病毒性出血性敗血癥病毒可視化核酸試紙條檢測(cè)引物組和檢測(cè)方法
【專利說(shuō)明】
[0001 ] 技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)可視化核酸試紙條檢測(cè)引物組和檢測(cè)方法。
[0002]【背景技術(shù)】:
病毒性出血性敗血癥(viralhaemorrhaic septicaemia，VHS)是由彈狀病毒引起娃、鱒、狗魚和大菱鲆等數(shù)十種魚類的一種烈性傳染病，表現(xiàn)為出血性敗血癥，致死率達(dá)90%?100%。本病主要流行于北半球，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)要求須申報(bào)的疫病，我國(guó)將其列為二類疫病。VHSV基因組為一段單鏈負(fù)鏈RNA，其線性基因組編碼5個(gè)蛋白，包括:核衣殼蛋白(N蛋白)，兩個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(Ml和M2蛋白)，糖蛋白(G蛋白)和RNA聚合酶(L蛋白)JHSV粒子長(zhǎng)約18011111，寬約7011111。其基因組長(zhǎng)度約121^個(gè)堿基。
[0003]目前國(guó)際上檢測(cè)病毒性出血性敗血癥病毒通常采用的方法是細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒法、血清學(xué)方法、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)分離VHSV法結(jié)果可靠，但是檢測(cè)周期長(zhǎng)，不適用于快速鑒別診斷;傳統(tǒng)的病毒細(xì)胞培養(yǎng)法和血清學(xué)法均受限于各自的特點(diǎn)，檢測(cè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難于滿足快速檢測(cè)的需要。因此，探討其快速診斷方法，對(duì)病毒性出血性敗血癥病毒的疫情監(jiān)控及流行病學(xué)調(diào)查，從而采取相應(yīng)的防治措施具有重要意義。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
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本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是:提供一種可以快速診斷病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)的方法。本發(fā)明在病毒性出血性敗血癥病毒5，端設(shè)計(jì)一對(duì)引物，建立VHSV可視化核酸試紙條檢測(cè)技術(shù)，并對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，該方法快速、靈敏、具有良好的特異性。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明提供的病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)可視化核酸試紙條檢測(cè)引物組，所述引物的序列如下:
VHSV281-F: 5 ’ -FITC-CAGGCGTTGTCCGTGCTTCT-3 ’，5 ’ 端標(biāo)記FITC；
VHSV281-R: 5 ’-b1tin-TCCCCGAGTTTCTTGGTGATGTA-3 ’，5 ’端標(biāo)記b1tin。
[0006]同時(shí)，本發(fā)明還提供一種病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)可視化核酸試紙條檢測(cè)方法，包括以下步驟:
①RT-PCR擴(kuò)增
提取VHSV總RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，具體參數(shù)為:45°C 10 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄;95°C 10 min熱啟動(dòng)；然后進(jìn)行35 次PCR循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s 循環(huán))；72 °C 7min；4°C
保溫；
②PCR產(chǎn)物試紙條檢測(cè)試驗(yàn)
取5 yL擴(kuò)增產(chǎn)物滴加在試紙條的樣品墊上，同時(shí)滴加2?3滴緩沖液，10 min后觀察質(zhì)控線、檢測(cè)線，判讀出陰、陽(yáng)性的結(jié)果;所述的緩沖液是RT-PCR產(chǎn)物檢測(cè)試紙條配套的緩沖液。
[0007]在檢測(cè)帶區(qū)域出現(xiàn)明顯紅色條帶為陽(yáng)性，否則為陰性。
[0008]本發(fā)明所使用的RT-PCR產(chǎn)物檢測(cè)試紙條是個(gè)通用型試紙條，包括里面配套使用的緩沖液。
[0009]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明通過(guò)將逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)與核酸試紙條檢測(cè)方法相結(jié)合，首次建立了一種核酸試紙條可視化檢測(cè)VHSV的方法，無(wú)需凝膠電泳檢測(cè)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所需要的制膠、電泳、成像等步驟，將2h的檢測(cè)時(shí)間縮短為10 min左右，大大提高了檢測(cè)效率，靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明核酸試紙條法的檢測(cè)靈敏度比傳統(tǒng)電泳凝膠成像高10倍以上，同時(shí)該方法檢測(cè)完后只產(chǎn)生少量的紙質(zhì)垃圾，處理簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境友好，而凝膠電泳法檢測(cè)結(jié)束后，產(chǎn)生染色凝膠及塑料手套，處理困難，后期處理成本也高。
[0010]本發(fā)明的方法具有操作便利、特異性強(qiáng)、靈敏度高，結(jié)果直觀、穩(wěn)定、可靠、對(duì)環(huán)境友好等多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，適合口岸檢疫實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行VHSV的快速篩查，提高了出入境口岸的鑒定工作效率，能更好地適應(yīng)進(jìn)出口貿(mào)易快速通關(guān)的要求，所使用的RT-PCR產(chǎn)物檢測(cè)試紙條是個(gè)通用型試紙條，可以廣泛應(yīng)用于PCR診斷試劑的開發(fā)，該檢測(cè)方法無(wú)需電泳儀、凝膠成像儀等儀器設(shè)備投入，應(yīng)用成本低，對(duì)于PCR檢測(cè)方法在基層實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用將有著巨大的推動(dòng)作用。
[0011]附圖或附表說(shuō)明:
圖1是VHSV核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果。
[0012]圖2是核酸試紙條檢測(cè)VHSV的特異性。
[0013]圖3是VHSV核酸試紙條方法的靈敏度測(cè)試。
[0014]圖4是實(shí)際樣品的VHSV的核酸試紙條檢測(cè)方法結(jié)果。
[0015]圖5是實(shí)際樣品的VHSV的凝膠成像檢測(cè)方法結(jié)果。
[0016]上述附圖中，每次核酸試紙條檢測(cè)都是做兩次平行試驗(yàn)。
[0017]【具體實(shí)施方式】:
下面通過(guò)具體實(shí)施例并結(jié)合附圖或附表進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0018]1.1病毒和細(xì)胞系
病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)及RNA、傳染性造血組織壞死病病毒(infect1ushaematopoietic necrosis virus，IHNV)RNA和趣春病毒(spring viraemia of carpvirus，SVCV)RNA等病毒均由山東出入境檢驗(yàn)檢疫局實(shí)驗(yàn)室保存。
[0019]1.2試劑與儀器
DL2000 DNA marker,Taq DNA聚合酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)Promega公司；ABI Proflex PCR儀;RT-PCR試劑盒(ABI AM1005)購(gòu)自ABI公司、通用型核酸擴(kuò)增物快速檢測(cè)試紙條(購(gòu)自杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司)。
[0020]1.3引物設(shè)計(jì)和RT-PCR擴(kuò)增
在VHSV 5，端設(shè)計(jì)保守引物，引物序列為
VHSV281-F (CAGGCGTTGTCCGTGCTTCT ) (5 ’ 端標(biāo)記FI TC );
VHSV281-R (TCCCCGAGTTTCTTGGTGATGTA)(5，端標(biāo)記b1tin)，擴(kuò)增長(zhǎng)度為281 bp。
[0021 ] RT-PCR擴(kuò)增參數(shù)為:45°C 10 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄;95°C 10 min熱啟動(dòng)；然后進(jìn)行35次PCR循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s 循環(huán))；72 °C 7min;4°C保溫。
[0022]實(shí)施例1: VHSV試紙條檢測(cè) PCR產(chǎn)物試紙條檢測(cè)試驗(yàn)
取5 yL擴(kuò)增產(chǎn)物滴加在試紙條的樣品墊上，同時(shí)滴加3滴緩沖液，10 min后觀察質(zhì)控線、檢測(cè)線，判讀出陰、陽(yáng)性的結(jié)果。
[0023]擴(kuò)增產(chǎn)物滴加在試紙條的樣品墊上檢測(cè)，在檢測(cè)帶區(qū)域出現(xiàn)明顯紅色條帶，空白對(duì)照沒(méi)有紅色條帶(圖1)。
[0024]實(shí)施例2:核酸試紙條方法的特異性
用VHSV281-F和VHSV281-R引物對(duì)對(duì)VHSV、IHNV、SVCV RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增并進(jìn)行核酸試紙條檢測(cè)，從檢測(cè)結(jié)果可以看出(圖2)，只有VHSV擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)特異性紅色條帶，IHNV、SVCV和空白對(duì)照在檢測(cè)線位置均無(wú)條帶出現(xiàn)，顯示了該檢測(cè)方法良好的特異性。
[0025]實(shí)施例3:核酸試紙條方法的靈敏度
提取并測(cè)定VHSV假病毒RNA的濃度，分別稀釋成6.6、33、66、6.6X102、6.6X103、6.6X104、6.6 X 105、6.6 X 106、6.6 X 17拷貝AxL,進(jìn)行RT-PCR，用核酸試紙條進(jìn)行檢測(cè)，從結(jié)果可以看出(圖3)，核酸試紙條方法可以檢測(cè)限可以達(dá)到33拷貝ΛΛ。
[0026]實(shí)施例4:實(shí)際樣品的VHSV檢測(cè)和靈敏度比較
提取并測(cè)定VHSV病毒RNA的濃度，分別進(jìn)行10倍稀釋至109倍，進(jìn)行RT-PCR，分別用凝膠成像法和核酸試紙條法進(jìn)行檢測(cè)，從結(jié)果可以看出(圖4和圖5)，核酸試紙條方法可以檢測(cè)可以達(dá)到108稀釋倍數(shù)，比凝膠成像法靈敏度高出10倍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)可視化核酸試紙條檢測(cè)引物組，其特征在于，所述引物的序列如下: VHSV281-F: 5 ’ -FITC-CAGGCGTTGTCCGTGCTTCT-3 ’，5 ’ 端標(biāo)記FITC； VHSV281-R: 5 ’-b1tin-TCCCCGAGTTTCTTGGTGATGTA-3 ’，5 ’端標(biāo)記b1tin。2.病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)可視化核酸試紙條檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: ①RT-PCR擴(kuò)增 提取VHSV總RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，具體參數(shù)為:45°C 10 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄;95°C 10 min熱啟動(dòng)；然后進(jìn)行35 次PCR循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s 循環(huán))；72 °C 7min；4°C保溫； RT-PCR擴(kuò)增體系(25yL/管)包括:(1)2 XRT-PCR Buffer 12.5yL； (2)PrimeScript IStep Enzyme Mix，lyL;(3) RNase Free dH20，8.5yL; (4)上游引物VHSV281-F和下游引物VHSV281-R(10yM)，各 IyL; (5)模板 IyL; ②PCR產(chǎn)物試紙條檢測(cè)試驗(yàn) 取5 yL擴(kuò)增產(chǎn)物滴加在試紙條的樣品墊上，同時(shí)滴加2?3滴緩沖液，10 min后觀察質(zhì)控線、檢測(cè)線，判讀出陰、陽(yáng)性的結(jié)果； 在檢測(cè)帶區(qū)域出現(xiàn)明顯紅色條帶為陽(yáng)性，否則為陰性。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)可視化核酸試紙條檢測(cè)引物組和檢測(cè)方法，所述引物的序列如下：VHSV281-F：5’-FITC-CAGGCGTTGTCCGTGCTTCT-3’，5’端標(biāo)記FITC；VHSV281-R：5’-biotin-TCCCCGAGTTTCTTGGTGATGTA-3’，5’端標(biāo)記biotin。檢測(cè)方法，包括以下步驟：①RT-PCR擴(kuò)增；②PCR產(chǎn)物試紙條檢測(cè)試驗(yàn)。本發(fā)明的方法具有操作便利、特異性強(qiáng)、靈敏度高，結(jié)果直觀、穩(wěn)定、可靠、對(duì)環(huán)境友好等多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，適合口岸檢疫實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行VHSV的快速篩查，提高了出入境口岸的鑒定工作效率，能更好地適應(yīng)進(jìn)出口貿(mào)易快速通關(guān)的要求，所使用的RT-PCR產(chǎn)物檢測(cè)試紙條是個(gè)通用型試紙條，可以廣泛應(yīng)用于ＰＣＲ診斷試劑的開發(fā)，該檢測(cè)方法無(wú)需電泳儀、凝膠成像儀等儀器設(shè)備投入，應(yīng)用成本低，對(duì)于ＰＣＲ檢測(cè)方法在基層實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用將有著巨大的推動(dòng)作用。
【IPC分類】C12R1/93, C12Q1/68, C12Q1/70, C12N15/11
【公開號(hào)】CN105543413
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610043757
【發(fā)明人】房保海, 崔淑華, 趙麗青, 厲艷, 趙鵬, 劉鑫
【申請(qǐng)人】山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
【公開日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年1月25日