一種茶樹(shù)花蛋白酶及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于食品加工技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種茶樹(shù)花蛋白酶及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 出于成本考慮，茶飲料的大部分原材料茶葉存在品質(zhì)較低的現(xiàn)狀，使其口感較差。 隨著健康飲食價(jià)值觀的指導(dǎo)，無(wú)糖、無(wú)添加劑的茶飲料會(huì)越來(lái)越受消費(fèi)者的青睞。鑒于此， 茶飲料風(fēng)味亟需得到改善來(lái)滿(mǎn)足消費(fèi)者的需求。已發(fā)現(xiàn)利用蛋白酶可將茶葉中的蛋白質(zhì)水 解成各種氨基酸，從而可W提高茶葉或茶飲料的香氣和鮮爽度。目前使用的蛋白酶有木瓜 蛋白酶、渡蘿蛋白酶、中性蛋白酶、蛋白酶Μ和鮮味酶等系列蛋白酶，但因每種酶的酶學(xué)特性 及來(lái)源不同，在提高茶葉氨基酸的能力存在差異。各種蛋白酶水解茶葉蛋白能力如表1所 /J、- 〇
[0003] 表1各種蛋白酶水解茶葉蛋白能力
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[0006] 我國(guó)茶樹(shù)花資源非常豐富，每年可產(chǎn)約40億公斤的茶樹(shù)花，然而運(yùn)些資源卻未被 利用。因?yàn)槿藗冎饕貌铇?shù)的芽葉制茶，對(duì)茶樹(shù)花卻讓其自生自滅。茶樹(shù)花是一種無(wú)需重 新培育、豐富且可再生的天然資源。茶樹(shù)花采摘后，可使次年茶葉增產(chǎn)、提質(zhì)30% W上，還可 避免抑花劑的使用。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種茶樹(shù)花蛋白酶及其制備方法，該方法是利用了廢棄與可 再生的茶樹(shù)花資源，制備得到的茶樹(shù)花蛋白酶活力非常高，可顯著增加茶飲料中氨基酸含 量，活力顯著強(qiáng)于商業(yè)化蛋白酶。
[0008] 本發(fā)明的茶樹(shù)花蛋白酶是通過(guò)W下方法制備的，該方法包括W下步驟：
[0009] 將茶樹(shù)花與聚乙締聚化咯燒酬混合研磨成粉末，然后加入抑5~10的緩沖液提取， 使蛋白溶于溶液中，離屯、取上清液，在上清液中加入硫酸錠，得到飽和度為20~70%硫酸錠 沉淀的蛋白，即為茶樹(shù)花蛋白酶。
[0010]優(yōu)選，所述的緩沖液為抑5~7.5的緩沖液。
[0011] 進(jìn)一步優(yōu)選，所述的緩沖液為P冊(cè).0的0.1M巧樣酸緩沖液。
[0012] 優(yōu)選，將茶樹(shù)花與聚乙締聚化咯燒酬按照質(zhì)量比10:1的比例混合，然后液氮條件 下研磨成粉末，按茶樹(shù)花:巧樣酸緩沖液為Ig: 5ml的比例，加入P冊(cè).0的0.1M巧樣酸緩沖液， 4°C提取化，使蛋白溶于巧樣酸緩沖液中，離屯、，取上清，上清液加入硫酸錠，得到飽和度為 20~70 %硫酸錠沉淀的蛋白，即為茶樹(shù)花蛋白酶。
[0013] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述茶樹(shù)花蛋白酶在水解茶葉蛋白中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明的第Ξ個(gè)目的是提供上述茶樹(shù)花蛋白酶在制作氨基酸茶飲料中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明使用聚乙締聚化咯燒酬與茶樹(shù)花混合研磨，聚乙締聚化咯燒酬和酪、生物 堿形成復(fù)合物，從而從植物樣品中把他們?nèi)コ?，然后提取溶解蛋白，用硫酸錠沉淀蛋白，得 到飽和度為20 % -70 %硫酸錠沉淀的蛋白，即為茶樹(shù)花蛋白酶。
[0016] 本發(fā)明利用了廢棄與可再生的茶樹(shù)花資源，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該資源中富含活力非常高的 蛋白酶，即茶樹(shù)花蛋白酶，該茶樹(shù)花蛋白酶可顯著增加茶飲料中氨基酸含量，活力顯著強(qiáng)于 商業(yè)化蛋白酶。此外茶樹(shù)花蛋白酶制備步驟簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件寬，與茶葉具有極高同源性，相 比添加外源酶更具安全性與實(shí)效性。
[0017] 因此利用廢棄與可再生的茶樹(shù)花資源，通過(guò)資源重組，生物轉(zhuǎn)化手段，對(duì)廢棄資源 的高效與可持續(xù)利用，可促進(jìn)茶樹(shù)花新資源創(chuàng)新產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，為我國(guó)茶產(chǎn)業(yè)拓展了一 個(gè)具有競(jìng)爭(zhēng)力的新增長(zhǎng)點(diǎn)，也為廣大茶農(nóng)開(kāi)辟了一條增收的新渠道;此外，茶樹(shù)花蛋白酶是 一種天然、生態(tài)、安全的原料，與茶葉具有極高同源性，相比添加外源酶更具安全性與實(shí)效 性，可應(yīng)用于低品質(zhì)茶葉（占全年產(chǎn)量60%)深加工增值產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，為安全有效提高低質(zhì) 化茶葉資源的品質(zhì)提供了 一種新途徑。
【具體實(shí)施方式】：
[0018] W下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0019]實(shí)施例1:
[0020] 1)將lOg茶樹(shù)花加入Ig聚乙締聚化咯燒酬（PVPP)，液氮研磨成粉末。加入50mL 0.1M巧樣酸緩沖液(pH 6.0)，4°C提取化。將提取液轉(zhuǎn)移到50mL離屯、管中，10000g，4°C離屯、 30min，取上清。加入硫酸錠，使上清液的飽和度為20%，4°C沉淀化，10000g，4°C離屯、30min， 取上清。加入硫酸錠，使上清液的飽和度達(dá)到70%，過(guò)夜沉淀，10000g，4°C離屯、30min，去上 清，沉淀即為茶樹(shù)花蛋白酶。用0.1M巧樣酸緩沖液(pH 6.0)溶解，得到飽和度為20%-70% 硫酸錠沉淀的茶樹(shù)花蛋白酶液。獲得的茶樹(shù)花蛋白酶液中未檢測(cè)出游離氨基酸。如要大規(guī) 模使用，可考慮超濾(IF)技術(shù)進(jìn)行脫鹽。
[0021] 2)在lOOmL茶飲料中加入Img的茶樹(shù)花蛋白酶，考慮到較高溫度反應(yīng)可能會(huì)影響茶 飲料其他成分的變化，因此在實(shí)際應(yīng)用采用37°C反應(yīng)24h后，茶飲料氨基酸含量可從原先的 59.53 ±0.52mg總量增加到172.9 ± 3.07mg，氨基酸含量增加200 %，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)中蛋 白酶，主要增加的游離氨基酸為天冬氨酸、谷氨酸、天冬酷胺、絲氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮 氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、賴(lài)氨酸和精氨酸。
[0022] 實(shí)施例2:實(shí)施例1制備的茶樹(shù)花蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)
[0023] 1、茶樹(shù)花蛋白酶不同pH值酶活性測(cè)定
[0024] 250μ1含1 %偶氮酪蛋白的不同pH值的緩沖液(pH 5.0,5.5,6.0和6.5的50mM巧樣 酸鋼緩沖液;pH 7.0,7.5,8.0和8.5的50mM Tris-肥 1 緩沖液;pH 9.0,9.5和 10.0的50mM碳 酸鋼緩沖液）中加入15化1的茶樹(shù)花蛋白酶液(3.81mg/ml)，37°C水浴化。加入1.2ml 10% TCA終止反應(yīng)，反應(yīng)液在室溫靜置15min，8000g離屯、8min，取上清，加入1.4ml 1M化0H，空白 W先加入TCA，再加入蛋白酶的反應(yīng)為對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后用分光光度計(jì)測(cè)其在490nm處的吸 光值。W每小時(shí)在490nm處的0.01個(gè)吸光值變化為一個(gè)酶活力單位U;
[002引其結(jié)果如表2所示
[0026] 表2茶樹(shù)花蛋白酶不同pH值酶活性測(cè)定
[0027]
[0028] 從表2可W看出，本發(fā)明分離得到的茶樹(shù)花蛋白酶適用性較廣，pH值范圍可從5到 7.5。
[0029] 2、茶樹(shù)花蛋白酶不同溫度下酶活性測(cè)定
[0030] 250μ1含1%偶氮酪蛋白的抑6.0的50mM巧樣酸鋼緩沖液加入15化1的茶樹(shù)花蛋白 酶液（3.81mg/ml)，分別在30°C，40°C，50°C，60°C，和70°C的恒溫水浴鍋中水浴化。加入 1.2ml 10 % TCA終止反應(yīng)，反應(yīng)液在室溫靜置15min，8000g離屯、8min，取上清，加入1.4ml IM NaOH，空白W先加入TCA，再加入蛋白酶的反應(yīng)為對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后用分光光度計(jì)測(cè)其在 490nm處的吸光值。W每小時(shí)在490nm處的0.01個(gè)吸光值變化為一個(gè)酶活力單位U;
[0031] 其結(jié)果如表3所示
[0032] 表3茶樹(shù)花蛋白酶不同溫度下酶活性測(cè)定
[0033]
[0034]
[0035] 從表3可W看出，本發(fā)明分離得到的茶樹(shù)花蛋白酶適用性較廣，溫度范圍為30-60 °C，其中50°C其酶活力達(dá)到最大。
[0036] 實(shí)施例3:
[0037] 將lOg茶樹(shù)花加入Ig聚乙締聚化咯燒酬(PVPP)，液氮研磨成粉末。加入50mL 50mM 巧樣酸鋼緩沖液(pH 5.0)，4°C提取化。將提取液轉(zhuǎn)移到50mL離屯、管中，10000g，4°C離屯、 30min，取上清。加入硫酸錠，使上清液的飽和度為20%，4°C沉淀化，10000g，4°C離屯、30min， 取上清。加入硫酸錠，使上清液的飽和度達(dá)到70%，過(guò)夜沉淀，10000g，4°C離屯、30min，去上 清，沉淀即為茶樹(shù)花蛋白酶。
[003引實(shí)施例4:
[0039] 將lOg茶樹(shù)花加入Ig聚乙締聚化咯燒酬(PVPP)，液氮研磨成粉末。加入50mL 50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)，4°C提取化。將提取液轉(zhuǎn)移到50mL離屯、管中，10000g，4°C離屯、 30min，取上清。加入硫酸錠，使上清液的飽和度為20%，4°C沉淀化，10000g，4°C離屯、30min， 取上清。加入硫酸錠，使上清液的飽和度達(dá)到70%，過(guò)夜沉淀，10000g，4°C離屯、30min，去上 清，沉淀即為茶樹(shù)花蛋白酶。
[0040] 實(shí)施例5:
[0041] 1)將lOg茶樹(shù)花加入Ig聚乙締聚化咯燒酬（PVPP)，液氮研磨成粉末。加入50mL 50mM碳酸鋼緩沖液(pH 10.0)，4°C提取化。將提取液轉(zhuǎn)移到50血離屯、管中，10000g，4°C離屯、 30min，取上清。加入硫酸錠，使上清液的飽和度為20%，4°C沉淀化，10000g，4°C離屯、30min， 取上清。加入硫酸錠，使上清液的飽和度達(dá)到70%，過(guò)夜沉淀，10000g，4°C離屯、30min，去上 清，沉淀即為茶樹(shù)花蛋白酶。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種茶樹(shù)花蛋白酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 將茶樹(shù)花與聚乙烯聚吡咯烷酮混合研磨成粉末，然后加入PH5~10的緩沖液提取，使蛋 白溶于溶液中，離心取上清液，在上清液中加入硫酸銨，得到飽和度為20~70 %硫酸銨沉淀 的蛋白，即為茶樹(shù)花蛋白酶。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的緩沖液為pH5~7.5的緩沖液。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的緩沖液為pH6.0的0.1M檸檬酸 緩沖液。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，將茶樹(shù)花與聚乙烯聚吡咯烷酮按照質(zhì) 量比10:1的比例混合，然后液氮條件下研磨成粉末，按茶樹(shù)花:檸檬酸緩沖液為lg:5ml的比 例，加入PH6.0的0.1M檸檬酸緩沖液，4°C提取2h，使蛋白溶于檸檬酸緩沖液中，離心，取上 清，上清液加入硫酸銨，得到飽和度為20~70%硫酸銨沉淀的蛋白，即為茶樹(shù)花蛋白酶。5. -種按照權(quán)利要求1、2、3或4所述的制備方法制備得到的茶樹(shù)花蛋白酶。6. 權(quán)利要求5所述的茶樹(shù)花蛋白酶在水解茶葉蛋白中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求5所述的茶樹(shù)花蛋白酶在制作氨基酸茶飲料中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種茶樹(shù)花蛋白酶及其制備方法和應(yīng)用。將茶樹(shù)花與聚乙烯聚吡咯烷酮混合研磨成粉末，然后加入pH5～10的緩沖液提取，使蛋白溶于溶液中，離心取上清液，在上清液中加入硫酸銨，得到飽和度為20～70％硫酸銨沉淀的蛋白，即為茶樹(shù)花蛋白酶。本發(fā)明利用了廢棄與可再生的茶樹(shù)花資源，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該資源中富含活力非常高的蛋白酶，即茶樹(shù)花蛋白酶，該茶樹(shù)花蛋白酶可顯著增加茶飲料中氨基酸含量，活力顯著強(qiáng)于商業(yè)化蛋白酶。此外茶樹(shù)花蛋白酶制備步驟簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件寬，與茶葉具有極高同源性，相比添加外源酶更具安全性與實(shí)效性。
【IPC分類(lèi)】A23F3/16, C12N9/50
【公開(kāi)號(hào)】CN105543199
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610067080
【發(fā)明人】楊子銀, 傅秀敏, 陳義勇, 梅鑫, 周瀛
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院華南植物園
【公開(kāi)日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年1月29日