電點，氨基酸標簽為連接于C 末端的多天冬氨酸標簽。在一個實施方式中，通過添加所示標簽得到改變的大腸桿菌蛋白 質(zhì)為二膚結(jié)合蛋白質(zhì)（DppA)、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)（MBP)、硫氧還蛋白和憐酸結(jié)合蛋白質(zhì) 。]1〇5/口315)。在一個特定實施方式中，大腸桿菌憐酸結(jié)合蛋白質(zhì)。11〇5/口315)的口1通過向 添加 C端包含6個天冬氨酸的多天冬氨酸標簽(polyD)由7.2減少至5.1。
[0294] 還優(yōu)選地是對污染性大腸桿菌蛋白質(zhì)的特定殘基進行修飾W改變其物理特性，不 管是單獨修飾還是與N或C末端添加標簽相結(jié)合。運些改變可包括插入或刪除W改變蛋白質(zhì) 大小，或氨基酸置換W改變pl或疏水性。在一個實施方式中，運些殘基位于蛋白質(zhì)表面。在 一個優(yōu)選的實施方式中，改變了化oS蛋白質(zhì)表面的殘基W降低蛋白質(zhì)的pi。優(yōu)選地，所提到 的殘基對于憐酸結(jié)合處曰33，1155,304,472)很重要，因此為了維持功能性化〇5蛋白質(zhì)要盡量 避開。優(yōu)選地，祀向的是那些伸出蛋白質(zhì)表面很遠或在堿性殘基大基團之內(nèi)或附近的賴氨 酸殘基。在一個實施方式中，PhoS蛋白質(zhì)具有連接于C末端的六聚多天冬氨酸標簽，而分子 的相反末端上的表面殘基用于置換。優(yōu)選地，所選的賴氨酸殘基置換為谷氨酸或天冬氨酸 W形成比將中性殘基變?yōu)樗嵝詺埢蟮膒l電勢變化。本文對于置換突變體的標記由字母 +數(shù)字+字母構(gòu)成。第一個字母標記野生型蛋白質(zhì)中的氨基酸。數(shù)字指的是做出氨基酸置換 的氨基酸位置，第二個字母標記用于置換野生型氨基酸的氨基酸。在本發(fā)明優(yōu)選的PhoS突 變中，275、107、109、110、262、265、266、309、313號賴氨酸殘基化)^單一或組合突變的形式 置換為谷氨酸化)或谷氨酷胺(Q)，另外，318號賴氨酸化)可W單一或組合突變的形式置換 為天冬氨酸（D)。優(yōu)選地，單一突變?yōu)镵262E、K26祀和K266E。優(yōu)選地，組合突變?yōu)镵265/266E 和K110/265/266E。更優(yōu)選地，所有突變都與連接于C端的多天冬氨酸(polyD)標簽相組合， 優(yōu)選地還與K318D置換相組合。在一個優(yōu)選的實施方式中，運些突變導致pi降低至少2個單 位。優(yōu)選地，本發(fā)明的突變將化oS的pi從7.2降低至大約4-大約5.5。在本發(fā)明的一個實施方 式中，使用突變polyD K318D、polyD K265/26犯和polyD K110/265/266E分別將大腸桿菌 化oS蛋白質(zhì)的pi從7.2降低至大約4.9、大約4.8W及大約4.5。
[0295] 編碼目的蛋白質(zhì)的多核巧酸可與另一種多膚融合的形式表達，另一種多膚優(yōu) 選地為信號序列或其他在成熟多膚的N端有特異性剪切位點的多膚。所選的異源信號序列 應當為可由宿主細胞識別并加工的序列。對于不能識別和加工原生或真核多膚信號序列的 原核宿主細胞，信號序列由原核信號序列置換。合適的信號序列包括0mpA、PhoA、LamB、 PelB、DsbA和DsbC。
[0296] 構(gòu)建包含一種或多種上文列出的組分的合適的載體采用了標準的連接技術(shù)。對分 離的質(zhì)粒或DNA片段進行剪切、加尾并再次連接為產(chǎn)生所需質(zhì)粒要求的形式。
[0297] 在一個實施方式中，本發(fā)明采用了表達盒，W攜帶編碼目的蛋白質(zhì)的多核巧酸，其 一般包含編碼一種或多種目的蛋白質(zhì)的一種或多種蛋白質(zhì)編碼序列及一種或多種調(diào)控表 達序列。所述一種或多種調(diào)控表達序列可包含啟動子。所述一種或多種調(diào)控表達序列還可 包含3'非翻譯區(qū)如終止序列。合適的啟動子在下文詳細討論。
[0298] 在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的細胞包含載體如質(zhì)粒。載體優(yōu)選地包含一個或 多個如上文所限定的表達盒。
[0299] 在目的蛋白質(zhì)為包含重鏈和輕鏈的抗體的實施方式中，可W用兩種載體轉(zhuǎn)染細胞 系，第一種載體編碼輕鏈多膚，第二種載體編碼重鏈多膚。備選地，可使用單一載體，此載體 包括編碼輕鏈和重鏈多膚的序列。
[0300] 用于本發(fā)明的載體可通過將如上文限定的一種或多種表達盒插入合適的載體而 產(chǎn)生。備選地，用于指導編碼目的蛋白質(zhì)的多核巧酸序列表達的調(diào)控表達序列可包含于載 體中，因此，完整地構(gòu)建載體只需要多核巧酸的編碼區(qū)域。
[0301] 可用來將根據(jù)本發(fā)明的多核巧酸轉(zhuǎn)化入宿主細胞的載體的實例包括：
[0302] ?質(zhì)粒，如地R322或PACYC184和/或
[0303] ?病毒載體如細菌隧菌體
[0304] ?轉(zhuǎn)座遺傳元件如轉(zhuǎn)座子
[030引有很多可用的表達載體形式。運些載體通常包含DNA復制的質(zhì)粒起點，由多克隆位 點（表達盒)分隔開的抗生素選擇性標記物、啟動子W和及轉(zhuǎn)錄終止子，W及編碼核糖體結(jié) 合位點的DNA序列。
[0306] 本發(fā)明采用的啟動子可直接與相關(guān)的多核巧酸相連，或備選地可位于恰當?shù)奈?置，例如位于載體中，使得當相關(guān)多核巧酸插入時，相關(guān)的啟動子可對其起作用。在一個實 施方式中，啟動子位于其作用的多核巧酸的編碼部分之前，例如，相關(guān)的啟動子在多核巧酸 的各個編碼部分之前。如本文所使用的，"在……之前"意為啟動子位于相對編碼多核巧酸 部分的5引物端。
[0307] 啟動子可W為宿主細胞內(nèi)源或外源的。合適的啟動子包括Lac、tac、trp、PhoA、 Ipp、Arab、Tet和T7。
[0308] -種或多種所采用的啟動子可W為可誘導啟動子。
[0309] 用于細菌系統(tǒng)的表達單位通常還包含化;[]1日-0日1旨日111〇(5.0.)序列，其可操作地連 接于編碼目的多膚的DNA。
[0310] 在其中的多核巧酸序列包含用于兩種或更多目的蛋白質(zhì)(例如抗體輕鏈和抗體重 鏈)的兩種或更多編碼序列的本發(fā)明的實施方式中，多核巧酸序列可包含一個或多個內(nèi)核 糖體插入位點（IRES)序列，其使得能夠在mRNA的中間起始翻譯。IRES序列可位于編碼多核 巧酸序列之間，W增強mRNA分別翻譯而產(chǎn)生多種編碼的多膚序列。
[0311] 表達載體優(yōu)選地還包含用于產(chǎn)生抗體或其抗原結(jié)合片段的雙順反子信息，如W0 03/048208或W02007/039714(其內(nèi)容并入本文作為參考）中所描述。優(yōu)選地，上游的順反子 包含編碼抗體輕鏈的DNA，下游順反子包括編碼對應的重鏈的DNA，雙順反子基因間序列 (IGS)優(yōu)選地包含選自 IGSUSEQ ID N0:34)、IGS2(沈Q ID N0:35)、IGS3(沈Q ID N0:36)和 1654(56910^:37)的序列。
[0312] 終止子可W是宿主細胞內(nèi)源或外源的。合適的終止子為rrnB。
[0313] 進一步的合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子包括啟動子和終止子，蛋白質(zhì)祀向方法可見于 ('Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in Escherichia coli，， Savvas C.Makrides,Microbiological 民eviews，Sept 1996,p 512-538。
[0314] 抗體分子可分泌自細胞或通過合適的信號序列進入細胞周質(zhì)。備選地，抗體分子 可在細胞的細胞質(zhì)內(nèi)積累。優(yōu)選地，抗體分子進入細胞周質(zhì)。
[0315] 只要相關(guān)方面能適用于運些實施方式，則本文描述的本發(fā)明的實施方式關(guān)于所述 多核巧酸方面對本發(fā)明備選實施方式同等適用，例如載體、表達盒和/或包含其中所采用的 組分的宿主細胞。
[0316] 根據(jù)本發(fā)明的第Ξ方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)目的重組蛋白質(zhì)的方法，包括在 如上文本發(fā)明的第一或第二方面所描述的革蘭氏陰性細菌細胞中表達目的重組蛋白質(zhì)。
[0317] 本發(fā)明的方法中優(yōu)選采用的革蘭氏陰性細菌細胞及目的蛋白質(zhì)已在上文詳細描 述。
[0318] 當編碼目的蛋白質(zhì)的多核巧酸是外源時，多核巧酸可使用任何本領(lǐng)域已知的合適 方式并入宿主細胞。一般地，多核巧酸作為轉(zhuǎn)化入細胞的表達載體的部分而并入。因此，在 一方面，根據(jù)本發(fā)明的細胞包含含有編碼目的蛋白質(zhì)的多核巧酸的表達盒。
[0319] 多核巧酸序列可使用標準技術(shù)轉(zhuǎn)化入細胞，如使用氯化鋼、PEG或電穿孔方法。
[0320] 根據(jù)本發(fā)明的方法還可采用選擇系統(tǒng)W促進對成功轉(zhuǎn)化有編碼目的蛋白質(zhì)的多 核巧酸的穩(wěn)定細胞進行選擇。選擇系統(tǒng)一般采用編碼選擇性標記物的多核巧酸共轉(zhuǎn)化。在 一個實施方式中，每種轉(zhuǎn)化入細胞的多核巧酸進一步包含編碼一種或多種選擇性標記物的 多核巧酸序列。因此，轉(zhuǎn)化編碼目的蛋白質(zhì)的多核巧酸W及編碼標記物的一種或多種多核 巧酸可同時發(fā)生，然后采用選擇系統(tǒng)W選擇產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)的細胞。
[0321] 能夠表達所述一種或多種標記物的細胞能夠在特定人工設置的條件下存活/生 長/擴增，例如在添加毒素或抗生素條件下，因為其中并入的多膚/基因或選擇系統(tǒng)的多膚 組分提供了某些特性(例如，抗生素抗性）。不能表達所述一種或多種標記物的那些細胞則 不能在運些人工設置的條件下存活/生長/擴增?？筛鶕?jù)需要選擇更嚴格或不那么嚴格的的 人工設置條件。
[0322] 本發(fā)明可采用任何合適的選擇系統(tǒng)。一般地，選擇系統(tǒng)可基于包括在載體中的一 種或多種提供對已知抗生素抗性的基因，例如四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素或氨節(jié)青霉素抗性 基因。選擇在相關(guān)抗生素存在下生長的細胞，因為其表達提供對抗生素抗性的基因 W及所 需要的蛋白質(zhì)。
[0323] 在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法進一步包括將轉(zhuǎn)化細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的 步驟，由此表達目的蛋白質(zhì)。
[0324] 在本發(fā)明中可使用可誘導表達系統(tǒng)或組成型啟動子W表達目的蛋白質(zhì)。合適的可 誘導表達系統(tǒng)W及組成型啟動子在本領(lǐng)域熟知。
[0325] 可使用任何適合的培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細胞。可為具體的選擇系統(tǒng)采用恰當?shù)呐囵B(yǎng) 基，例如培養(yǎng)基可W包含抗生素 W使只有已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化的細胞能夠在培養(yǎng)基中生長。
[0326] 根據(jù)需要，可對獲自培養(yǎng)基的細胞進行進一步的篩選和/或純化。根據(jù)需要，此方 法可進一步包括一個或多個提取及純化目的蛋白質(zhì)的步驟。
[0327] 可從菌株中回收多膚，包括從細胞質(zhì)、細胞周質(zhì)或上清中。
[0328] 用于純化蛋白質(zhì)的具體方法取決于蛋白質(zhì)類型。合適的方法包括在免疫親和或離 子交換柱上的分級；乙醇沉淀;反相HPLC;疏水相互作用色譜;娃色譜;離子交換樹脂色譜如 S-SEPHAR0SE和DEAE;層析聚焦;硫酸錠沉淀；W及凝膠過濾。
[0329] 可通過常規(guī)抗體純化步驟，合適地將抗體與培養(yǎng)基和/或細胞質(zhì)提取物和/或細胞 周質(zhì)提取物分離，例如，通過蛋白質(zhì)A-瓊脂糖凝膠、蛋白質(zhì)G色譜，蛋白質(zhì)L色譜，嗜硫的、混 合形式的樹脂，His-標簽，F(xiàn)LAG標簽，徑憐灰石色譜，凝膠電泳，透析，親和色譜，硫酸錠、乙 醇或PEG分級/沉淀，離子交換膜，擴張的床吸附色譜化BA)或模擬移動床色譜。
[0330] 所述方法還可W包括進一步的步驟，測量目的蛋白質(zhì)表達的量W及選擇具有高表 達水平的目的蛋白質(zhì)的細胞。
[0331] 此方法還可包括一個或多個其他下游加工步驟，如對目的蛋白質(zhì)如抗體或抗體片 段進行PEG化。
[0332] 本文所描述的一個或多個方法步驟可在合適的容器如生物反應器中組合進行。 實施例
[033引 實施例1-產(chǎn)生細胞菌株MXE00U ATsp)
[0334] 通過如下方法產(chǎn)生MXE001菌株：
[033引將Tsp盒WSal I、Not I限制性片段的形式移至進行了類似的限制性酶切的ρΚ03 質(zhì)粒內(nèi)。地03質(zhì)粒使用pSClOl的溫度敏感型突變體的復制起點(RepA)W及氯霉素標記物W 加強和選擇染色體整合事件。編碼果聚糖薦糖酶的sacB基因?qū)ιL于薦糖上的大腸桿菌是 致死的，因此(與氯霉素標記物及pSClOl起點一同）用于加強并選擇去整合W及質(zhì)粒消除。 此方法理論在之前有所描述化ami 1 ton等人，1989 Journal of Bacteriology, 171,4617-4622?及Blomfield等人，1991 ,Molecular Microbiology ,5,1447-1457)。除了插入的基因 之外，ρΚ03系統(tǒng)將所有選擇性標記物從宿主基因組移除。
[0336] 構(gòu)建了 W下質(zhì)粒。
[0337] ΡΜΧΕ191:包含如沈Q ID NO: 3所示的敲除突變的Tsp基因，其包含EcoR I和Ase I 限制性標記物。
[033引然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入電感受態(tài)大腸桿菌W3110細胞，其使用Methods in Molecular Biology,VO1.47,化ckoloff'J.A.(ed.)'Humana Press,Totowa,NJ,105(1995)中Miller, E.M.和化ckoloff,J.A. , "Escherichia coli electrotransformation"的方法進行制備。
[0339] 第1天將40μ1的大腸桿菌細胞與（1化gHwl的地03DNA混合于冰冷的BioRad 0.2cm 電穿孔小杯，然后W2500V、25μΡ、200 Ω進行電穿孔。立即加入ΙΟΟΟμΙ的2χΡΥ，細胞在培養(yǎng)箱 中30°C下、250rpm搖1小時進行復蘇。將細胞進行1/10的系列稀釋在2χΡΥ中，然后將10化1的 等分試樣鋪于30°C和43°C下預熱的、含有20μg/ml氯霉素的2χΡΥ瓊脂平板。將平板在30°C和 43°C下解育過夜。
[0340] 第2天在30°C下生長的菌落數(shù)量給出電穿孔效率的估算值，而在43°C下存活生長 的菌落代表潛在的整合事件。挑取43°C平板上的單一菌落并重懸于10ml的2χΡΥ中。將10化1 的懸液鋪于含有5%(w/v)薦糖并預熱到30°C的2χΡΥ瓊脂平板上W產(chǎn)生單菌落。將平板在30 °C解育過夜。
[0341] 第3天此時的菌落代表了潛在的自發(fā)去整合及質(zhì)粒消除的事件。如果去整合和消 除事件在生長早期發(fā)生，則所述克隆實體的大部分是純系的（clonal)。挑取單一菌落并將 其復制物鋪于含有20μg/ml氯霉素或5%(w/v)薦糖的2χΡΥ瓊脂平板。將平板在30°C下解育 過夜。
[0342] 第4天在薦糖上生長且在氯霉素中死亡的菌落代表了潛在的染色體置換和質(zhì)粒消 除事件。挑取運些菌落并通過使用突變特異性寡核巧酸的PCR進行篩選。將產(chǎn)生具有正確大 小陽性PCR條帶的菌落劃線至含有5%(w/v)薦糖的2χΡΥ瓊脂平板上并將平板在30°C解育過 夜產(chǎn)生單一菌落。
[0343] 第5天使用PCR陽性、氯霉素敏感型W及薦糖抵抗型大腸桿菌的單菌落制作甘油膽 備株，制作化學感受態(tài)細胞并用作PCR模板用于使用5 '和3 '兩側(cè)的寡核巧酸的PCR反應，W 產(chǎn)生PCR產(chǎn)物用于使用化q聚合酶的直接的DNA測序。
[0344] 通過對包含非天然發(fā)生Ase I限制性位點的Tsp基因區(qū)域(如圖laUbUc所示)使 用寡核巧酸引物進行PCR擴增，W測試細胞菌株MXEOOm確認基因組DNA是否成功修飾為攜 帶突變的Tsp基因。隨后將擴增的DNA區(qū)域與限制性酶Ase I解育，然后通過瓊脂糖凝膠電泳 分析解育之前和解育之后DNA所擴增的區(qū)域W確認非天然發(fā)生的Ase I限制性位點是否存 在于突變的基因中。此方法按如下步驟進行：
[0345] 使用PCR及W下寡核巧酸對從MXE001和W3110的大腸桿菌細胞裂解物的制備的基 因組DNA進行擴增：
[0346] 6284 Tsp 3' 5'-GCATCATAATTTTCTTTTTACCTC-3' （沈Q ID N0:15)
[0347] 6283 Tsp 5' 5'-GGGAAATGAACCTGAGCAAAACGC-3' （沈Q ID N0:16)
[0348] 通過將單克隆細胞在20ul lx PCR緩沖液中于95°C下加熱10分鐘制備裂解物。使 混合物冷卻至室溫，然后在13,20化pm下離屯、10分鐘。移除上清并貼上"細胞裂解物"的標 簽。
[0349] 使用Tsp寡核巧酸對擴增各菌株。
[0巧0] 使用標準PCR步驟擴增DNA。 5山 緩沖液Χ?ο (Roche) 1山 dNTF混合物 （Ro油色，lOmM mix ) l.Sul 5'寡核普酸（5 pmol )
[0；351] 1.5ul 3,寡攝魯酸（度pmol) 2山 細胞裂解物 0 5ul Taq DNA 聚合酶（Roche 5U/UI)
[0巧2] 38.5ul Η 20
[0巧3] PCR循環(huán)。 94： V. 1分種 941分鐘）
[0354] 55 V. 1分種）重復裝行30個猶環(huán) 721分鐘) 72 ? 1。分鐘
[0巧引反應完成時，將25ul移至新離屯、管用Ase I進行消化。向25ul的PCR反應物中加入 19ul的肥0、5ul緩沖液3(肥B)、lul的Ase I(肥B)，混合，在37°C下解育2小時。
[0356] 向余下的PCR反應物中加入加1上樣緩沖液(x6)，取出20ul上樣于0.8%TAE 200ml 瓊脂糖凝膠（Invitrogen)加漠化乙錠(5ul的lOmg/ml儲備液）上，并于100伏電泳1小時。最 后一個泳道上樣lOul的分子量標記物(Perfect DNA marker 0. l-12Kb,Novagen)。
[0357] 在Ase I消化完成時，加入lOul上樣緩沖液(x6)，取20ul上樣于0.8%TAE瓊脂糖凝 膠（1]1￥；[化0旨日]1)加漠化乙錠(；5111的1〇111旨/1111儲備液)上并于100伏下電泳1小時。最后一個泳 道加入了lOul的分子量標記物（Perfect DNA marker 0.1-12肺，Novagen)。兩塊膠都使用 UV透照儀進行觀察。
[0巧引擴增的基因組片段顯示Tsp的正確條帶大小，2.8化。WAse I消化后確認了在Tsp 缺陷菌株MXE001中存在有引入的Ase I限制性位點，而在W3110對照中沒有。
[0巧9] 1乂6〇〇1:使用了3口引物組擴增的基因組〇魁，并將產(chǎn)生的〇魁用430 1消化，產(chǎn)生2.2 和0.6肺的條帶。
[0360] W3110PCR擴增的DNA無法由Ase I限制性酶進行消化。 巧361] 實施例2-產(chǎn)生spr突變體
[0362]使用互補測定法產(chǎn)生并選擇spr突變。
[036引使用Oonteeh?隨機誘變多樣性PCR試劑盒將S pr基因突變，該試劑盒在每 lOOObp引入1-2個突變。將突變的spr PCR DNA克隆入表達CDP87(Fab'及spr突變體的可誘 導表達載體[ρΤΤΟ CDP870]。然后將此連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至使用Miller，E.M.和Nickoloff， J.A.,"Escherichia coli electrotransformation,"在Methods in Molecular Biology, vol .47 ,Nickoloff, J.A. (ed.),Humana Press ,Totowa,NJ, 105(1995)中的方法制備的大腸 桿菌菌株MXEOO1 ( Δ Tsp)。使用W下的操作流程:將40ul的電感受態(tài)MXEOO1、2.5ul的連接產(chǎn) 物（lOOpg的DNA)加入0.2cm的電穿孔小杯，使用BioRad Genepulser Xcell在250〇ν、25μΡ、 200 Ω的條件下進行電轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化后，加入1ml的S0C(Invitrogen)(預熱至37°C)并對細胞 輕柔搖動，使之在37°C下復蘇1小時。
[0364] 將細胞鋪于低滲瓊脂糖巧g/L酵母提取物、2.5g/L蛋白腺、15g/L瓊脂(皆為Di f CO) 并于40°C解育。將形成菌落的細胞在43°C下重新鋪于化BW確認MXEOOl菌株重新獲得了在 高溫低滲條件下生長的能力。從所選的克隆制備質(zhì)粒DNA并對其測序W鑒定spr突變。
[0365] 使用此方法分離出與ATsp表型互補的spr蛋白質(zhì)的八個單一突變、一個雙突變W 及兩個多重突變，如下：
[0366] 1.V98E
[0367] 2.D133A
[0368] 3.V13抓
[0369] 4.V135G
[0370] 5.G147C
[0371] 6.S95F和Y115F
[0372] 7.I70T
[0373] 8.N31T、Q73R、R100G、G140C
[0374] 9.R62C、Q99P、R144C
[0375] 10丄108S
[0376] 11丄136P
[0377] 實施例3-產(chǎn)生攜帶spr突變的突變體大腸桿菌細胞菌株
[0378] 使用實施例2中鑒定的1-5號個體突變W及Ξ個催化Ξ分子突變（C94A，H145A， H157A)和W174R產(chǎn)生新菌株，使用野生型W3110大腸桿菌菌株（基因型：F-LAM-IN(rrnD-rrnE) Irphl (ATCC號27325))產(chǎn)生spr突變菌株或使用來自實施例1的MXE001菌株產(chǎn)生Δ Tsp/突變spr組合突變菌株。
[0379] W下突變體大腸桿菌細胞菌株是使用基因置換載體系統(tǒng)產(chǎn)生的，使用的是地03同 源重組/置換質(zhì)?；痠nk等人，1997 Journal of Bacteriology，179，6228-6237)，如實施例 1中用于產(chǎn)生MXE001的方法。
[0380] 表1.
[0381]
[0382] ~突變體spr整合盒WSal I、Not I限制性片段形式移至進行了類似限制性酶切的' 地03質(zhì)粒。
[0383] 所述質(zhì)粒使用pSClOl的溫度敏感型突變體的復制起點（RepA)W及氯霉素標記物 W加強并選擇染色體整合事件。編碼果聚糖薦糖酶的sacB基因?qū)ιL于薦糖上的大腸桿菌 是致死的，因此(與氯霉素標記物及pSClOl起點一同）用于加強和選擇去整合W及質(zhì)粒消除 事件。此方法理論在之前有所描述化ami 1 ton等人，