、輔酶、助溶劑、羰基還原酶加入到裝有所述緩沖溶液 的反應器中，并分批加入所述氫供體，將所述反應器置于25~40°C的水浴鍋中攪拌反應， HPLC檢測反應進程，反應結(jié)束后，將反應液真空濃縮至有水分蒸出，反應液過濾，收集濾餅， 將濾餅溶解并加熱至60~80°C回流，趁熱過濾，收集濾液，濾液濃縮、烘干得產(chǎn)品17β-羥基 雌甾-4,9-二烯-3-酮。
【專利摘要】<b>本發(fā)明公開了一種17β-羥基雌甾-4,9-二烯-3-酮的生物制備方法，該方法以化合物2為底物，使其在氫供體、輔酶、助溶劑及羰基還原酶的作用下發(fā)生還原反應，生成17β-羥基雌甾-4,9-二烯-3-酮，所述的反應在pH為5.5~8.0的緩沖溶液中進行，反應溫度為25~40℃，其中，所述的氫供體為異丙醇，所述的助溶劑為聚乙二醇辛基苯基醚，所述的輔酶與化合物2的投料質(zhì)量比為0.01~0.1:1。該方法克服了傳統(tǒng)方法的步驟多、過程繁瑣、收率低、對環(huán)境不友好的問題，且該方法在制備過程中，底物濃度高、產(chǎn)物收率高、與環(huán)境友好，解決了現(xiàn)有技術(shù)中無酶法制備17β-羥基雌甾-4,9-二烯-3-酮的問題。</b>
【IPC分類】C12P33/16
【公開號】CN105483199
【申請?zhí)枴緾N201511018260
【發(fā)明人】陶軍華, 樂庸堂, 梁曉亮
【申請人】蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2015年12月30日