一種生產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉的控制培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物培養(yǎng)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種生產(chǎn)巧樣酸的黑曲霉的控制培養(yǎng)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 巧樣酸是一種重要且產(chǎn)量較大的有機(jī)酸，黑曲霉是生產(chǎn)巧樣酸的重要菌種，是一 種常見的真菌，主要W抱子進(jìn)行繁殖，因此培養(yǎng)抱子是生產(chǎn)中的關(guān)鍵步驟。
[0003] 巧樣酸發(fā)酵普遍采用黑曲霉二級發(fā)酵方式，即首先培養(yǎng)成熟的種子，然后成熟的 種子液轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)。傳統(tǒng)種子培養(yǎng)過程是采用黑曲霉抱子接種方式，需要大量成熟的黑 曲霉抱子，黑曲霉抱子制備過程比較復(fù)雜。一批成熟的黑曲霉抱子需要經(jīng)過平板篩選，斜面 培養(yǎng)，茄子瓶培養(yǎng)，最后教曲桶培養(yǎng)等逐級擴(kuò)大培養(yǎng)過程;制備過程繁瑣，活性篩選復(fù)雜，工 作量大，制備周期需要30dW上。同時(shí)，采用抱子接種方式培養(yǎng)種子工藝，僅抱子萌發(fā)需要至 少12h，因而成熟種子培養(yǎng)時(shí)間較長。
[0004] 目前制備黑曲霉教曲的培養(yǎng)基主要采用單一的小麥教皮，其培養(yǎng)基水分大約控制 在65-70wt%左右，pH值大約在6.3-6.5之間。然而，使用運(yùn)樣的教皮培養(yǎng)基在滅菌過程中，存 在培養(yǎng)基易結(jié)塊、滅菌效果不夠高的問題。該方法工作量大，操作不方便，隨著巧樣酸產(chǎn)量 的日漸擴(kuò)大，該方法不適用于大批量生產(chǎn)。
[000引因此，需要尋找一種既減少工作量，操作簡便，又能適應(yīng)巧樣酸增產(chǎn)的黑曲霉抱子 擴(kuò)大培養(yǎng)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供克服上述問題，提供一種工作量小、抱子淘汰率低并且種 子罐培養(yǎng)的穩(wěn)定性高的黑曲霉抱子擴(kuò)大培養(yǎng)的方法。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為： 一種生產(chǎn)巧樣酸的黑曲霉的控制培養(yǎng)方法，其特征在于包括W下步驟： (1) 經(jīng)過分離純化獲得黑曲霉單菌落； (2) 單菌落接種于試管斜面培養(yǎng)獲得一代菌種； (3) -代菌種抱子接種茄子瓶培養(yǎng)基獲得二代抱子； (4) 二代菌種抱子接種到大教曲培養(yǎng)基獲得成熟的生產(chǎn)用抱子，培養(yǎng)過程通入無菌空 氣進(jìn)行通風(fēng)培養(yǎng);所述大教曲培養(yǎng)基成分為玉米忍顆粒，培養(yǎng)基:水=1:1.5~2.0,培養(yǎng)溫度 為26~29°C，培養(yǎng)時(shí)間為9~10天。
[000引優(yōu)選地，所述步驟(1)中培養(yǎng)溫度為35~37°C，培養(yǎng)時(shí)間為35~3化。
[0009] 優(yōu)選地，所述步驟(2)中培養(yǎng)溫度為33~36°C，培養(yǎng)時(shí)間為5~6天。
[0010] 優(yōu)選地，所述步驟(3)中培養(yǎng)溫度為33~36°C，培養(yǎng)時(shí)間為7~8天。
[0011] 優(yōu)選地，所述步驟(4)中培養(yǎng)溫度為26~29°C，培養(yǎng)時(shí)間為9~10天。
[0012] 進(jìn)一步地，所述步驟(4)中無菌空氣濕度控制在25~40%，進(jìn)氣流量為10~1化/min。
[0013] 采用本發(fā)明的技術(shù)方案操作更為簡便，淘汰率低，既節(jié)約成本，又提高工作效率， 更重要的是提高了產(chǎn)能。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作出詳細(xì)描述，W使本領(lǐng)域技術(shù)人員可W更好地理 解本發(fā)明，從而對本發(fā)明要求保護(hù)的范圍作出清楚的限定。
[0015] 本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)巧樣酸的黑曲霉的控制培養(yǎng)方法，下面具體對本發(fā)明的技 術(shù)方案做進(jìn)一步的闡述。
[0016] 實(shí)施例1 1、大教曲培養(yǎng)基制備 大教曲培養(yǎng)基成分為玉米忍顆粒，已脫干水分，稱量2000g大教曲倒入教曲桶中，根據(jù) 大教曲：水=1:1.8的比例添加去離子水，滅菌后備用。
[0017] 2抱子的培養(yǎng) (1)一代菌種培養(yǎng) 采用中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中屯、(CICC)保藏的黑霉CICC40021菌種作為培養(yǎng)的 菌種，刮取一環(huán)將本公司保藏的黑曲霉菌種于lOOmL無菌水中，振蕩20min，使用脫脂棉過濾 抱子液，使用無菌水將抱子液稀釋至1〇4,然后吸取1(Κ)化涂布平板，培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng) 時(shí)間為36h。挑選長勢良好的單菌落接種于試管斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)時(shí)間為6 天。
[001引 （2)二代菌種培養(yǎng) 將刮取^2環(huán)成熟的一代菌種抱子，接種至茄子瓶培養(yǎng)基，將抱子均勻涂布于固體培養(yǎng) 基表面。培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)時(shí)間為7天。
[0019] (3)大教曲抱子培養(yǎng) 將成熟的二代菌種的茄子瓶中加入lOOmL的無菌水，將抱子洗脫下來形成抱子液，再將 抱子液全部倒入步驟1中已制備好的教曲桶中，搖勻后上架培養(yǎng)，進(jìn)氣流量為lOL/min，培養(yǎng) 溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為9天。
[0020] 培養(yǎng)過程中需要進(jìn)行翻曲，培養(yǎng)第2天至第4天，每4 h翻曲一次;培養(yǎng)第一天及第 5天起，每天8 h翻曲一次。
[0021 ] 3抱子淘汰率計(jì)算 每天將培養(yǎng)結(jié)束的大教曲抱子進(jìn)行鏡檢，檢查是否染雜菌，染菌的抱子立即淘汰，總計(jì) 一個(gè)月生產(chǎn)總數(shù)和淘汰總數(shù)，
一個(gè)月的淘汰率結(jié)果如表1所示。
[0022] 4抱子接種量 培養(yǎng)結(jié)束之后，將化無菌水倒入教曲桶中，搖勻后獲得抱子懸浮液，該抱子懸浮液直接 用于種子罐接種。
[0023] 生產(chǎn)種子罐接種量需要約3Xl〇i2個(gè)抱子，而教曲桶中懸浮液的抱子總數(shù)約為7~8 X 1〇11個(gè)抱子，需要接種4桶抱子懸浮液。
[0024] 對比例 1、教皮培養(yǎng)基的制備 教皮培養(yǎng)基的成為為小麥教皮，小麥教皮先經(jīng)過淘洗，然后脫水，水分控制在40%;稱取 50g制備好的教皮放置在1L的Ξ角瓶中，包扎滅菌，冷卻后接種。
[002引2抱子的培養(yǎng) 按照實(shí)施例1中步驟（1)和(2)進(jìn)行相同的操作。獲得成熟的二代菌種，刮取1環(huán)成熟的 二代菌種抱子接種至制備好的教皮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)時(shí)間為7天。 培養(yǎng)過程中前Ξ天每天翻曲2次，每12小時(shí)一次。
[0026] 3抱子淘汰率計(jì)算 按照實(shí)施例1中的步驟3的方法進(jìn)行淘汰率的計(jì)算，一個(gè)月的淘汰率結(jié)果如表1所示。
[0027] 4抱子接種量 培養(yǎng)結(jié)束之后，將300mL無菌水倒入教曲瓶中，搖勻后獲得抱子懸浮液，每瓶抱子總數(shù) 約為1~2Xl〇w個(gè)抱子，接種量為150瓶。
[002引 表1
通過表1可W看出大教曲培養(yǎng)比教皮培養(yǎng)操作更為簡便，淘汰率低，既節(jié)約成本，又提 高工作效率，更重要的是提高了產(chǎn)能。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種生產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉的控制培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 經(jīng)過分離純化獲得黑曲霉單菌落； (2) 單菌落接種于試管斜面培養(yǎng)獲得一代菌種； (3) -代菌種孢子接種茄子瓶培養(yǎng)基獲得二代孢子； (4) 二代菌種孢子接種到大麩曲培養(yǎng)基獲得成熟的生產(chǎn)用孢子，培養(yǎng)過程通入無菌空 氣進(jìn)行通風(fēng)培養(yǎng);所述大麩曲培養(yǎng)基成分為玉米芯顆粒，培養(yǎng)基:水=1:1.5~2.0,培養(yǎng)溫度 為26~29°C，培養(yǎng)時(shí)間為9~10天。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中培養(yǎng)溫度為35~37°C，培養(yǎng)時(shí) 間為35~38h。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中培養(yǎng)溫度為33~36°C，培養(yǎng)時(shí) 間為5~6天。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中培養(yǎng)溫度為33~36°C，培養(yǎng)時(shí) 間為7~8天。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中培養(yǎng)溫度為26~29°C，培養(yǎng)時(shí) 間為9~10天。6. 如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中無菌空氣濕度控制 在25~40%，進(jìn)氣流量為10~15L/min。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉的控制培養(yǎng)方法，針對現(xiàn)有技術(shù)中使用小麥麩皮培養(yǎng)基時(shí)的工作量大，操作不方便，該方法不適用于大批量生產(chǎn)等不足；通過改用玉米芯顆粒作為培養(yǎng)基成分的大麩曲，并革新培養(yǎng)方式，從而降低了淘汰率，節(jié)約了成本，又提高工作效率，同時(shí)操作簡便，更重要的是提高了產(chǎn)能。
【IPC分類】C12N1/14, C12P7/48, C12R1/685
【公開號】CN105543113
【申請?zhí)枴緾N201610126631
【發(fā)明人】胡志杰, 陳堅(jiān), 石貴陽, 蔣小東, 蔣建秋, 孫福新, 傅靜, 高超, 蔣敏
【申請人】江蘇國信協(xié)聯(lián)能源有限公司, 江南大學(xué)
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年3月7日