基于優(yōu)化MERS-CoV棘突蛋白編碼基因的重組5型腺病毒載體疫苗的制作方法
【專利說明】基于優(yōu)化MERS-CoV棘突蛋白編碼基因的重組5型腺病毒載體 疫苗
[0001 ]技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明設(shè)及一種可表達(dá)MERS-CoV棘突蛋白的重組5型腺病毒載體疫苗
【背景技術(shù)】 [0002] 中東呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒(Middle East Respiratory Syn化ome Coranavirus，MERS-CoV)是2012年4月在中東地區(qū)，從一名患有急性呼吸窘迫綜合征病人體 內(nèi)分離獲得的一種新型冠狀病毒，其病死率較高。據(jù)WK)官方數(shù)據(jù)顯示，截止至2015年2月26 日，全球?qū)嶒?yàn)室確診MERS-CoV感染者共計(jì)1030例，其中包括381例死亡病例。研究表明單峰 駝可能為該病毒的動(dòng)物傳染源和儲(chǔ)存宿主，但其傳染途徑尚不明確，目前亦無有效藥物對(duì) 抗其感染，因此研制一種有效疫苗預(yù)防MERS-CoV感染迫在眉睫。
[0003] MERS-CoV與其他冠狀病毒相似，是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒。病毒表面的棘 突蛋白S蛋白是病毒包膜上特異性的組織結(jié)構(gòu)，在病毒的表面形成大量刺突，在病毒入侵祀 細(xì)胞W及病毒與細(xì)胞發(fā)生交互作用時(shí)發(fā)揮著重要的作用。多項(xiàng)研究表明，S蛋白疫苗可W產(chǎn) 生高效價(jià)的抗SARS-CoV病毒中和抗體，有效的預(yù)防SARS-CoV感染。因此冠狀病毒疫苗的研 發(fā)通常WS抗原作為主要祀抗原。
[0004] 人腺病毒載體具有高效價(jià)、易構(gòu)建的特性，并且其基因組中有合適的基因插入位 點(diǎn)，因此，被廣泛地用于基因治療或疫苗研制。用腺病毒載體研制的預(yù)防急性呼吸綜合癥的 疫苗，已經(jīng)過臨床測(cè)驗(yàn).目前，已知人腺病毒50余種，分為7個(gè)亞型(A-G)，其中人腺病毒5型 是一種呼吸道病原體，是目前為止應(yīng)用最多，效果最為理想的一種腺病毒載體。為評(píng)價(jià)應(yīng)用 人腺病毒載體制備抗MERS-CoV重組疫苗，本發(fā)明構(gòu)建了載有MERS-CoV S基因的復(fù)制缺陷型 重組5型腺病毒載體疫苗rAd5/MERS-S。大量擴(kuò)增和純化后，經(jīng)肌肉注射或灌胃途徑免疫，6- 8周齡的雌性BALB/c小鼠，通過細(xì)胞免疫和體液免疫指標(biāo)的檢測(cè)，在小鼠體內(nèi)評(píng)估該重組疫 苗的免疫原性。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[000引研發(fā)一種表達(dá)MERS-CoV棘突蛋白的重組5型腺病毒載體疫苗，并在小鼠體內(nèi)檢測(cè) 該疫苗的免疫效果。
【附圖說明】
[0006] 圖 1: Ad5-GFP 及 Ad5-M 邸 S-S 的構(gòu)建
[0007] 圖2 Ad5-GFP及Ad5-MERS-S的westernblot(A)和免疫巧光(B)鑒定結(jié)果 [000引圖3:動(dòng)物免疫和標(biāo)本檢測(cè)示意圖
[0009] 圖4:免疫后4w(A)和16w(B)血清IgG抗體檢測(cè)
[0010] 圖5:免疫后4w(A)和16w(B)血清IgA抗體檢測(cè)
[0011] 圖6:圖6免疫后4w和16w肺泡灌洗液(A，B)，小腸灌洗液(C，D)和大腸灌洗液化，F(xiàn)) IgA抗體檢測(cè)
[001引圖7:免疫后4w(A)和16w(B)血清中和抗體檢測(cè)
[0013] 圖8:免疫后4w和16w脾細(xì)胞化ISpot檢測(cè)
【具體實(shí)施方式】：
[0014] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而 不是限定。W下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》(第Ξ版，科學(xué)出版社，2005)等本領(lǐng)域常用工具書中所述的條件，或按試劑生產(chǎn)廠家 所建議的條件進(jìn)行。
[0015] 實(shí)施例1:攜帶優(yōu)化的MERS-CoV S基因的重組5型腺病毒的包裝及鑒定
[0016] 依據(jù)GenBank(JX869059)中MERS-CoV基因序列，優(yōu)化并人工合成S基因。將優(yōu)化后 的S基因插入到pShuttle-CMV載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pSh5-MERS-S(見圖1)。將其線性化處理后 與pA祀as廠1共同轉(zhuǎn)染大腸桿菌BJ5183,獲得重組質(zhì)粒pAd5-MERS-S.?；痗l線性化處理重組 質(zhì)粒pAd5-MERS-S后，用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染皿K293細(xì)胞，獲得重組病毒Ad5-MERS-S。經(jīng)過2次 CsCl梯度離屯、后，獲得純化的重組病毒Ad5-MERS-S。同樣方法獲得重組病毒Ad5-GFP用于對(duì) 照。
[0017] 重組病毒Ad5-MERS-S感染肥K293細(xì)胞，劑量為lOvp/細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，提取細(xì) 胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用1: 200兔抗MERS-CoV抗體及1: 200的山羊抗 兔二抗鑒定S蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染重組病毒Ad5-MERS-S的肥K293細(xì)胞經(jīng)固定后，用兔抗MERS- CoV-抗W及FITC標(biāo)記山羊抗兔二抗結(jié)合后，巧光顯微鏡下觀察蛋白的表達(dá)情況。同時(shí)用重 組病毒Ad5-GFP轉(zhuǎn)染肥K293細(xì)胞做對(duì)照。WesternBlot和免疫巧光均見S目的蛋白的表達(dá)(見 圖2)。
[0018] 實(shí)施例2:動(dòng)物免疫與樣品收集：
[0019] 2. mBALB/c小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，將純化后的重組病毒免疫小鼠，W檢測(cè)其所誘導(dǎo)的 體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，具體的免疫方案如下
[0020] 選取4-6周齡雌性BALB/c小鼠，如表1所示隨機(jī)分為5組，每組10只，分別肌肉或灌 胃注射免疫重組病毒Ad5-MERS-S或Ad5-GFP。免疫后4周，每組隨機(jī)抽取5只小鼠，處死后分 離小鼠血清，肺泡灌洗液，大腸和小腸灌洗液W及脾臟淋己細(xì)胞。用于檢測(cè)疫苗所誘導(dǎo)的體 液免疫和細(xì)胞免疫水平。免疫后16周，處死剩余小鼠，分離血清，肺泡灌洗液，大腸和小腸灌 洗液W及脾臟淋己細(xì)胞。用于疫苗誘導(dǎo)的長(zhǎng)效免疫效果檢測(cè)(見圖3)。
[0021 ]表1動(dòng)物免疫分組
[0022]
[0023] 實(shí)施例3:免疫血清中抗原特異性抗體的檢測(cè)：
[0024] 3. 1免疫血清中抗原特異性IgG的ELISA測(cè)定：受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Receptor bingding domain，RBD)為棘突蛋白S的部分片段，采用重組R抓蛋白包被化ISA板，lOOng/ 孔。將免疫血清用稀釋液從1:100作倍比稀釋，二抗為辣根過氧化物酶皿P標(biāo)記的山羊抗小 鼠 IgG二抗，W未免疫小鼠血清稀釋后檢測(cè)的A450/630值的平均值的2.1倍作為界值，各組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清檢測(cè)IgG抗體見圖4。由圖可見，重組病毒Ad5-MERS-S免疫后，無論肌肉注射還 是灌胃途徑，均在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了高效價(jià)的抗原特異性IgG抗體，抗體在小鼠體內(nèi)可持續(xù)至 少16w。短期內(nèi)（4w)肌肉注射可誘導(dǎo)較高水平的IgG抗體(見圖4A)，長(zhǎng)期后（16w)兩種免疫方 式誘導(dǎo)的特異性IgG抗體未見明顯差別（見圖4B)。
[002引3.2系統(tǒng)和粘膜抗原特異性IgA的化ISA測(cè)定：采用重組RBD蛋白包被化ISA板， lOOng/孔。檢測(cè)免疫后小鼠血清，肺泡灌洗液，大腸和小腸灌洗液中IgA的表達(dá)。二抗為皿P 標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgA二抗。如圖5所示，重組病毒Ad5-MERS-S經(jīng)灌胃途徑免疫小鼠，可在其 體內(nèi)誘導(dǎo)系統(tǒng)（血清)抗原特異性IgA的表達(dá)，且IgA抗體在小鼠血清中可持續(xù)至少16W。同 樣，在重組病毒Ad5-MERS-S灌胃途徑免疫小鼠的大腸和小腸灌洗液中均檢測(cè)到IgA的表達(dá)， 且在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間至少達(dá)免疫后16w。
[0026] 實(shí)施例4.免疫血清中和抗體的檢測(cè)：
[0027] 4.1假病毒中和實(shí)驗(yàn)：
[0028] 免疫小鼠血清WPBS進(jìn)行倍比稀釋，各取50ul與等體積的MERS-CoV假病毒懸液(病 毒含量為200TCID50)混勻，37°C解育化后加入于96孔培養(yǎng)的化h7細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行感染。 37°C5%C02解育48h后，將所感染的細(xì)胞裂解并進(jìn)行巧光素酶活性分析。每個(gè)樣本均做3孔 進(jìn)行重復(fù)，避免誤差。血清的中和活性采用W下計(jì)算方法獲得：
[0029] 將陰性對(duì)照血清與MERS-CoV假病毒懸液共解育所獲得的相對(duì)巧光素酶讀值作為 RLU1，W免疫血清與MERS-CoV假病毒懸液共解育所獲得的相對(duì)巧光素酶讀值作為化U2，貝。 各血清的中和率(Neutra 1 i sat ion Rate) NR = (RLU1-RLU2) /RLU1。
[0030] 將血清中和率達(dá)50%時(shí)，抗體的稀釋倍數(shù)計(jì)算于圖7,可見重組病毒Ad5-MERS-S無 論經(jīng)肌肉注射或經(jīng)灌胃途徑免疫小鼠，均可誘導(dǎo)小鼠中和抗體的產(chǎn)生，且該中和抗體在小 鼠血清中可持續(xù)至少16w。
[0031 ]實(shí)施例4.免疫小鼠細(xì)胞免疫水平檢測(cè)：
[0〇3引采用ELISpot實(shí)驗(yàn)：處死小鼠，無菌條件下分離脾細(xì)胞，調(diào)整淋己細(xì)胞濃度至 IXloVml。用稀釋的化rified Anti-mouse IFN-丫包被化ISpot板過夜。將小鼠淋己細(xì)胞 (5X105/孔）加入到包含抗原膚的膚池（終濃度4μg/ml)中刺激Mh后，用Biotinylated Anti-mouse IFN- 丫做二抗，ELISPOT計(jì)數(shù)儀讀數(shù)分析產(chǎn)生IFN- 丫的細(xì)胞數(shù)。如圖8所示，重 組病毒Ad5-MERS-S經(jīng)灌胃途徑免疫小鼠則未能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答。經(jīng)肌 肉注射免疫小鼠，可在其體內(nèi)誘導(dǎo)較高水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答，且該細(xì)胞免疫應(yīng)答在小鼠體 內(nèi)可持續(xù)至少16w。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種優(yōu)化的編碼中東呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒(MERS-CoV)S蛋白的合成基因。2. 高效表達(dá)MERS-CoV S蛋白的重組5型腺病毒載體疫苗的制備。3. 該制劑作為常規(guī)疫苗(肌肉注射)或粘膜疫苗（口服或灌胃）在MERS-CoV預(yù)防與治療 中的應(yīng)用。
【專利摘要】發(fā)明名稱：基于優(yōu)化MERS-CoV棘突蛋白編碼基因的重組5型腺病毒載體疫苗。本發(fā)明首先優(yōu)化合成了中東呼吸綜合癥冠狀病毒(MERS-CoV)棘突蛋白(S)的編碼基因，將其插入pShuttle-CMV載體，獲得重組質(zhì)粒pAd5-MERS-S；轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，獲得拯救病毒Ad5-MERS-S。證實(shí)S蛋白高效表達(dá)后制備純化的病毒Ad5-MERS-S，經(jīng)肌肉注射或灌胃途徑免疫B？ALB/c小鼠，通過ELISPot、IgG及中和抗體檢測(cè)，證明該重組腺病毒載體疫苗有較強(qiáng)免疫原性，可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答(體液免疫，細(xì)胞免疫及粘膜免疫)，可作為理想的疫苗用于預(yù)防或治療MERS-CoV感染。
【IPC分類】C12N15/50, A61K39/215, A61K48/00, A61P31/14
【公開號(hào)】CN105543248
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510109558
【發(fā)明人】譚文杰, 魯茁壯, 郭小娟, 藍(lán)佳明, 鄧瑤, 陳紅, 洪濤
【申請(qǐng)人】中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所
【公開日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2015年3月13日