一種通過(guò)敲除其他代謝途徑進(jìn)而提高反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的生物合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] -種通過(guò)敲除其他代謝途徑進(jìn)而提高反式-4-徑脯氨酸產(chǎn)量的生物合成方法，屬 于微生物基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 徑基-k脯氨酸（簡(jiǎn)稱：徑脯氨酸，Hy化oxyproline，Hyp)為亞氨基酸，是k脯氨酸 徑基化后的產(chǎn)物，根據(jù)其徑基化位置的不同，可分為3-徑脯氨酸(3-Hyp)或4-徑脯氨酸(4- Hyp)。徑脯氨酸化y化oxyproline，Hyp)是膠原蛋白的主要組成成分，不屬于20種常見(jiàn)的氨 基酸。
[0003] 近些年來(lái)，Hyp的研究和開(kāi)發(fā)已經(jīng)引起醫(yī)藥、生化、食品及美容業(yè)等方面的廣泛關(guān) 注。它可W作為化妝品添加劑，具有抗氧化、抗福射的作用;它具有減肥作用，可望成為比較 理想的減肥藥物;具有多種生理功能與獨(dú)特的生物活性，既可作為各種軟組織疾病的藥物， 如結(jié)締組織受損、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，又可加快傷口愈合，W及治療各種皮膚疾病;作為氨基 酸注射液的重要組分，它對(duì)急慢性肝病所導(dǎo)致的低蛋白血癥有一定的療效;它參與脂肪的 乳化及紅細(xì)胞血紅素和球蛋白的形成，具有調(diào)節(jié)脂肪乳化等作用；它還是多種藥物，如第Ξ 代抗生素、抗腫瘤、抗高血壓及新型胃藥等的合成原料。
[0004] 目前，生產(chǎn)徑脯氨酸的方法有化學(xué)合成法、生物組織提取法W及生物合成法?；瘜W(xué) 合成方法合成步驟較多，成本高，不適合工業(yè)生產(chǎn)。而生物組織提取法利用動(dòng)物蛋白來(lái)源如 明膠、豬皮為原料，經(jīng)酸、堿或蛋白水解酶水解后提取徑脯氨酸，該法純化步驟長(zhǎng)，成本高， 浪費(fèi)大量原料，且廢棄物污染嚴(yán)重，很容易被市場(chǎng)淘汰。隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展W及微生 物資源的發(fā)現(xiàn)，生物合成酶法生產(chǎn)徑脯氨酸成為工業(yè)上很有前景的生產(chǎn)方法。
[0005] 生物合成法能將游離的心脯氨酸通過(guò)脯氨酸徑化酶的催化，轉(zhuǎn)化為徑基-1^-脯氨 酸，但在生物細(xì)胞中，游離的脯氨酸也是一種可W被利用的碳源，其積累量比較有限，所W 有必要切斷生物細(xì)胞內(nèi)與心脯氨酸競(jìng)爭(zhēng)前體底物谷氨酸的其他代謝途徑，使得心脯氨酸得 到大量積累，進(jìn)而更多的轉(zhuǎn)化為徑基脯氨酸，提高徑基脯氨酸產(chǎn)量。
[0006] 本發(fā)明所提供的切斷分支代謝途徑進(jìn)而提高提高徑基A-脯氨酸產(chǎn)量的生物合成 方法，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)生物合成法生產(chǎn)徑基-心脯氨酸時(shí)，需外源添加レ脯氨酸導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高 的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的是提供一種通過(guò)提高底物k脯氨酸積累量進(jìn)而提高徑基脯氨酸 產(chǎn)量的生物合成方法。
[000引本發(fā)明是一種通過(guò)提高底物k脯氨酸積累量進(jìn)而提高徑基脯氨酸產(chǎn)量的生物 合成方法。其特征是:切斷生物細(xì)胞內(nèi)與心脯氨酸競(jìng)爭(zhēng)前體底物谷氨酸的其他代謝途徑，使 得心脯氨酸得到大量積累，進(jìn)而更多的轉(zhuǎn)化為徑基脯氨酸，提高徑基脯氨酸產(chǎn)量。
[0009] 本發(fā)明所述重組細(xì)胞的構(gòu)建方法：
[0010] 1.含有脯氨酸徑化酶基因的載體的構(gòu)建
[0011] 根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性，利用密碼子的簡(jiǎn)并性在不改變氨基酸序列的基礎(chǔ) 上，消除低使用率的密碼子，優(yōu)化脯氨酸徑化酶基因，使得其更有利于在大腸桿菌中得到表 達(dá)。同時(shí)，選用色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子作為其啟動(dòng)子，對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，使得徑化酶基因得到更為 高效的表達(dá)。
[0012] 2.通過(guò)敲除基因 argB切斷生物細(xì)胞內(nèi)與心脯氨酸競(jìng)爭(zhēng)前體底物谷氨酸的精氨酸 代謝途徑
[0013] 谷氨酸起始的下游代謝主要包括脯氨酸、谷氨酷胺和精氨酸3個(gè)途徑。在精氨酸合 成途徑中，Ξ簇酸循環(huán)代謝支路生成的谷氨酸不僅是精氨酸合成的前體，而且還是脯氨酸 合成的前體，脯氨酸與精氨酸的合成形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。因此，切斷精氨酸合成支路有利于細(xì)菌 體內(nèi)代謝流向脯氨酸合成方向。
[0014] ar濁編碼的乙酷谷氨酸激酶NAGK是精氨酸生物合成一個(gè)關(guān)鍵酶，其受到精氨酸的 反饋抑制和反饋?zhàn)瓒?。乙酷谷氨酸激?N-acetパ-レglutamatekinase，NAGK)是氨基酸激 酶家族酶系之一，利用ATP催化乙酷谷氨酸(N-acetyl-レglutamate，NAG)的丫-COO群組憐 酸化生成無(wú)水酷基憐酸鹽，且運(yùn)個(gè)過(guò)程具有可逆性。
[0015] 敲除argB基因，可W有效的打斷細(xì)胞內(nèi)由谷氨酸生成精氨酸的途徑，從而積累更 多的k脯氨酸，有利于徑脯氨酸的產(chǎn)生。
[0016] 3.重組大腸桿菌的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
[0017] 35°C、220 巧 m 培養(yǎng) 24h，包括重組菌株化 21(DE3)ΔputA/ΔargB(pUC19-ptrp2- Hyp-V 冊(cè) ） ，取發(fā)酵液測(cè)定反式-4-徑 脯氨酸的含量。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1.精氨酸和脯氨酸代謝途徑。
[0019 ]圖2.徑脯氨酸在大腸桿菌細(xì)胞中的生物轉(zhuǎn)化途徑。
[0020] 圖3.表達(dá)質(zhì)粒pUC19-pt巧2-Hyp-V冊(cè)圖譜。
[0021] 圖 4.重組菌株 BL21(DE3)AputA/Aar 濁(pUC19-pt 巧 2-Hyp-V 冊(cè)）的獲得。
【具體實(shí)施方式】
[0022] LB培養(yǎng)基：1 % (W/V)膜蛋白腺，0.5 % (W/V)酵母抽提物，1 % (W/V)化C1，pH 7.0- 7.2。
[0023] Amp(Kan)抗性平板：1 % (W/V)膜蛋白腺，0.5% (W/V)酵母抽提物，1% (W/V)化Cl， 1.5% (W/V)瓊脂糖，氨節(jié)青霉素(卡那霉素)50yg/mL。
[0024] 5XKCM(大腸桿菌轉(zhuǎn)化緩沖液）：0.5MKCl，0.15MCaCl2,0.化MMgCl2。
[0025] 反式-4-?脯氨酸的定量測(cè)定:將發(fā)酵液離屯、后，取上清，稀釋到2.5mL后加于lOmL 試管中，之后加入1血氯胺T(氯胺T溶液:將1.41 g氯胺T溶于10血水中，依次加入1 OmL正丙醇 和80mL緩沖溶液，其中緩沖溶液配方為:將50g巧樣酸，26.3g化0H和146. Ig結(jié)晶乙酸鋼溶 于水至1L，然后與200mL水W及300mL正丙醇混合），搖勻后在室溫中放置20min，然后加入 ImL顯色劑（顯色劑：稱取lOg對(duì)二甲氨基苯甲醒，用35mL高氯酸溶解，緩慢加入65mL異丙 醇），搖勻后迅速將試管移至60°C水浴鍋中，保溫20min，再用冷水冷卻，最后用紫外分光光 度計(jì)在560nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。
[00%] 實(shí)施例1 :a;r濁基因敲除
[0027]由NCBI獲得ar濁的基因序列（GenBa址:M946981.2):ar濁基因 （SEQ ID N0:1)
[002引采用短同源臂，設(shè)計(jì)引物對(duì)：引物5'-3':P1(SEQ ID N0:2)、P2(SEQ ID N0:3)
[0029] W地D4為模板，獲得含有argB上下游同源臂和抗性基因化an)的打祀片段。通過(guò)化 學(xué)轉(zhuǎn)化法獲得含有質(zhì)粒地D46的大腸桿菌化21(DE3)AputA，之后將其制備為電轉(zhuǎn)感受態(tài)， 利用電轉(zhuǎn)儀將打祀片段導(dǎo)入到電轉(zhuǎn)感受態(tài)中，在質(zhì)粒地D46表達(dá)的Ξ個(gè)蛋白的作用下，利用 Red重組系統(tǒng)完成基因重組。電轉(zhuǎn)后，30°C復(fù)蘇化，涂布含有卡那霉素的平板。之后轉(zhuǎn)入質(zhì)粒 PCP20,用于消除抗性基因，將菌株分別點(diǎn)種于無(wú)抗性、Amp抗性平板、Kan抗性平板，選擇只 在無(wú)抗性平板上生長(zhǎng)的單菌落。利用引物對(duì)Y1:(SEQ ID N0:4)和Y2:(SEQ ID N0:5)進(jìn)行菌 落PCR驗(yàn)證基因是否敲除，從而獲得敲除基因 argB缺失型的菌株--化21 (0Ε3)Δριι?Α/Δ 過(guò) rgBc
[0030] 實(shí)施例2:重組質(zhì)粒(pUC19-pt巧2-Hyp-V冊(cè)）的獲得
[0031] 取實(shí)驗(yàn)室保存的含有目的質(zhì)粒的菌株活化，于37°C，220rpm培養(yǎng)12-16小時(shí)。取培 養(yǎng)后的菌液提取質(zhì)粒，所有操作均嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0032] 實(shí)施例3:重組菌株的構(gòu)建
[0033] 取出大腸桿菌BL21 (DE3) AputA/AargB感受態(tài)，置于冰上解凍后，加入37化的無(wú) 菌水，1化L KCM，3化質(zhì)粒?；靹蚝?，置于冰上30min，42°C熱激90s，再放置冰上5min，加入600 化新鮮的LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)化，取1(Κ)化涂布于氨節(jié)抗性平板。37°C培養(yǎng)8-16h后，待 長(zhǎng)出單菌落，挑取單菌落驗(yàn)證。
[0034] 實(shí)施例4:重組菌株的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
[0035] 搖瓶培養(yǎng):挑取重組大腸桿菌單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基(含氨節(jié)青霉素50yg/ mU中，37°C、220巧m培養(yǎng)化后，按6 % (V/V)接種量接入含有30血發(fā)酵培養(yǎng)基[0.8 % (W/V)葡 萄糖，1%(W/V)甘油，0.8%(W/V)玉米漿，1.3%(W/V)硫酸錠，0.15%(W/V)憐酸氨二鐘， 0.2 % (W/V)氯化鋼，4mM硫酸亞鐵，0.3g/L硫酸儀，0.015g/L氯化巧，pH 8.0 ]的250mL搖瓶 中，在旋轉(zhuǎn)式搖床中35°C、220rpm培養(yǎng)24h，取發(fā)酵液檢測(cè)反式-4-徑脯氨酸濃度。反式-4-徑 脯氨酸的測(cè)定方法詳見(jiàn)實(shí)施方式一般性說(shuō)明。發(fā)酵結(jié)果顯示，反式-4-徑脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到 921mg/L〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種有效提高羥脯氨酸產(chǎn)量的生物合成方法，其特征在于，在生物細(xì)胞利用L-脯氨 酸生產(chǎn)羥基-L-脯氨酸的過(guò)程中，通過(guò)切斷生物細(xì)胞內(nèi)與L-脯氨酸競(jìng)爭(zhēng)前體底物谷氨酸的 其他代謝途徑，來(lái)提高底物脯氨酸的量進(jìn)而達(dá)到提高羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量。2. 如權(quán)利要求1所述，利用生物細(xì)胞生產(chǎn)羥基-L-脯氨酸的過(guò)程是指，生物細(xì)胞利用外 源添加或者自身積累的脯氨酸，在脯氨酸羥化酶、酮戊二酸和亞鐵離子存在的情況下，將 游離的L-脯氨酸轉(zhuǎn)化為羥基-L-脯氨酸。3. 如權(quán)利要求1所述，切斷生物細(xì)胞內(nèi)與L-脯氨酸競(jìng)爭(zhēng)前體底物谷氨酸的其他代謝途 徑的方法:包括生物細(xì)胞內(nèi)與其他代謝途徑的相關(guān)酶不能被表達(dá)或者不能行使功能的方 法，如基因敲除、RNA干擾等。4. 如權(quán)利要求1和2所述，生物細(xì)胞包括任何能夠表達(dá)脯氨酸羥化酶，自主產(chǎn)生α-酮戊 二酸，將脯氨酸轉(zhuǎn)化為羥基-L-脯氨酸的有機(jī)體，包括大腸桿菌、嗜乙酸棒桿菌、酵母、動(dòng)植 物細(xì)胞等。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種有效提高羥脯氨酸產(chǎn)量的生物合成方法。其中，生物合成法生產(chǎn)羥基-L-脯氨酸的系統(tǒng)是指，在生物細(xì)胞內(nèi)生物體在α-酮戊二酸及亞鐵離子存在的情況下利用脯氨酸羥化酶，將游離的L-脯氨酸轉(zhuǎn)化為反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產(chǎn)方法。提高羥脯氨酸產(chǎn)量的方法為：切斷生物細(xì)胞內(nèi)與L-脯氨酸競(jìng)爭(zhēng)前體底物谷氨酸的其他代謝途徑。其中，其他代謝途徑是指，精氨酸代謝途徑。通過(guò)使用這種方法，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量達(dá)到921mg/L。
【IPC分類】C12P13/24
【公開(kāi)號(hào)】CN105543303
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610035648
【發(fā)明人】張震宇, 王曉姣, 姚動(dòng)邦, 黃建華, 魏照輝
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年1月19日