貝AiL，V6:10Q拷貝AxL，V7:0拷貝AxL，V8:陰性對(duì)照），建立如下擴(kuò)增反應(yīng)體系：lyL核酸樣 本、2.5yL Bst DNA聚合酶緩沖液、lyL Bst DNA聚合酶(8U/yL)、lyL AMV反轉(zhuǎn)錄酶（lOU/μ L)、2.5yL dNTP(10mmol/L)、8yL Betaine(250mmol/L)、lyL MgS〇4(150mmol/L)、lyL HNB (2.4mmol/L)，對(duì)應(yīng)于被測(cè)基因的四條引物各lyL(引物濃度為F3與B3:5pmolAiL、BIP與FIP: 40pmol/yL)、lyL ddH2〇?；旃?，63°C，于池度儀上反應(yīng)lh，85°C，5min滅活中止反應(yīng)，結(jié)果如 圖8所示，同時(shí)使用上述梯度稀釋的樣本在上述試劑盒中拉薩熱病毒檢測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果 圖9所示，芯片結(jié)果與濁度儀一致，該方法的最低檢出限為1拷貝。
[0109] 實(shí)施例4:黃熱病毒引物特異性與敏感性
[0110] 試劑盒中昔熱病毒檢測(cè)液縣休成分及用量如下衷所示：
[0111]
10 倍梯度稀釋(￥1:1〇5拷貝/^，￥2:104拷貝/^，￥3 :103拷貝/^，￥4:102拷貝/^，￥5:10 1拷 貝AiL，V6:10Q拷貝AxL，V7:0拷貝AxL，V8:陰性對(duì)照），建立如下擴(kuò)增反應(yīng)體系：lyL核酸樣 本、2.5yL Bst DNA聚合酶緩沖液、lyL Bst DNA聚合酶(8U/yL)、lyL AMV反轉(zhuǎn)錄酶（lOU/μ L)、2.5yL dNTP(10mmol/L)、8yL Betaine(250mmol/L)、lyL MgS〇4(150mmol/L)、lyL HNB (2.4mmol/L)，對(duì)應(yīng)于被測(cè)基因的四條引物各lyL(引物濃度為F3與B3:5pmolAiL、BIP與FIP: 40pmol/yL)、lyL ddH2〇?；旃?，63°C，于池度儀上反應(yīng)lh，85°C，5min滅活中止反應(yīng)，結(jié)果如 圖11所示，同時(shí)使用上述梯度稀釋的樣本在上述試劑盒中黃熱病毒檢測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果 圖12所示，對(duì)應(yīng)芯片上的結(jié)果，其結(jié)果一致。
[0114] 實(shí)施例5:基孔肯亞熱病毒引物特異性與敏感性
[0115] 試劑盒中基孔肯亞熱病毒檢測(cè)液具體成分及用量如下表所示：
[0116]
[0117]微流控芯片的反應(yīng)池中均使用上述基孔肯亞熱病毒檢測(cè)液，檢測(cè)樣本與方法與實(shí) 施例1相同，結(jié)果見圖13,只有對(duì)應(yīng)的基孔肯亞熱病毒模板的反應(yīng)池有顏色變化（圖13中的 5)，而其他均為紫羅蘭色。
[0118]濁度儀檢測(cè)：使用Qiagen試劑盒提取上述基孔肯亞熱病毒質(zhì)粒模擬樣本中的核 酸，并按照1 〇倍梯度稀釋(V1:1 〇5拷貝/yL，V2:104拷貝AiL，V3:103拷貝AiL，V4:10 2拷貝AiL， V5:101拷貝ΛΛ，V6:10°拷貝AxL，V7:0拷貝/yL，V8:陰性對(duì)照），建立如下擴(kuò)增反應(yīng)體系：lyL 核酸樣本、25yL Bst DNA聚合酶緩沖液、lyL Bst DNA聚合酶（8U/yL)、lyL AMV反轉(zhuǎn)錄酶 (10UAiL)、2.5yL dNTP(10mmol/L)、8yL Betaine(250mmol/L)、lyL MgS〇4(150mmol/L)、lyL HNB(2.4mmol/L)，對(duì)應(yīng)于被測(cè)基因的四條引物各lyL(引物濃度為F3與B3:5pmolAiL、BIP與 FIP: 40pmolAiL)、lyL ddH20?；靹颍?3°C，于濁度儀上反應(yīng)lh，85°C，5min滅活中止反應(yīng)，結(jié) 果如圖14所示，同時(shí)使用上述梯度稀釋的樣本在上述試劑盒中黃熱病毒檢測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)， 結(jié)果圖15所示，對(duì)應(yīng)芯片上的結(jié)果，其結(jié)果一致，基孔肯雅熱病原的檢測(cè)方法最低檢出限為 10拷貝。
[0119]以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù) 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn) 和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.烈性傳染病病原體檢測(cè)引物組，其特征在于，包括埃博拉病毒RT-LAMP引物、拉薩熱 病毒RT-LAMP引物、馬爾堡病毒RT-LAMP引物、裂谷熱病毒RT-LAMP引物、黃熱病毒RT-LAMP引 物和基孔肯雅熱病毒RT-LAMP引物中的至少一種:具體核苷酸序列如下： 埃博拉病毒RT-LAMP引物： Ebov-F3：SEQ ID N0：1, Ebov-B3：SEQ ID NO：2, Ebov-FIP：SEQ ID NO：3, Ebov-BIP：SEQ ID NO：4： 拉薩熱病毒RT-LAMP引物： Lassa_F3:SEQ ID N0:5， Lassa_B3:SEQ ID N0:6， Lassa-FIP：SEQ ID N0：7? Lassa-BIP：SEQ ID N0：8? Lassa-LF：SEQ ID N0：9? Lassa-LB：SEQ ID NO：10： 馬爾堡病毒RT-LAMP引物： Marburg-F3：SEQ ID NO：11, Marburg-B3：SEQ ID NO：12, Marburg-FIP：SEQ ID NO：13, Marburg-BIP：SEQ ID NO：14, Marburg-LF：SEQ ID NO：15, Marburg-LB：SEQ ID NO：16； 裂谷熱病毒RT-LAMP引物： RVFV-F3：SEQ ID NO：17, RVFV-B3：SEQ ID NO：18, RVFV-FIP：SEQ ID NO：19, RVFV-BIP：SEQ ID NO：20, RVFV-LF：SEQ ID NO：21, RVFV-LB：SEQ ID NO：22： 黃熱病毒RT-LAMP引物： yellow fever-F3：SEQ ID NO：23, yellow fever-B3：SEQ ID N0：24, yellow fever-FIP：SEQ ID NO：25, yellow fever-BIP：SEQ ID NO：26, yellow fever-LF：SEQ ID NO：27, yellow fever-LB：SEQ ID N0：28： 基孔肯亞熱病毒RT-LAMP引物： CHIK-F3：SEQ ID N0：29? CHIK-B3：SEQ ID N0：30? CHIK-FIP：SEQ ID NO：31, CHIK-BIP:SEQ ID NO:32。2. -種烈性傳染病病原體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的烈性傳染病 病原體檢測(cè)引物組。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的烈性傳染病病原體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，還包括檢測(cè)液， 所述檢測(cè)液中包括LAMP緩沖液、dNTPs、有鏈置換特性的DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、Betaine、 MgS〇4、HNB 和 ddH20。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的烈性傳染病病原體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，檢測(cè)液中各成分 的濃度為：5. 根據(jù)權(quán)利要求2-4任一所述的烈性傳染病病原體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，還包括用 于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的微流控芯片，該芯片包括封接在一起的基板和蓋片，基板上設(shè)有多個(gè)檢測(cè)單 元，每個(gè)檢測(cè)單元由依次連通的進(jìn)樣通道、反應(yīng)池和連接通道組成，蓋片上設(shè)有進(jìn)樣孔和排 氣孔，進(jìn)樣孔對(duì)應(yīng)于進(jìn)樣通道的末端，排氣孔對(duì)應(yīng)于連接通道的末端，排氣孔的內(nèi)部或表面 有疏水透氣介質(zhì)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的烈性傳染病病原體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)池中附 著有權(quán)利要求1所述的烈性傳染病病原體檢測(cè)引物組，一個(gè)反應(yīng)池對(duì)應(yīng)于一種病毒的RT-LAMP引物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的烈性傳染病病原體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，一個(gè)反應(yīng)池內(nèi)的 RT-LAMP 引物量為:F3 與 B3 均 5pmol，BIP 與 FIP 均 40pmol，LP 與 LB 均 20pmol。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的烈性傳染病病原體檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于， 待檢測(cè)樣品提取RNA，與檢測(cè)液混合后，滴入進(jìn)樣孔，待其移動(dòng)到各個(gè)反應(yīng)池后用不透水不 透氣的封口膜封住進(jìn)樣孔和排氣孔，將芯片在63°C環(huán)境下反應(yīng)1小時(shí)，然后85°C滅活5分鐘， 結(jié)束反應(yīng);肉眼觀察反應(yīng)池中顏色變化，仍然未紫羅蘭色的為陰性，從紫羅蘭色變?yōu)樘焖{(lán)色 的為陽性。
【專利摘要】本發(fā)明公開了烈性傳染病病原體檢測(cè)引物組及試劑盒，引物組包括埃博拉病毒、拉薩熱病毒、馬爾堡病毒、裂谷熱病毒、黃熱病毒和基孔肯雅熱病毒中的至少一組RT-LAMP引物。本發(fā)明的引物體系，減少了擴(kuò)增反應(yīng)背景，靈敏度和特異性都非常好。由引物組構(gòu)成的試劑盒，還包括檢測(cè)液和微流控芯片，檢測(cè)液體系省略了單獨(dú)的RT-PCR的二次擴(kuò)增步驟，縮短了檢測(cè)時(shí)間，且沒有核酸的變復(fù)性過程，減少了RNA酶和擴(kuò)增核酸的污染機(jī)會(huì)，提高了檢測(cè)的敏感性和安全性。微流控芯片系統(tǒng)提供的等溫封閉環(huán)境，最終實(shí)現(xiàn)提取核酸模板的快速等溫?cái)U(kuò)增及自動(dòng)化結(jié)果判別，降低了對(duì)實(shí)驗(yàn)硬件的要求，減少了反應(yīng)試劑用量，降低了檢測(cè)成本，結(jié)果可直接通過顏色變化判定。
【IPC分類】C12Q1/70, C12Q1/68, C12N15/11
【公開號(hào)】CN105483293
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610065551
【發(fā)明人】郝榮章, 宋宏彬, 盧曉, 劉超, 賈雷立, 趙榮濤, 王瑞麗, 王金艷, 李楊, 孔文
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍疾病預(yù)防控制所
【公開日】2016年4月13日
【申請(qǐng)日】2016年1月29日