米曲霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種米曲霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型篩選的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]絲狀真菌米曲霉生長迅速、易于培養(yǎng)，并且有很高的蛋白質(zhì)分泌能力，能夠正確進行各種翻譯后加工，并且與高等真核生物類似。米曲霉又是公認(rèn)的食品安全生產(chǎn)菌株，發(fā)酵及后處理技術(shù)成熟，因此它除了在發(fā)酵工業(yè)中被用于生產(chǎn)初級、次級代謝產(chǎn)物及酶類產(chǎn)品夕卜，常常成為進行基因表達和蛋白分泌研究的理想對象為了將待表達的基因?qū)朊浊怪?，首先需要建立一個穩(wěn)定有效的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。建立米曲霉基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)主要從受體細(xì)胞、遺傳轉(zhuǎn)化法和選擇性標(biāo)記選擇等方面考慮。米曲霉堅硬的細(xì)胞壁是遺傳轉(zhuǎn)化的主要障礙，所以轉(zhuǎn)化時一般以原生質(zhì)體作為受體細(xì)胞，制備原生質(zhì)體的材料包括幼嫩菌絲、分生孢子和擔(dān)孢子。通常用于米曲霉遺傳轉(zhuǎn)化的方法有PEG/CaC12法、電擊轉(zhuǎn)化及基因槍轉(zhuǎn)化法等，其中PEG/CaC12法由于操作難度小、原生質(zhì)體做為受體細(xì)胞具有群體數(shù)量大、容易獲得純合性轉(zhuǎn)化子的特點最為常用；電擊法雖操作簡便，但轉(zhuǎn)化效率比較低;基因槍法的優(yōu)勢在于操作迅速、簡單及受體材料廣泛且不需制備原生質(zhì)體，但其價格昂貴、轉(zhuǎn)化率低、嵌合體不易排除，因此對于米曲霉采用后兩種方法的研究比較少。米曲霉轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記有3類:營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因、藥物抗性標(biāo)記基因及功能標(biāo)記基因，其中營養(yǎng)缺陷型互補基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以其低背景生長的特性相比于其他系統(tǒng)更為有效以乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶基因(PyrG)作為選擇標(biāo)記并以該基因的缺陷株真菌作為受體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在國外己被證明是一種十分有效的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的在于提供一種米曲霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選方法，能夠快速的獲得大量的米曲霉?fàn)I養(yǎng)缺陷型菌株，并且遺傳穩(wěn)定性強，為米曲霉菌株轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的進行奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
[0004]具體技術(shù)方案:
[0005]—種米曲霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選方法，包括如下步驟:
[0006](I)將5mL總數(shù)量為5 X 17個通過5μπι針頭過濾器的新鮮米曲霉孢子置于直徑為6cm的平皿中進行紫外誘變;誘變條件為:誘變波長254nm，誘變高度16cm，誘變時間1.5min，磁力攪拌器轉(zhuǎn)速400r/min;
[0007](2)把誘變的分生孢子涂布在培養(yǎng)基I上；
[0008]所述培養(yǎng)基I配制方法為:葡萄糖20g，NaNo32g，K2HPo4lg，F(xiàn)eScn0.lg,Kcl 0.5g，MgSo4.7H20 0.58，1^^01^-1000.078，5-氟乳清酸(5沖0八)1.58，尿嘧啶核苷2.48，瓊月旨20g，溶于100mL水中，pH 6.6，115°C，20min滅菌備用；
[0009](3)在30°C條件下培養(yǎng)7?10d，挑選出能夠抗5-F0A的單菌落;將單菌落轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基2斜面；
[0010]所述培養(yǎng)基2配制方法為:葡萄糖20g，NaNo32g，K2HPo4lg，F(xiàn)eScn0.lg,Kcl 0.5g，MgSo4.7H20 0.5g，Trit1nx-1000.07g，肌醇2g，5-F0A I.5g，尿嘧啶核苷2.4g，瓊脂20g，溶于100mL水中，pH 6.6，115°C，20min滅菌備用；
[0011](4)收集斜面上的米曲霉孢子，涂布在培養(yǎng)基I平皿上；
[0012](5)將平皿上長出的米曲霉單菌落分別對點到培養(yǎng)基3和培養(yǎng)基4上;收取在培養(yǎng)基3上不能生長，在培養(yǎng)基4上生長的菌株即為米曲霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株；
[0013]所述培養(yǎng)基3的配制方法為:葡萄糖20g，NaNo32g，K2HPo4lg，F(xiàn)eSo40.lg,Kcl 0.5g，MgSo4.7H20 0.5g，瓊脂20g，溶于100mL水中，pH 6.6，115°C，20min滅菌備用；
[0014]所述培養(yǎng)基4的配制方法為:葡萄糖20g，NaNo32g，K2HPo4lg，F(xiàn)eSo40.lg,Kcl 0.5g，MgSo4.7H20 0.5g，尿嘧啶核苷2.4g，瓊脂20g，溶于100mL水中，pH 6.6，115°C，20min滅菌備用。
[0015]步驟(4)收集斜面上的米曲霉孢子，通過3μπι針管過濾器后，涂布在培養(yǎng)基I平皿上
[0016]本發(fā)明有益效果:采用本發(fā)明方法，能夠快速的獲得大量的米曲霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株，并且遺傳穩(wěn)定性強，為米曲霉菌株轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的進行奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0017]圖1本發(fā)明獲得的培養(yǎng)4天后的米曲霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株。
【具體實施方式】
[0018]如無具體說明，本發(fā)明的各種原料均可由市場銷售得到；或者根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法制備得到。除非另有定義或說明，本文中所使用的專業(yè)術(shù)語與科學(xué)用語與本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員所熟悉的意義相同，此外任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。
[0019]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照國家標(biāo)準(zhǔn)測定。若沒有相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)，則按照通用的國家標(biāo)準(zhǔn)、常規(guī)條件、或按照制造商所建議的條件進行。
[0020]實施例1
[0021](I)將5mL總數(shù)量為5 X 17個通過5μπι針頭過濾器的新鮮米曲霉孢子置于直徑為6cm的平皿中進行紫外誘變，誘變條件(誘變波長254nm，誘變高度16cm，誘變時間1.5min，磁力攪拌器轉(zhuǎn)速400r/min，)；
[0022 ] (2)把誘變的分生孢子涂布在培養(yǎng)基I上；
[0023]所述培養(yǎng)基I配制方法為:葡萄糖20g，NaNo32g，K2HPo4lg，F(xiàn)eScn0.lg,Kcl 0.5g，MgSo4.7H20 0.5g,Trit1nx-1000.07g,5-F0A 1.5g，尿嘧啶核苷2.4g，瓊脂20g，加至100mL水中，pH 6.6，115°C，20min滅菌；
[0024](3)在30°C條件下培養(yǎng)7?10d，挑選出能夠抗5-F0A的單菌落;將單菌落轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基2斜面；
[0025]所述培養(yǎng)基2配制方法為:葡萄糖20g，NaNo32g，K2HPo4lg，F(xiàn)eScn0.lg,Kcl 0.5g，MgSo4.7H20 0.5g，Trit1nx-1000.07g，肌醇2g，5-F0A I.5g，尿嘧啶核苷2.4g，瓊脂20g，加至100mL水中，pH 6.6，115°C，20min滅菌；
[0026](4)收集斜面上的米曲霉孢子，通過3μπι針管過濾器后，涂布在培養(yǎng)基I平皿上；
[0027](5)將平皿上長出的米曲霉單菌落分別對點到培養(yǎng)基3和培養(yǎng)基4上;收取在培養(yǎng)基3上不能生長，在培養(yǎng)基4上生長的菌株即為米曲霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株；
[0028]所述培養(yǎng)基3的配制方法為:葡萄糖20g，NaNo32g，K2HPo4lg，F(xiàn)eSo40.lg,Kcl 0.5g，MgSo4.7H20 0.5g，瓊脂20g，加至100mL水中，pH 6.6，115°C，20min滅菌；
[0029]所述培養(yǎng)基4的配制方法為:葡萄糖20g，NaNo32g，K2HPo4lg，F(xiàn)eSo40.lg,Kcl 0.5g，MgSo4.7H20 0.5g，尿嘧啶核苷2.4g，瓊脂20g，加至100mL水中，pH 6.6，115°C，20min滅菌。
[0030]培養(yǎng)4天的米曲霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株見圖1。
[0031]本發(fā)明方法能夠快速獲得尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型米曲霉菌株;本發(fā)明獲得的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型米曲霉經(jīng)20次傳代后仍然保持尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型性狀，具有較高的遺傳穩(wěn)定性。
【主權(quán)項】
1.一種米曲霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選方法，其特征在于包括如下步驟: (1)將5mL總數(shù)量為5X17個通過5μπι針頭過濾器的新鮮米曲霉孢子置于直徑為6cm的平皿中進行紫外誘變;誘變條件為:誘變波長254nm，誘變高度16cm，誘變時間1.5min，磁力攪拌器轉(zhuǎn)速400r/min; (2)把誘變的分生孢子涂布在培養(yǎng)基I上； 所述培養(yǎng)基I配制方法為:葡萄糖20g，NaNo3 2g ,K2HP04 lg，F(xiàn)eSo4 0.1g ,Kcl 0.5g,MgSo4.7H20 0.5g，Trit1nx-100 0.07g，5-氟乳清酸I.5g，尿嘧啶核苷2.4g，瓊脂20g，溶于100mL水中，pH 6.6，115°C，20min滅菌備用； (3)在30°C條件下培養(yǎng)7?10d，挑選出能夠抗5-F0A的單菌落;將單菌落轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基2斜面； 所述培養(yǎng)基2配制方法為:葡萄糖20g，NaNo3 2g ,K2HP04 lg，F(xiàn)eSo4 0.1g ,Kcl 0.5g,MgSo4.7H20 0.5g,Trit1nx-100 0.07g，肌醇2g，5-氟乳清酸1.5g，尿嘧啶核苷2.4g，瓊脂20g，溶于100mL水中，pH 6.6，115°C，20min滅菌備用； (4)收集斜面上的米曲霉孢子，涂布在培養(yǎng)基I平皿上； (5)將平皿上長出的米曲霉單菌落分別對點到培養(yǎng)基3和培養(yǎng)基4上;收取在培養(yǎng)基3上不能生長，在培養(yǎng)基4上生長的菌株即為米曲霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株； 所述培養(yǎng)基3的配制方法為:葡萄糖20g，NaNo3 2g，K2HPo4 lg，F(xiàn)eSo4 0.1g，Kcl 0.5g，MgSo4.7H20 0.5g，瓊脂20g，溶于100mL水中，pH 6.6，115°C，20min滅菌備用； 所述培養(yǎng)基4的配制方法為:葡萄糖20g，NaNo3 2g，K2HPo4 lg，F(xiàn)eSo4 0.1g，Kcl 0.5g，MgSo4.7H20 0.5g，尿嘧啶核苷2.4g，瓊脂20g，溶于100mL水中，pH 6.6，115°C，20min滅菌備用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于步驟(4)收集斜面上的米曲霉孢子，通過3μπι針管過濾器后，涂布在培養(yǎng)基I平皿上。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，公開了一種米曲霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選方法，具體為將米曲霉孢子誘變；把誘變的分生孢子涂布在培養(yǎng)基1上；在30℃條件下培養(yǎng)7～10d，挑選出能夠抗5-FOA的單菌落；將單菌落轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基2斜面；收集斜面上的米曲霉孢子，涂布在培養(yǎng)基1平皿上；將平皿上長出的米曲霉單菌落分別對點到培養(yǎng)基3和培養(yǎng)基4上；收取在培養(yǎng)基3上不能生長，在培養(yǎng)基4上生長的菌株即為米曲霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株。能夠快速的獲得大量的米曲霉?fàn)I養(yǎng)缺陷型菌株，并且遺傳穩(wěn)定性強，為米曲霉菌株轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的進行奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N1/02, C12N13/00, C12R1/645
【公開號】CN105524914
【申請?zhí)枴緾N201511004106
【發(fā)明人】曾斌, 郝慶, 劉華
【申請人】江西科技師范大學(xué)
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2015年12月29日