一種分離大白菜不同發(fā)育階段小孢子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分離大白菜不同發(fā)育階段小孢子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著十字花科作物游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)日漸成熟，小孢子胚胎發(fā)生機理研究正成為熱點，但是分離處在特定發(fā)育階段的小孢子的方法至今未能成功解決；目前隨著功能基因組學(xué)的發(fā)展，遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建越發(fā)重要，大白菜再生體系構(gòu)建困難，目前研究者正開始采用小孢子培養(yǎng)與細胞滲透肽與基因槍結(jié)合轉(zhuǎn)化，小孢子因其是單倍體，在胚胎發(fā)生和再生成苗過程中會自然加倍，所以轉(zhuǎn)化后獲得的是純和的轉(zhuǎn)基因植株，因此已經(jīng)成為重要的轉(zhuǎn)化受體細胞。然而，傳統(tǒng)的小孢子分離流程中，對發(fā)育時期的選擇依賴于瓣藥比、花蕾長度、萼片顏色等形態(tài)指標，在具體實驗中，通過形態(tài)指標判定，不同研究者經(jīng)驗標準不同，具體標準很難一致，所以重復(fù)性難以保障。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種分離出不同發(fā)育階段大白菜小孢子的方法，替代傳統(tǒng)的形態(tài)指標，可為小孢子胚胎發(fā)生機理研究及單倍體遺傳轉(zhuǎn)化制備受體細胞。
[0004]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育階段的小孢子與空泡等細胞器的形成關(guān)系密切。而空泡的發(fā)育會表現(xiàn)在細胞相對密度上的差異。故可通過percoll密度梯度離心法實現(xiàn)不同發(fā)育階段小孢子的分離。為下游轉(zhuǎn)化實驗提供更為一致的受體細胞，保障實驗的重復(fù)性。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
制備28%(V/V)?75%(V/V)perColl分離液，將小孢子粗提液置于分離液頂層，150rpm低速離心后，不同發(fā)育階段的小孢子分布在percoll的不同密度層中。
[0006]上述用于分離不同發(fā)育階段大白菜小孢子的percoll密度梯度分離法，包括以下步驟:
(I)取perco 11原液，配成含有13 % (m/v)的鹿糖的perco 11母液，再按照體積比將percoll母液與濃度為13 % (m/v)的蔗糖溶液配制成28%(V/V)、50%(V/V) )perColl分離液。
[0007](2)取步驟(l)750uL的50%(V/V)percoll分離液，置于2ml離心管底部，再小心地添加28%(￥/\0卩61^011分離液。
[0008](3)將步驟(2)中制備的percoll分離液在4°C條件下靜置3h，形成穩(wěn)定的分離工作液。
[0009](4)將20蕾對應(yīng)的小孢子粗提液200uL加入步驟(3)的percoll分離工作液頂層，低速離心40min，離心結(jié)束后取出樣品管。分布在50%(V/V)percoll分離液中與28%(V/V)percoll分尚液中的小孢子發(fā)育時期分別為單核中期與單核早期。
[0010](5)將步驟(4)所得的小孢子小心抽出，懸浮于13 % (m/v)的NLN液體培養(yǎng)基中，在4°C迅速離心25min，離心機轉(zhuǎn)數(shù)為150rpm，所得沉淀即為純化后去除percol I的大白菜小孢子，可作為遺傳轉(zhuǎn)化試驗受體。
【附圖說明】
[0011 ]圖1為分離液狀態(tài)示意圖；圖1A中的標號I為28% (V/V) perco 11分離液；圖1A中的標號2為50%(V/V)perColl分離液;圖1B中的標號3為穩(wěn)定的分離工作液。
[0012]圖2為小抱子提取液層不意圖；圖2A中的標號I為小抱子粗提液層；圖2B中的標號2為分離到的單核中期的小孢子層;圖2B中的標號3為分離到的單核早期的小孢子層。
【具體實施方式】
[0013]以下實施例中，大白菜小孢子采自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院試驗田；percoll原液購自sigma試劑公司。
[0014]實施事例I 試材準備
1.將大白菜種子催芽，露白后，2?4°C低溫處理20天，在溫室中將萌動種子播于穴盤，在開花期取材。
[0015]2.小孢子粗提液制備
選取花瓣長度/花藥長度在0.5-0.75之間的花蕾，流水沖洗30min，放入滅過菌的小燒杯內(nèi)，經(jīng)70%乙醇溶液表面消毒30s后，用0.1% (m/v) HgCl2溶液消毒8 min，無菌水洗滌3次，每次5 min。加8-10mL含13 % (m/v)蔗糖的B5液體培養(yǎng)基，用無菌研棒擠壓花蕾，擠出小孢子。含小孢子的懸浮液用400目孔徑的尼龍網(wǎng)過濾，收集濾液于10 mL離心管中，1000rpm離心3 min ο
[0016]3.不同時期小孢子分離
(I)取perco 11原液，配成含有13 % (m/v)的鹿糖的perco 11母液，再按照體積比將percoll母液與濃度為13 % (m/v)的蔗糖溶液配制成28%(V/V)、50%(V/V) )perColl分離液。
[0017](2)取步驟(l)750uL的50%(V/V)percoll分離液，置于2ml離心管底部(圖1A中的標號2)，再小心地添加28%(V/V)percoll分離液750uL(圖1A中的標號I)。
[0018](3)將步驟(2)中制備的percoll分離液在4°C條件下靜置3h，形成穩(wěn)定的分離工作液(圖1B中的標號3)。
[0019](4)將約20蕾對應(yīng)的小孢子粗提液200uL(圖2A中的標號I)加入步驟(3)的percoll分離工作液頂層，低速離心40min，離心結(jié)束后取出樣品管。分布在50%(V/V)perColl分離液中與28%(V/V)perColl分離液中的小孢子發(fā)育時期分別為單核中期(圖2B中的標號2)與單核早期(圖2B中的標號3)。
[0020](5)將步驟(4)所得的小孢子小心抽出，懸浮于13 % (m/v)的NLN液體培養(yǎng)基中，在4°C迅速離心25min，離心機轉(zhuǎn)數(shù)為150rpm，所得沉淀即為純化后去除percol I的大白菜小孢子，可作為遺傳轉(zhuǎn)化試驗受體。
【主權(quán)項】
1.一種分離大白菜不同發(fā)育階段小孢子的方法，其特征在于:制備28%(V/V)?50%(V/V)percoll分離液，將小孢子粗提液置于分離液頂層，150rpm低速離心后，不同發(fā)育階段的小孢子分布在percoll的不同密度層中。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離大白菜不同發(fā)育階段小孢子的方法，其特征在于包括以下具體步驟: (I )取perco 11原液，配成含有13 % (m/v)的鹿糖的perco 11母液，再按照體積比將percoll母液與濃度為13 % (m/v)的蔗糖溶液配制成28%(V/V)、50%(V/V) )perColl分離液； (2)取步驟(l)750uL的50%(V/V)percoll分離液，置于2ml離心管底部，再小心地添加28%(V/V)percoll 分離液750uL; (3 )將步驟(2 )中制備的perco 11分離液在4°C條件下靜置3h，形成穩(wěn)定的分離工作液； (4)將20蕾對應(yīng)的小孢子粗提液200uL加入步驟(3)的percoll分離工作液頂層，低速離心40min，離心結(jié)束后取出樣品管； 分布在50%(￥/\0口61'(3011分尚液中與28%(￥/\0口61'(:011分尚液中的小抱子發(fā)育時期分別為單核中期與單核早期； (5)將步驟(4)所得的小孢子小心抽出，懸浮于13% (m/v)的NLN液體培養(yǎng)基中，在4°C迅速離心25min，離心機轉(zhuǎn)數(shù)為150rpm，所得沉淀即為純化后去除percol I的大白菜小孢子，可作為遺傳轉(zhuǎn)化試驗受體。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種分離大白菜不同發(fā)育階段小孢子的方法，通過精確配制percoll分離液，將大白菜小孢子粗提液置于頂層，通過150rpm低速離心，分離到不同發(fā)育階段小孢子。不同發(fā)育階段的小孢子與空泡等細胞器的形成關(guān)系密切，往往表現(xiàn)在相對密度上的差異。故可通過percoll密度梯度離心法實現(xiàn)不同發(fā)育階段小孢子的分離。本發(fā)明可高效、穩(wěn)定地分離不同發(fā)育階段的小孢子，克服了利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)指標：瓣藥比、花蕾長度等在實驗中的不易把握的缺點，解決了體外制備相近發(fā)育階段小孢子細胞的問題，可為大白菜小孢子培養(yǎng)的機理研究提供材料及為基因槍介導(dǎo)的大白菜遺傳轉(zhuǎn)化提供受體。
【IPC分類】C12N5/04
【公開號】CN105543160
【申請?zhí)枴緾N201510886554
【發(fā)明人】馮輝, 吳晗, 章云, 劉志勇, 牟鈺
【申請人】沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2015年12月7日