iRNA檢測qRT-PCR方法:首先設(shè)計(jì)特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物，W待測miRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄 合成cDNA第一鏈，該cDNA-端為莖環(huán)狀引物，莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開便增加了 cDNA的長度，隨后 W合成的cDNA為模板設(shè)計(jì)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。qRT-PCR具有特異性高、靈敏度好、快 速簡單等多種優(yōu)點(diǎn)。
[0034] (8)測序法
[0035] 大部分已知的miRNA都是通過cDNA克隆測序發(fā)現(xiàn)和鑒定的。該法需要先構(gòu)建miRNA 的cDNA文庫，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物隨后克隆到表達(dá)載體上測序。化kada開發(fā)了一種改 進(jìn)的擴(kuò)增克隆法(miRNA amplification profiling,mRAP)，mRAP法先在miRNA的3'端連上 接頭，然后用與接頭互補(bǔ)的反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄。因?yàn)樘囟ǖ姆崔D(zhuǎn)錄酶具有末端脫氧核巧酸 轉(zhuǎn)移酶活性，一些核巧酸（主要是脫氧胞巧酸)會(huì)連接到反轉(zhuǎn)錄出的cDNA鏈的3'末端。當(dāng)5' 端接頭與cDNA鏈的poly(C)粘性末端退火后，加入一對共用引物即可實(shí)現(xiàn)對cDNA的PCR擴(kuò) 增。由于mRAP高度靈敏，可W直接用克隆和測序技術(shù)檢測少量組織中miRNA的表達(dá)量。標(biāo)簽 序列克隆法是一種在在基因表達(dá)系列分析（SAGE)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了檢測效率更高的 miRAGE(miRNA SAGE)克隆法，該法通過生成大的串聯(lián)子，通過單個(gè)測序反應(yīng)可檢測多個(gè) miRNA，明顯提高了檢測效率。
[0036] 高通量測序（High-throughput sequencing)又稱下一代測序技術(shù)（next generation sequencing)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA 分子進(jìn)行序列測定，極大提高了測序效率。運(yùn)類大規(guī)模測序技術(shù)極大的提高了多個(gè)物種遺 傳信息的解讀速度，為獲取所有miRNA的序列信息，解密miRNA圖譜提供了保證。同時(shí)高通量 測序使得對一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所W又被稱為深度 測序(deep sequencing)。高通量測序平臺的代表是羅氏公司（Roche)的454測序儀(Roch GSFLX sequencer)，Illumina公司的Solexa基因組分析儀（Illumina Genome Analyzer)和 ABI的SOLiD測序儀(ABI SOLiD sequencer)。
[0037] 免疫檢測方法是W-種抗體或多種抗體作為分析試劑，對待測物進(jìn)行定量或定性 分析的檢測方法。其基本原理是抗體和抗原之間的相互作用。為提高抗原和抗體檢測的敏 感性，將已知抗體或抗原標(biāo)記上易顯示的物質(zhì)，通過檢測標(biāo)記物，反映有無抗原抗體反應(yīng)， 從而間接測出微量的抗原或抗體。常用的標(biāo)記物有酶、巧光素、放射性同位素、膠體金及電 子致密物質(zhì)等。運(yùn)種抗原或抗體標(biāo)記上顯示物所進(jìn)行的特異性反應(yīng)稱為免疫標(biāo)記技術(shù) (immunolabelling technique)。目前應(yīng)用最廣的免疫檢測技術(shù)主要有:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)，膠體金免疫層析法等。
[0038] 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)原理是將抗原或抗體與底物(酶)結(jié)合，使其保持免疫反應(yīng)和酶 的活性。把標(biāo)記的抗原或抗體與包被于固相載體上的配體結(jié)合，再使之與相應(yīng)的無色底物 作用而顯示顏色，根據(jù)顯色深淺程度目測或用酶標(biāo)儀測定0D值判定結(jié)果。
[0039] 膠體金試紙條一般由樣品墊、金標(biāo)墊、層析膜、吸水墊四部分組成。層析材料有硝 化纖維膜(NC)、聚醋膜、尼龍膜和PVDF膜等，根據(jù)試驗(yàn)需要可選擇不同要求的膜，其中NC膜 最為常用，使用前可根據(jù)試驗(yàn)具體情況確定是否需要活化或處理，多數(shù)情況下無需處理，即 可直接使用。將金標(biāo)蛋白溶液均勻噴涂在金標(biāo)墊上，于室溫下驚干備用。NC膜可捕獲一定量 的包被(抗體)和二抗作為檢測線和質(zhì)控線。最后將樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸水紙依次固定 于PVC板，即成試紙條。
[0040] 所述抑制劑和/或抑制劑組合物下調(diào)mir-4330和/或miR-4330的轉(zhuǎn)錄和/或阻斷 miR-4330的活性屬于使miRNA功能喪失，理論上可W對miRNA合成及發(fā)揮功能過程中的多個(gè) 關(guān)鍵步驟進(jìn)行干預(yù)：1)阻斷pri-miRNA或pre-miRNA的加工及出核過程；2)通過與pre-miRNA 結(jié)合，阻止其被加工和進(jìn)入誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC); 3)通過與RISC中的成熟miRNA結(jié)合，發(fā) 揮競爭性抑制作用。但目前主要通過導(dǎo)入外源性miRNA括抗劑W阻斷其對祀基因的作用。具 體干預(yù)方法包括：反義寡核巧酸（antisense miRNA oligonucleotides，AMOs)， antagomiRs、miRNA海綿（miRNA Sponge)、miRNA Erasers、Target Masking和多勒1 點(diǎn)反義寡 核巧酸(multiple 1:a;rget AMU,MTg AMU)等。
[0041] 反義寡核巧酸技術(shù)即根據(jù)堿基配對原則，人工合成的與成熟的miRNA互補(bǔ)的單鏈 逆序核巧酸鏈，發(fā)揮競爭性抑制劑的作用。為了防止被核酸酶和憐酸二醋酶等的降解，需對 該反義核糖核酸鏈進(jìn)行不同的化學(xué)修飾，實(shí)際應(yīng)用中常采取多種技術(shù)混合修飾的方式W獲 得最佳的穩(wěn)定性。本發(fā)明中作為有效成分利用的反義寡核巧酸具有與在序列表中SEQ ID NO 2的核巧酸序列中的第1-第8、第2-第8或第2-第7核巧酸序列互補(bǔ)的序列。最優(yōu)選的，本 發(fā)明中作為有效成分利用的反義寡核巧酸具有與序列表SEQ ID NO 2的整個(gè)核巧酸序列互 補(bǔ)的序列。
[0042] an化gomiRs技術(shù)即對反義寡核巧酸鏈的3'端進(jìn)行膽固醇修飾和4個(gè)硫代憐酸位點(diǎn) 修飾，5 '端進(jìn)行2個(gè)硫代憐酸位點(diǎn)修飾，全鏈采用2 ' -OMe-AMOs修飾。該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)在于，硫代 憐酸修飾降低了 an化gomiR二聚體的解鏈溫度，從而保證了其穩(wěn)定性。
[0043] miRNA Sponge技術(shù)即多個(gè)重復(fù)的反義miRNA寡核巧酸片段，該序列與祀miRNA的種 子序列部分互補(bǔ)，將其插入到己構(gòu)建好的綠色巧光蛋白報(bào)告基因的3'UTR中，由巨細(xì)胞病毒 啟動(dòng)子引導(dǎo)，發(fā)揮多結(jié)合域競爭性抑制劑的作用。為了與祀miRNA更穩(wěn)定的結(jié)合，在AG02的 剪切區(qū)域(第9-12位核巧酸）設(shè)計(jì)了4個(gè)不配對的堿基對。實(shí)驗(yàn)證明，miRNA Sponge具有和 AMOs相似的作用效果。該技術(shù)常被用來抑制某個(gè)miRNA家族的功能。
[0044] miRNA Erasers技術(shù)。與miRNA Sponge技術(shù)相似，但僅將2個(gè)重復(fù)的反義miRNA寡核 巧酸片段插入到報(bào)告基因的3'UTR中，且與祀miRNA完全互補(bǔ)，在U6啟動(dòng)子的控制下，通過腺 病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。由于其并非種子序列特異性，所W僅被用來抑制某個(gè)miRNA的功能。 miRNA Erasers技術(shù)的作用持續(xù)時(shí)間也比miRNA Spong技術(shù)短。
[0045] miR-Masking技術(shù)。巧巾miRNA迪常有多個(gè)祀mRNA結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)調(diào)控著多種蛋白質(zhì) 的表達(dá)。因此，抑制某1種miRNA的表達(dá)，不僅可對目標(biāo)mRNA進(jìn)行調(diào)控，還可能會(huì)產(chǎn)生不需要 的"祀外效應(yīng)(off-target effect)"。而miR-Masking技術(shù)的出現(xiàn)較好地解決了運(yùn)一問題。 它是1段與祀mRNA結(jié)合的反義核巧酸序列，W極高的親和性與miRNA的某個(gè)祀mRNA 3'UTR端 互補(bǔ)結(jié)合，從而特異地阻斷miRNA和該祀mRNA的相互作用，對該miRNA的水平或其它功能并 不產(chǎn)生影響。
[0046] 多祀點(diǎn)反義寡核巧酸技術(shù)即指將多個(gè)反義寡核巧酸片段設(shè)計(jì)到同1條核巧酸鏈 上，使其具有同時(shí)抑制多個(gè)miRNA的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)多種祀蛋白質(zhì)。該技術(shù)適用于同時(shí)調(diào)節(jié) 作用于某mRNA的多個(gè)miRNA。
[0047] 包含在本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的藥劑學(xué)上許可的載體為在制劑時(shí)通常利用的載 體，該載體包含乳糖（lactose)、右旋糖（dextrose)、薦糖（sucrose)、山梨醇（sorbitol)、甘 露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡膠、憐酸巧、藻酸鹽(alginate)、凝膠(gelatin)、娃酸巧、 微晶纖維素、聚乙締化咯燒酬(9〇17￥；[]171971'1'〇11(1〇]1日）、纖維素(。日11111〇3日）、水、糖漿、甲 基纖維素 (methyl cellulose)、徑基苯甲酸甲醋(methyl hyhowbenzoate)、丙基徑基苯 甲酸丙醋（propyl hyhowbenzoate)、滑石、硬脂酸儀（stearic acid magnesium)及礦物 油(mineral oil)等，但并非局限于此。
[004引本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物除了上述成分W外還可W包含潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、香 味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑等。藥劑學(xué)上許可的適合的載體和制劑詳細(xì)記載于雷明登氏 藥學(xué)全書。
[0049]本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物能通過口服或非口服進(jìn)行給藥，作為非口服給藥時(shí)，能通 過靜脈內(nèi)注射，鼻腔內(nèi)注射，局部注射，腦室內(nèi)注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，經(jīng)皮 給藥等方式進(jìn)行給藥。
[0050] 本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的適合的給藥劑量根據(jù)制劑化方法、給藥方式、患者的年 齡、體重、性別、病態(tài)、食物、給藥時(shí)間、給藥途徑、排泄速度及反應(yīng)靈敏性之類的因素而可W 進(jìn)行多種處方，通常，熟練的醫(yī)生能夠容易地決定及處方對所希望的治療或預(yù)防有效的給 藥劑量。
[0051] 本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物根據(jù)本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可W容易實(shí)施 的方法，利用藥劑學(xué)上能接受的載體和/或賦形劑來進(jìn)行制劑化，從而能夠W單位用量形態(tài) 制備或者內(nèi)裝在多容量容器內(nèi)來制備。此時(shí)，劑型是油性或者水性介質(zhì)中的溶液、懸浮液或 乳化液形態(tài)，或者也可W是浸膏劑、粉末劑、顆粒劑、片劑或者膠囊劑形態(tài)，還可W包括分散 劑或者穩(wěn)定劑。
【附圖說明】
[0化2] 圖1是RT-PCR檢測患者組及對照組外周血miR-4330表達(dá)水平圖
【具體實(shí)施方式】
[0053]下