面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本 發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可W理解:在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可 W對(duì)運(yùn)些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限 定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條 件實(shí)施檢測(cè)。
[0化4] 實(shí)施例1NCBI GE0數(shù)據(jù)檢索
[0055] 限制研究類型為 "expression prof i 1 ing by array"、"Non-coding RNA profiling by array"符合W下標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)集將納入我們的研究中：
[0056] ①所選數(shù)據(jù)集必須為全基因組的mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)或miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)；
[0057] ②運(yùn)些數(shù)據(jù)來(lái)自于腦卒中病例組和對(duì)照組的血液樣本(無(wú)藥物刺激或被轉(zhuǎn)染）；
[0058] ③本研究均考慮經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化或者原始數(shù)據(jù)集；
[0059] 經(jīng)篩選得到2套腦卒中高通量mRNA數(shù)據(jù)集和1套高通量miRNA數(shù)據(jù)集。
[0060] 通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)miRNA及mRNA原始數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正后進(jìn)行t-test得 至化值，然后利用Fisher檢驗(yàn)合并P值，篩選差異表達(dá)miRNA及mRNA。設(shè)定P<0.01，共篩選出 16個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中表達(dá)水平上調(diào)的miRNA13個(gè)，表達(dá)水平下調(diào)的miRNA 3個(gè)，其中 hsa-miR-4330上調(diào)表達(dá)明顯，進(jìn)入我們的研究范圍。同時(shí)，在腦卒中病中hsa-miR-4330預(yù)測(cè) 祀基因有：ABCF2，LRPPRC，CDK6，WDR5，KLF12，ΚΤΠ 2，EARS2，6-Sep，C2CD2，SLC25A42， ST6GALNAC6，ILF3，IVD，MFGE8，ZNF589，PDE4D，TRMTl3，ANKRD16，細(xì)Q1，PRKX，ZNF250， MRPS26，SNXl，UROS，C21orf2，ZNFIO，N0L9，抓C3，C2orf44，CSRNP2，CASK，R醒T，TMEM261， SEC22C，CBFA2T2，SNX29，PRE化，S冊(cè)PXD2A，RNFl44A，RIMS3，ZBTB5。
[0061] 實(shí)施例2樣品的收集及總RNA提取
[0062] 46例腦卒中患者及31例健康人群對(duì)照均來(lái)自醫(yī)院（2014年1月-2015年9月），抽取 他們的外周血，400化pm離屯、分離血漿加 TRIzoI試劑（1: 3)并保持在-80°C直至進(jìn)行RNA提 取。所有受試者均簽署了知情同意書(shū)。
[0063] 1RNA提取方法
[0064] 1)解凍含TRIzoI試劑的血漿，震蕩后靜止5分鐘。
[0065] 2)加氯仿(Ξ氯甲燒0.2ml)，劇烈震蕩30秒，靜止15分鐘。
[0066] 3)離屯、15分鐘（12000邑，15分鐘、4°〇。
[0067] 4)取上清，加異丙醇(0.5ml)劇烈震蕩，靜止10分鐘。
[006引 5)離屯、10分鐘（12000g，10分鐘，4°C)，然后棄上清。
[0069] 6)加75 %去污乙醇1ml (無(wú)水乙醇用DEPC處理的去離子水配，無(wú)水乙醇:DEPC水= 3:1)。用震蕩器震蕩0.5分鐘。
[0070] 7)離屯、5分鐘(7500g，5分鐘，4°C)棄上清，倒扣于衛(wèi)生紙上片刻后正置5分鐘。
[0071] 8)加加1 DEPC-出0手掌離屯、機(jī)瞬時(shí)離屯、，60°C水浴10分鐘。
[0072] 9)測(cè)濃度，用RNA濃度測(cè)量?jī)x器。
[0073] 2逆轉(zhuǎn)錄
[0074] 1)逆轉(zhuǎn)錄配制:每個(gè)EP管加去離子水水14ul，IUprimemiX 4ul，RNAl-3ul。
[0075] 2)70°C 水浴 10 分鐘。
[0076] 3)冰上制冷2分鐘。
[0077] 4)加入2 X tsmix 25ul，TS(逆轉(zhuǎn)錄酶)2.5ul，去離子水3.加1，離屯、搖勻，行RT逆轉(zhuǎn) 錄cDNA。
[0078] 實(shí)施例3Rea^time PCR檢測(cè)腦卒中組和對(duì)照組miR-4330的表達(dá) [00巧]巧光定量PCR
[0080] RT-PCR體系的配制：
[0081]
[0082] miRNAs的表達(dá)檢測(cè)每次設(shè)置3個(gè)平行管反應(yīng)，WsnRNA U6作為內(nèi)參。
[0083] PCR 程序：
[0084] 95°C10min;40個(gè)循環(huán)(95°C10s，60°C30s)。循環(huán)結(jié)束后利用烙解曲線檢測(cè)產(chǎn)物特 異性:從60°C緩慢升溫至97°C，每°0采集5次巧光信號(hào)。
[0085] 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0086] 采用化iginProS.l軟件進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)方法均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05(差異 顯著)和P<0.01(差異非常顯著）定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析腦卒中和正常對(duì)照樣本中外周血 miR-4330表達(dá)水平，結(jié)果顯示腦卒中組中miR-4330的表達(dá)明顯高于正組織，前者是后者的 約1.4倍，具體見(jiàn)圖1。
[0087] 實(shí)施例4 一種檢測(cè)腦卒中的試劑盒
[0088] 巧光定量PCR
[0089] RT-PCR體系的配制：
[0090]
[0091] miRNAs的表達(dá)檢測(cè)每次設(shè)置3個(gè)平行管反應(yīng)，WsnRNA U6作為內(nèi)參。
[0092] 雖然已參考各種優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可進(jìn)行各 種變化，并且可用等同物替代其組件而不背離本發(fā)明的基本范圍。此外，可進(jìn)行許多改動(dòng)來(lái) 使特定情況或材料適合于本發(fā)明的教導(dǎo)而不背離其基本范圍。
[0093] 因此，本發(fā)明無(wú)意限定于本文中公開(kāi)的用于進(jìn)行本發(fā)明的特定實(shí)施方案;相反地， 本發(fā)明意欲包括落在權(quán)利要求書(shū)范圍內(nèi)的所有實(shí)施方案。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. mir-4330和/或miR-4330在制備預(yù)防、診斷和/或治療腦卒中試劑中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，預(yù)防、診斷腦卒中試劑包括基于高通量測(cè) 序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探針雜交方法檢測(cè)腦卒中樣本中mir-4330和/或 miR-4330的轉(zhuǎn)錄或基于免疫檢測(cè)方法檢測(cè)腦卒中樣本中miR-4330調(diào)控的靶基因的表達(dá)情 況，優(yōu)選采用northern雜交方法、miRNA表達(dá)譜芯片、核酶保護(hù)分析技術(shù)、RAKE法、原位雜交 檢測(cè)腦卒中樣本中mir-4330和/或miR-4330的轉(zhuǎn)錄;采用ELISA和/或膠體金試紙條檢測(cè)腦 卒中樣本中miR-4330調(diào)控的靶基因的表達(dá)情況。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，基于定量PCR方法包括特異性擴(kuò)增mir-4330和/或miR-4330的引物;基于探針雜交方法包括與mir-4330和/或miR-4330的核酸序列 雜交的探針;免疫檢測(cè)方法包括與miR-4330調(diào)控基因表達(dá)蛋白特異性結(jié)合的抗體。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，檢測(cè)腦卒中樣本為外周血。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，治療腦卒中試劑包括抑制劑和/或抑制劑 組合物下調(diào)mir-4330和/或miR-4330的轉(zhuǎn)錄和/或阻斷miR-4330的活性。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，采用反義寡核苷酸、antagomiRs、miRNA海 綿、miRNA Erasers、Target Masking和/或多祀點(diǎn)反義寡核苷酸的方法下調(diào)mir-4330和/或 miR-4330的轉(zhuǎn)錄和/或阻斷miR-4330的活性。7. -種抑制腦卒中試劑，其特征在于，抑制腦卒中試劑包含： (a) 抑制劑和/或抑制劑組合物，所述的抑制劑和/或抑制劑組合物下調(diào)mir-4330和/或 miR-4330的轉(zhuǎn)錄和/或阻斷miR-4330的活性； (b) 藥劑學(xué)上能接受的載體。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的抑制腦卒中試劑，其特征在于，反義寡核苷酸、antagomiRs、 miRNA海綿、miRNA Erasers、Target Masking和/或多祀點(diǎn)反義寡核苷酸的方法下調(diào)mir-4330 和 / 或miR-4330 的轉(zhuǎn)錄和 / 或阻斷miR-4330 的活性。9. 一種腦卒中診斷試劑，其特征在于，腦卒中診斷試劑能夠檢測(cè)腦卒中樣本中mir-4330和/或miR-4330的轉(zhuǎn)錄或免疫檢測(cè)方法檢測(cè)腦卒中樣本中miR-4330調(diào)控的靶基因的表 達(dá)情況。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的腦卒中診斷試劑，其特征在于，所述腦卒中診斷試劑基于高 通量測(cè)序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探針雜交方法檢測(cè)腦卒中樣本中mir-4330 和/或miR-4330的轉(zhuǎn)錄或基于免疫方法檢測(cè)腦卒中樣本中miR-4330調(diào)控的靶基因的表達(dá)情 況，優(yōu)選采用northern雜交方法、miRNA表達(dá)譜芯片、核酶保護(hù)分析技術(shù)、RAKE法、原位雜交 檢測(cè)腦卒中樣本中mir-4330和/或miR-4330的轉(zhuǎn)錄;采用ELISA和/或膠體金試紙條檢測(cè)腦 卒中樣本中miR-4330調(diào)控的靶基因的表達(dá)情況。
【專利摘要】本發(fā)明涉及腦卒中的miRNA分子標(biāo)志物及其應(yīng)用，更具體的涉及mir-4330和/或miR-4330在診治腦卒中的新用途。發(fā)明通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)已發(fā)表的腦卒中的miRNA高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，選取后備miRNA進(jìn)行分子生物學(xué)驗(yàn)證，RT-PCR結(jié)果顯示，本發(fā)明提供的miR-4330和腦卒中密切相關(guān)，可用于臨床診斷及預(yù)防檢測(cè)，具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】A61P9/10, A61K31/7088, C12Q1/68, A61K48/00, A61K45/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105543389
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610077599
【發(fā)明人】何文貞, 陳思洽, 陳顯光, 李舜賢, 陳文杰
【申請(qǐng)人】汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院
【公開(kāi)日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年2月3日