一種體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域的一種動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基，具體涉及的是一種體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002]由于許多因素的影響，骨組織結(jié)構(gòu)、功能及骨代謝等方面的研究直接通過人體來進(jìn)行受到限制，因此體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞，作為常用的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停蔀檠芯抗巧?、病理及修?fù)組織工程的基礎(chǔ)。
[0003]1964年，Peck等就開始從事動物胚胎骨成骨細(xì)胞培養(yǎng)的研究工作，1979年Mills等首先報(bào)道用組織塊培養(yǎng)法在體外成功培養(yǎng)了人成骨細(xì)胞，此后陸續(xù)有成功培養(yǎng)成骨細(xì)胞的報(bào)道。主要的方法分為酶消化法和組織塊法，及改良的酶消法-組織塊法聯(lián)合培養(yǎng)方法。
[0004]這些方法采用的培養(yǎng)基多為基礎(chǔ)培養(yǎng)基加一定比例的胎牛血清制成的培養(yǎng)液。一般情況下，從骨組織中游離的成骨細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后需要20-30天之后才能達(dá)到匯合傳代，而且胎牛血清的體積含量比較高，一般會達(dá)到20%以上，胎牛血清的消耗比較大。因此，希望能夠提供一種成骨細(xì)胞的培養(yǎng)基，能夠加快成骨細(xì)胞的生長，且能減少血清的使用量。
[0005]銀耳多糖(TremeI lam)是從銀耳(Treme I la fuciformisBerk)的子實(shí)體中得到的多糖，其主鏈結(jié)構(gòu)是由α_( 1—3)糖苷鍵連接的甘露聚糖，支鏈由葡萄糖醛酸和木糖組成。銀耳多糖的在體內(nèi)的功能主要集中在兩個(gè)方面，一是針對非免疫系統(tǒng)，促進(jìn)胃腸遭有益微生物生長，調(diào)節(jié)腸道理想微生物菌群的形成，增強(qiáng)動物對外源性病原菌的抵抗能力;二是針對免疫防御系統(tǒng)，提高體液免疫能力，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞吞噬能力；提高淋巴細(xì)胞活性和功能，促進(jìn)細(xì)胞因子生長，保護(hù)紅細(xì)胞膜不易受到氧化損傷。其作用尤其表現(xiàn)在可預(yù)防和治療由放射與抗腫瘤藥物(如CTX)引起的骨髓抑制。試驗(yàn)結(jié)果顯示，用Co60射線進(jìn)行放療者，骨髓中有核細(xì)胞數(shù)，比不授予銀耳多糖的對照組多186%?？梢?，銀耳多糖可用于抑制骨髓抑制作用，可促進(jìn)成骨細(xì)胞生長。但目前沒用將銀耳多糖用于體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]發(fā)明目的
[0007]本發(fā)明提供一種體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的培養(yǎng)基，能夠加快成骨細(xì)胞的生長，且能減少血清的使用量。
[0008]技術(shù)方案
[0009]—種體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的培養(yǎng)基:包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基10.0-15.0g/L，銀耳多糖100-300mg/L，血清8-10mL，適量碳酸氫鈉調(diào)pH值為7.2-7.6，加水定容至11^所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為01^]?，€[-]\^]\1，1^]\0-1640，？12，01^]\0712;所述的銀耳多糖的純度大于75%;所述的血清為胎牛血清、小牛血清、人血清、馬血清和羊血清;本發(fā)明的培養(yǎng)基用于體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞。
[0010]有益效果
[0011]本發(fā)明特異性用于成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明能用于酶消化法、和組織塊法，及改良的酶消法-組織塊法聯(lián)合培養(yǎng)方法制備的成骨細(xì)胞，能夠加快成骨細(xì)胞的生長，且能減少血清的使用量。
【具體實(shí)施方式】
[0012]實(shí)施例1
[0013]低糖DMEM15.0g(HyClone)，銀耳多糖100mg/L，小牛血清10mL，適量碳酸氫鈉調(diào)pH值為7.2，加水定容至1L。
[0014]實(shí)施例2
[0015]a-MEM 15.0g(HyClone)，銀耳多糖200mg/L，胎牛血清8mL，適量碳酸氫鈉調(diào)pH值為7.4，加水定容至1L。
[0016]實(shí)施例3
[0017]酶消化法:取新生大鼠，75%乙醇浸泡，取頭蓋骨;將頭蓋骨置于磷酸緩沖液內(nèi)，清除骨膜、血管等結(jié)締組織，將洗凈的頭蓋骨剪成小片。將骨片用0.25%胰蛋白酶消化;終止反應(yīng)后，再用0.1% Π型膠原酶將骨片消化分離細(xì)胞;將含細(xì)胞的消化液離心lOmin，沉淀的細(xì)胞團(tuán)塊用實(shí)施例1制得的培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，按需密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后，換液I次，以后每二三天換液I次，培養(yǎng)約12d后達(dá)到匯合后傳代。
[0018]實(shí)施例4
[0019]組織塊法:取新生大鼠，75%乙醇浸泡，取頭蓋骨；用磷酸緩沖液沖洗后剪成小塊，用上清液反復(fù)沖洗至發(fā)白；用0.25 %胰蛋白酶溶液消化，棄消化液，剩余小塊移入培養(yǎng)瓶；加入實(shí)施例2制得的培養(yǎng)基，使小塊均勻分布于瓶底;將培養(yǎng)瓶輕放入5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。凈置2-3天，待細(xì)胞從骨塊邊長出后換培養(yǎng)基并棄骨塊。每2-3天換液I次，培養(yǎng)約1d后達(dá)到匯合后傳代。
[0020]實(shí)施例5
[0021]改良酶消化法:取新生大鼠，75%乙醇浸泡，取頭蓋骨；用磷酸緩沖液沖洗后剪成小塊;加入磷酸緩沖液，反復(fù)振蕩、沖洗3次，直到骨塊呈白色蜂窩狀;棄磷酸緩沖液，加入
0.25%胰蛋白酶消化。棄消化液(0.25%胰蛋白酶)，用實(shí)施例2制得的培養(yǎng)基洗滌2次，再用磷酸緩沖液洗I遍。棄磷酸緩沖液，用lg/L的Π型膠原酶消化。加入實(shí)施例2制得的培養(yǎng)基終止消化，離心后用實(shí)施例2制得的培養(yǎng)基洗滌3次。棄洗滌液，加入實(shí)施例2制得的培養(yǎng)基吹打骨塊，使更多成骨細(xì)胞游離出來，吹散細(xì)胞沉淀后，加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；所有培養(yǎng)瓶置入37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng);24h后，換液I次，以后每3天換液I次，培養(yǎng)約7d后達(dá)到匯合后傳代。
[0022]實(shí)施例6
[0023]成骨細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)染色鑒定:實(shí)施例3、實(shí)施例4和實(shí)施例5得到的細(xì)胞按2X 1Vcm2的密度接種于25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，分別培養(yǎng)7、10、14、20天后，用95%酒精固定15min，干燥后，用孵育液(2%巴比妥鈉5πι1+3%β-甘油磷酸鈉5ml+2%硝酸鈣10ml+2%硫酸鎂5ml+蒸餾水25ml，其中2%硝酸鈣、2%硝酸鈷和I %硫化銨，臨用前新鮮配制)37°C孵育2h，蒸餾水沖洗，加2 %硝酸鈣作用2min，再加2 %硝酸鈷作用2min，蒸餾水沖洗，I %硫化銨作用lmin，自來水洗。結(jié)果顯示:實(shí)施例3、實(shí)施例4和實(shí)施例5得到的細(xì)胞堿性磷酸酶呈強(qiáng)陽性，鑒定為成骨細(xì)胞。
[0024]實(shí)施例7
[0025]實(shí)施例5得到的鼠成骨細(xì)胞的增值率:采用MTT比色法。將對數(shù)生長的鼠成骨細(xì)胞，以1.0 X 15加入96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h，實(shí)驗(yàn)孔加入實(shí)施例2培養(yǎng)基；空白組加入相同體積的DMEM培養(yǎng)基(HyClone，含胎牛血清20 % )。每孔設(shè)五個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h，每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育30min，在酶標(biāo)儀620nm處測定吸光度A值，按公式成骨細(xì)胞增殖率=(I一實(shí)驗(yàn)組吸光值/對照組吸光值)X 100%。實(shí)施例2培養(yǎng)基培養(yǎng)的鼠成骨細(xì)胞的增值率為214.9±23.6%，與普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的鼠成骨細(xì)胞相比有顯著性差異(p<0.05)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的培養(yǎng)基:其特征在于:包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基10.0-15.0g/L，銀耳多糖100-30011^/1，血清8-101^，碳酸氫鈉調(diào)?!1值為7.2-7.6，加水定容至1 L。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外培養(yǎng)基，其特征在于:所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM，α-ΜΕΜ，RPM1-1640，F(xiàn)l2，DMEM/F12。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外培養(yǎng)基，其特征在于:所述的銀耳多糖的純度大于75%。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外培養(yǎng)基，其特征在于:所述的血清為胎牛血清、小牛血清、人血清、馬血清和羊血清。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的體外培養(yǎng)基，其特征在于:用于體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的培養(yǎng)基。其特征在于：包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基10.0-15.0g/L，銀耳多糖100-300mg/L，血清8-10mL，適量碳酸氫鈉調(diào)pH值為7.2-7.6，加水定容至1L；所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM,α-MEM，RPMI-1640，F(xiàn)12，DMEM/F12；所述的銀耳多糖的純度大于75%；所述的血清為胎牛血清、小牛血清、人血清、馬血清和羊血清；本發(fā)明的培養(yǎng)基用于體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞。本發(fā)明的有益效果在于能夠加快成骨細(xì)胞的生長，且能減少血清的使用量。
【IPC分類】C12N5/071
【公開號】CN105567629
【申請?zhí)枴緾N201610065980
【發(fā)明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達(dá)生物科技有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年1月30日