1989 Journal of Bacteriology, 171, 4617-4622 and Blomfield等人，1991,Molecular Microbiology,5,1447-1457)。除了插入 的基因之外，ρΚ03系統(tǒng)將所有選擇性標記物從宿主基因組移除。
[0384] 構(gòu)建了下文列出的ρΚ03載體，其包含突變的spr基因，包括spr序列內(nèi)移除了用于 克隆鑒定的Sail限制性位點的沉默突變。
[0385] pMXE336、pK03spr S95F(-SalI)
[0386] pMXE337、pK03spr Y115F(-SalI)
[0387] pMXE338、pK03spr G147C(-SalI)
[038引 pMXE339、pK03spr D133A(-SalI)
[0389] pMXE340、pK03spr V135D(-SalI)
[0390] pMXE34UpK03spr V135G(-SalI)
[0391] pMXE342、pK03spr V98E(-SalI)
[0392] pMXE343、pK03spr C94A(-SalI)
[0393] pMXE344、pK03spr H145A(-SalI)
[0394] pMXE345、pK03spr H157A(-SalI)
[0395] pMXE346、pK03spr W174R(-SalI)
[0396] 然后使用Methods in Molecular Biology , vol. 47 ,Nickoloff, J .A. (ed.), Humana Press, Totowa,NJ, 105 (1995)中Miller, E.M.和化 ckoloff, J. A.，Escherichia coli elec化otransformation"的方法將運些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入化學感受態(tài)大腸桿菌W3110細胞 中，或轉(zhuǎn)化入來自實施例1的MXE001菌株W產(chǎn)生Δ Tsp/突變spr組合突變菌株，如表1所示。
[0397] 第1天將40μ1的電感受態(tài)大腸桿菌細胞或MXE001細胞與（1化gHwl的地03DNA混合 于冰冷的BioRad 0.2cm電穿孔小杯，然后W2500V、25μF、200Ω進行電穿孔。立即加入1000μ 1的2χΡΥ，細胞在培養(yǎng)箱中30°C下、250rpm搖1小時進行復蘇。將細胞進行1/10的系列稀釋在 2χΡΥ中，然后將10化1的等分試樣鋪于30°C和43°C下預熱的含有20μg/ml氯霉素的2χΡΥ瓊脂 平板。將平板在30°C和43°C下解育過夜。
[0398] 第2天在30°C下生長的菌落數(shù)量給出電穿孔效率的估算值，而在43°C下存活生長 的菌落代表潛在的整合事件。挑取43°C平板上的單一菌落并重懸于10ml的2χΡΥ。將10化1的 懸液鋪于含有5%(w/v)薦糖并預熱到30°C的2χΡΥ瓊脂平板上W產(chǎn)生單克隆。將平板在30°C 解育過夜。
[0399] 第3天此時的菌落代表了潛在的自發(fā)去整合及質(zhì)粒消除的事件。如果去整合和消 除事件在生長早期發(fā)生，則所述克隆實體的大部分是純系的。挑取單一菌落并將其復制物 鋪于含有20μg/ml氯霉素或5%(w/v)薦糖的2χΡΥ瓊脂平板。將平板在30°C下解育過夜。
[0400] 第4天在薦糖上生長且在氯霉素中死亡的菌落代表了潛在的染色體置換和質(zhì)粒消 除事件。挑取運些菌落并W進行PCR篩選且進行限制性消化檢測Sail位點的喪失情況。將產(chǎn) 生具有正確大小陽性PCR條帶并抵抗Sail消化的菌落劃線至含有5%(w/v)薦糖的2χΡΥ瓊脂 平板上并將平板在30°C解育過夜產(chǎn)生單一菌落。
[0401] 第5天使用PCR陽性、氯霉素敏感型W及薦糖抵抗型大腸桿菌的單菌落制作甘油膽 藏株，制作化學感受態(tài)細胞并用作PCR模板用于使用5 '和3 '兩側(cè)的寡核巧酸的PCR反應，W 產(chǎn)生PCR產(chǎn)物用于使用化q聚合酶的直接的DNA測序，來驗證正確的突變。
[0402] 實施例4-spr突變體菌株中抗-TNF化b'的表達
[0403] 用質(zhì)粒pMXE117(pTT0 CDP870 IGS2)轉(zhuǎn)化實施例3中提供的spr突變體菌株 MXE008、MXE009、MXE012及MXE017 W及實施例1中提供的MXE001菌株，該質(zhì)粒為CDP87(Fab ' (一種具有如SEQ ID NO: 13所示的輕鏈序列及如SEQ ID NO: 14所示的重鏈序列的抗-TNF Fab'）表達載體，是使用見于Sambrook等人 1989,Molecular cloning:a laboratoiT manual.CSHL press,Ν.Υ的常規(guī)限制性克隆方法理論構(gòu)建的。質(zhì)粒pMXE117(pTT0 CDP870或 40.4IGS17)包含W下特征:強啟動子tac及l(fā)ac操縱子序列。Fab輕鏈和重鏈基因轉(zhuǎn)錄為單個 雙順反子信息。編碼來自大腸桿菌OmpA蛋白質(zhì)的信號膚(其引導多膚易位進入大腸桿菌細 胞周質(zhì)）的DNA基因與輕鏈和重鏈基因序列各自的5'末端融合。使用雙重轉(zhuǎn)錄終止子rrnB tlt2終止轉(zhuǎn)錄。laclq基因編碼組成型表達的Lac I抑制子蛋白質(zhì)。運樣，tac啟動子的轉(zhuǎn)錄 一直受到抑制直到加入異乳糖或IPTG而誘導去抑制。所使用的復制起點為P15A，運維持了 低的拷貝數(shù)量。質(zhì)粒包含四環(huán)素抗性基因 w用于抗生素篩選。
[0404] 使用Chung C.T等人Transformation and storage of bacterial cells in the same solution.PNAS 86:2172-2175( 1989)中的方法對菌株進行轉(zhuǎn)化。
[040引實施例5-用搖瓶培養(yǎng)在突變的大腸桿菌菌株中表達抗-TNFa化b'
[0406 ] 在搖瓶實驗中測試spr突變體菌株MXE008、MXE009、MXE012和MXE017等菌株W比較 其相對于W3110及MXE001的生長和抗-TN陽化b'的表達。
[0407] 所使用的搖瓶實驗操作流程如下進行：
[0408] 5ml搖瓶實驗
[0409] 挑取單菌落接入5ml含有l(wèi)Oug/ml四環(huán)素的LB中并在30°C下W25化pm搖動生長過 夜。
[0410] 用過夜培養(yǎng)物接種至100ml含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中至0.10化00。（即，對于4的0D， 100/4x01 = 100ml 中加入 2.5mls)
[0411] 使用此主培養(yǎng)物為每個所需的時間點設(shè)置3x5ml的培養(yǎng)管。取1個參考培養(yǎng)物作為 測量0D的樣品。
[0412] 在30°C下W 25化pm搖動培養(yǎng)物，起初通過觀察檢測生長概況，然后取參考培養(yǎng)物 樣品獲得0.5OD600的培養(yǎng)物(通常大約2小時）。一旦培養(yǎng)物達到超過0.50D時，將IPTG加入各 培養(yǎng)管至濃度為200uM(0.04M取25ul)。
[0413] 在所需的時間點例如1小時、2小時、誘導后，取出培養(yǎng)管并置于冰上。
[0414] 在Wl3,200巧m離屯、5分鐘后，用200ul的細胞周質(zhì)提取緩沖液（lOOmM Tris.Cl/ lOmM EDTA pH 7.4)重懸細胞沉淀。將細胞周質(zhì)提取物在30°(3下^25化9111搖動過夜。第二 天，將提取物在13，200rpm下離屯、10分鐘，棄去上清并保存于-20°C，標記為"細胞周質(zhì)提取 物"。棄去用過的細胞沉淀。
[041 引 ELISA 定量。
[0416] 在4°C下用PBS中化gml-1的AB14U兔抗人CH1，UCB)將96孔化ISA平板包被過夜。在 W300ul的樣品/綴合物緩沖液(PBS、BSA 0.2%(w/v)、Tween 20 0.1%(v/v))洗涂3次后， 在平板上用1〇化1的樣品/綴合物緩沖液對樣品和標準品進行1/2的系列稀釋，將平板于室 溫下W250r. P. m搖動1小時。W300ul的洗涂緩沖液(PBS，Tween 20 0.1 % (v/v))洗涂3次 后，W樣品/綴合物緩沖液進行1/1000的稀釋，加入1〇化1的展示抗體6062(綴合的兔抗人K HRP，The Binding Site，Birmin曲am，U.K.)。然后將平板于室溫下 W250r.P.m搖動 1小時。 W300ul的洗涂緩沖液洗涂3次后，加入10化1的TMB底物(TMB溶液(化化iochem):地20的50: 50混合物)并使用自動平板讀數(shù)儀記錄A630。細胞周質(zhì)提取物中化b'的濃度通過與純化的合 適同種型化b '標準品比較而計算。
[0417] 圖1顯示相比于野生型W3110和MXE001，MXE008和MXE009的生長得到改善。
[041引圖2顯示相比于野生型W3110和MXE001，來自MXE008和MXE009菌株的化b'的表達得 到改善。
[0419] 圖5顯示相比于野生型W3110和MXE001，MXE0012和MXE017的生長得到改善。
[0420] 圖6顯示相比于野生型W3110和MXE001，MXE0012和MXE017的化b'的表達得到改善。 [04引]實施例6-使用高密度發(fā)酵的spr突變的大腸桿菌菌株的生長及突變大腸桿菌菌 株中化b'的表達
[0422] W質(zhì)粒PMXE117轉(zhuǎn)化菌株]\?6008，]\?6009，]\?6001及野生型￥3110細胞，在發(fā)酵實驗 中進行測試W比較其生長和抗-TN陽化b'的表達。
[0423] 生長培養(yǎng)基
[0424] 發(fā)酵生長培養(yǎng)基基于SM6E培養(yǎng)基（描述于Humphreys等人，2002, Protein E邱ression and Purification,26,309-320)，添加了3.86g/l 化出PO4.H2O及 112g/l的甘 油。
[0425] 接種。接種培養(yǎng)物生長于相同的培養(yǎng)基，其中補充了 10μg/ml的四環(huán)素。培養(yǎng)物在 30°C下攬拌解育約22小時。
[0426] 發(fā)酵。用接種培養(yǎng)物接種入發(fā)酵罐(總體積2.5升)達到0.3-0.50化00。在生長期將 溫度維持在30°C，到誘導前降低至25°C。通過不斷變化攬拌和氣流，使溶解氧濃度控制在超 過30 %的空氣飽和度。通過W15 % (v/v)NH40H和10 % (v/v)濃度的此S〇4自動滴定使培養(yǎng)物 的抑控制在7.0。通過添加10%(v/v)Str址tol J673溶液（Schill和Seilacher)控制泡沫產(chǎn) 生。在發(fā)酵不同階段添加不同的添加物。當生物質(zhì)濃度達到大約40OD600時，添加儀鹽及 化此P〇4.此0。在誘導期之前和之內(nèi)進一步添加化此P〇4.此0 W保證憐酸鹽過量。當發(fā)酵開始 存在的甘油耗盡后(大約75OD600)，連續(xù)進料80%(w/w)的甘油。在發(fā)酵中所述相同時間點W 170μΜ進行IPTG進料。IPTG進料的開始被認為是誘導的開始。一般地，發(fā)酵W甘油進料速率 (范圍為0.5-2.5ml/h)進行64-120小時。
[0427] 生物質(zhì)濃度和生長速率的測量。生物質(zhì)濃度是通過測量600nm處培養(yǎng)物的光學密 度而確定的。
[0428] 細胞周質(zhì)提取。通過離屯、從培養(yǎng)物樣品中收集細胞。保留上清級分(于-20°C)用于 進一步分析。細胞沉淀級分W原始培養(yǎng)物體積重懸于提取緩沖液（lOOmM Tris-HCl，lOmM EDTA;抑7.4)。在60°C下解育約16小時后，離屯、提取物使之澄清，保留上清部分(于-20°C) 用于分析。
[0429] 化b'定量。細胞周質(zhì)提取物及培養(yǎng)物上清中的化b'濃度通過化b'裝聯(lián)化ISA(其在 Humphreys等人，2002,Protein Expression and Purification,26,309-320中有所描述） W及使用蛋白質(zhì)G hplc進行測定。將分析物(大約為中性抑、30°C，經(jīng)0.2um過濾）W2ml/min 加樣于Hihap蛋白質(zhì)-G HP 1ml柱子(GE-Healthcare或同等產(chǎn)品），用20mM憐酸、50mM化Cl pH7.4洗涂柱子，然后注入50mMGlycine/HClpH2.7洗脫Fab'。通過在Agilentl100 或 1200HPLC系統(tǒng)上的A280而測量洗脫的化b'，并通過對照已知濃度的純化化b'蛋白質(zhì)的標準 曲線進行定量。
[0430] 圖3顯示了MXE008和MXE009相比于對照W3110和MXE001的生長概況，顯示對于 MXE001，MXE008和MXE009在起初~26小時內(nèi)其生長概況基本相同，都高于W3110。在~26小 時后，MXE001的生長速率由于細胞裂解而下降。然而，spr突變體細胞菌株MXE008和MXE009 持續(xù)顯示出良好的生長速率，在26小時后仍無裂解。
[0431 ] 圖4顯示了相比于對照W3110和MXE001，來自大腸桿菌菌株MXE008和MXE009的細胞 周質(zhì)（陰影標記似及上清（空屯、非陰影標記）的總化b'產(chǎn)量。MXE008和MXE009菌株相比于 MXE001和W3110顯示了更高的細胞周質(zhì)化b'表達。進一步地，MXE001W及MXE008和MXE009相 比于MXE001顯示了較低的上清化b '水平，運顯示出相比于MXE001，MXE008和MXE009的細胞 裂解降低。.
[0432] 圖7顯示了在生產(chǎn)化b'的發(fā)酵過程中MXEOOl和MXE008的生長概況。數(shù)據(jù)表明在生 物質(zhì)積累過程中，Atsp spr突變體菌株MXE008相對Atsp菌株MXE001在起始生長速率上有 少量增加，而在最后~20小時的發(fā)酵中，相對于MXE001菌株，MXE008的存活情況有非常顯著 的增加。
[0433] 圖8顯示了在生產(chǎn)化b'的發(fā)酵過程中W3110、MXE001( Atsp)和MXE008( Atsp spr D112A)的細胞周質(zhì)化b'積累（實線和實屯、標記及培養(yǎng)基化b'積累（虛線和空屯、標記）。數(shù) 據(jù)表明相對于MXE001菌株，MXE008菌株的起始細胞周質(zhì)化b'積累有少量增加，運一點在 化b'積累期的后半程變得更突出。對MXE001中的Δ tsp突變加上MXE008中的spr突變幾乎消 解了 Δ tsp MXE001菌株中觀察到的"滲漏"表型。此種改良的表現(xiàn)使得MXE008菌株相對于 MXE001菌株有了更高的細胞周質(zhì)產(chǎn)出，且相對于MXE001菌株，MXE008滲漏入培養(yǎng)基的化b' 積累降低。
[0434] 實施例7-確定菌株中DNA滲漏情況及總蛋白量 [04巧]dsDNA 測定：
[0436] 使用Quant-IT Picogreen dsDNA測定試劑盒（Invit;rogen，Ref:P11496)確定 W3110、MXE001、MXE008和ΜΧΕΟ12菌株滲漏入上清的雙鏈DNA。將所提供的DNA標準品稀釋到 1-lOOOng/mL的范圍，制作標準曲線。將樣品稀釋于TE緩沖液，W使巧光讀數(shù)處于此方法的 線性范圍之內(nèi)（500-1000倍）。在96-孔板中，將lOOiiL的稀釋的樣品或標準品與100化的 Picogreen反應劑混合，將平板在室溫下避光解育5分鐘。使用485皿激發(fā)濾片W及535nm的 發(fā)射濾片對巧光數(shù)進行0.1s的測量。結(jié)果示于圖9。
[0437] 蛋白質(zhì)測定：
[0438] 使用Coomassie Plus Radford測定試劑盒（Pierce,Ref:23236)測定W3110、 MXE001、MXE008和MXE012菌株中總蛋白質(zhì)的濃度。通過將牛血清白蛋白標準品稀釋至25-lOOOyg/mL的范圍制作標準曲線。將樣品稀釋于水中W使光學密度處于此方法的線性范圍 (5-10倍）內(nèi)，將33化的樣品或標準品與ImL考馬斯反應劑混合。室溫下解育10分鐘后，在分 光光度計上讀出0D595?值，使用考馬斯反應劑作為空白對照?？偟鞍踪|(zhì)的濃度根據(jù)標準曲線 進行計算。結(jié)果顯示于圖10。
[0439] 對于優(yōu)選的實施方式本發(fā)明具體地對其進行了顯示和描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員 應當理解的是可作出形式及細節(jié)上的多種變化而不偏離附隨的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明 的范圍。
【主權(quán)項】
1. 重組革蘭氏陰性細菌細胞，其包含突變體spr基因，所述突變體spr基因編碼在選自 D133、H145、H157、N31、R62、I70、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、V135、L136、G140、 R144和G147的一個或多個氨基酸處具有突變的spr蛋白質(zhì)，且其中細胞具有相比于野生型 細胞降低的Tsp蛋白質(zhì)活性。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的細胞，其中所述突變體spr基因編碼的spr蛋白質(zhì)具有一個或多個 選自 D133A、H145A、H157A、N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、 ￥115卩、￥1350、￥1356、1^136卩、6140(：、1?144(：和6147(：的突變。3. 根據(jù)權(quán)利要求2的細胞，其中所述突變體spr基因編碼的spr蛋白質(zhì)具有一個或多個 選自 S95F、V98E、Y115F、D133A、V135D、V135G和G147C的突變。4. 根據(jù)權(quán)利要求3的細胞，其中所述突變體spr基因編碼的spr蛋白質(zhì)具有突變S95F和 Y115F〇5. 根據(jù)權(quán)利要求2的細胞，其中所述突變體spr基因編碼的spr蛋白質(zhì)具有選自D133A， H145A和H157A的突變。6. 根據(jù)任何前述權(quán)利要求的細胞，其中所述細胞進一步包含一種或多種以下突變的基 因： a. 編碼具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白質(zhì)的突變的DegP基因； b. 突變的ptr基因，其中所述突變的ptr基因編碼具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III 蛋白質(zhì)或為敲除突變的ptr基因；以及 c. 突變的OmpT基因，其中所述突變的OmpT基因編碼具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白 質(zhì)或為敲除突變的OmpT基因。7. 根據(jù)任何前述權(quán)利要求的細胞，其中所述細胞包含突變的Tsp基因，其編碼具有降低 的蛋白酶活性的Tsp蛋白質(zhì)或為敲除突變的Tsp基因。8. 根據(jù)權(quán)利要求7的細胞，其中除了突變的spr基因以及突變的Tsp基因以外，所述細胞 基因組與野生型細菌細胞是同基因的。9. 重組革蘭氏陰性細菌細胞，其具有相比于野生型細胞降低的Tsp蛋白質(zhì)活性，和突變 體spr基因，所述突變體spr基因編碼能夠抑制包含突變的Tsp基因的細胞表型的spr蛋白 質(zhì)，其中除了使Tsp蛋白質(zhì)活性相比于野生型細胞降低所需的修飾以及突變的spr基因以 外，細胞基因組與野生型細菌細胞是同基因的。10. 根據(jù)權(quán)利要求9的細胞，其中突變體spr基因編碼的spr蛋白質(zhì)具有一個或多個選自 N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D、V135G、 1^136卩、6140(：、1?144(：、!1145厶、6147(：、!1157厶和機741?的突變。11. 根據(jù)權(quán)利要求10的細胞，其中突變體spr基因編碼的spr蛋白質(zhì)具有一個或多個如 權(quán)利要求1 -5中任何一項限定的突變。12. 根據(jù)任何前述權(quán)利要求的細胞，其中所述細胞具有敲除突變的Tsp基因，其包含對 基因起始密碼子的突變和/或一個或多個位于基因起始密碼子下游、基因終止密碼子上游 的終止密碼子。13. 根據(jù)權(quán)利要求12的細胞，其中敲除突變的Tsp基因包含對基因起始密碼子的錯義突 變產(chǎn)生的限制性標記物位點以及可選地包括一個或多個其他點突變。14. 根據(jù)權(quán)利要求13的細胞，其中敲除突變的Tsp基因包含SEQ ID N0:3。15. 根據(jù)任何前述權(quán)利要求的細胞，其中所述細胞為大腸桿菌。16. 根據(jù)任何前述權(quán)利要求的細胞，其中所述細胞包含編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序 列。17. 根據(jù)權(quán)利要求16的細胞，其中所述目的蛋白質(zhì)為抗體或其抗原結(jié)合片段。18. 根據(jù)權(quán)利要求17的細胞，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段對TNF具有特異性。19. 重組革蘭氏陰性細菌細胞，其具有相比于野生型細胞降低的Tsp蛋白質(zhì)活性并包含 編碼突變體spr蛋白質(zhì)的突變的spr基因以及編碼對TNF具有特異性的抗體或其抗原結(jié)合片 段的多核苷酸序列。20. 根據(jù)權(quán)利要求19的細胞，其中所述細胞包含突變的Tsp基因，其編碼具有降低的蛋 白酶活性的Tsp蛋白質(zhì)或為敲除突變的Tsp基因。21. 用于生產(chǎn)目的重組蛋白質(zhì)的方法，包括于培養(yǎng)基中在有效表達目的重組蛋白質(zhì)的 條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求1-20中任何一項限定的重組革蘭氏陰性細菌細胞，以及從所述重組 革蘭氏陰性細菌細胞的細胞周質(zhì)和/或培養(yǎng)基中回收目的重組蛋白質(zhì)。22. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述方法進一步包括從細胞中回收目的蛋白質(zhì)。23. 根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中目的蛋白質(zhì)回收自細胞周質(zhì)和/或上清。
【專利摘要】本發(fā)明提供了重組革蘭氏陰性細菌細胞，其包含突變的SPR基因，所述突變的spr基因編碼在選自D133、H145、H157、N31、R62、I70、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、V135、L136、G140、R144和G147的一個或多個氨基酸處具有突變的spr蛋白質(zhì)，且其中細胞具有相比于野生型細胞降低的Tsp蛋白質(zhì)活性。
【IPC分類】C12P21/02, C12N1/21, C12R1/19
【公開號】CN105505845
【申請?zhí)枴緾N201510999982
【發(fā)明人】M·愛麗絲, D·P·漢弗萊斯
【申請人】Ucb醫(yī)藥有限公司
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2011年1月13日
【公告號】CA2786335A1, CN102762732A, CN102762732B, EP2524043A1, EP2524043B1, US8969039, US20120295309, US20150132828, WO2011086136A1