LI植株-L20植株的葉片的基因組DNA為模板的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，泳道21為陰性對(duì)照，泳道22為空白對(duì)照，泳道23為陽(yáng)性對(duì)照)。結(jié)果表明，如果以擬轉(zhuǎn)bar基因植株的葉片的基因組DNA為模板，能夠擴(kuò)增出約1955bp的條帶，則該擬轉(zhuǎn)bar基因植株即為轉(zhuǎn)bar基因陽(yáng)性植株;空白對(duì)照和陰性對(duì)照均不能獲得1955bp的條帶；陽(yáng)性對(duì)照可以獲得1955bp的條帶。
[0154]2、bar蛋白快速檢測(cè)
[0155](I)取步驟七獲得的LI植株的葉片0.lg，放入2mL離心管中，研磨。
[0156](2)完成步驟(I)后，加入Pat/bar檢測(cè)試紙條(美國(guó)Envirologix公司產(chǎn)品)附贈(zèng)的SEB2緩沖液lmL，混勻。
[0157](3)完成步驟(2)后，將Pat/bar檢測(cè)試紙條垂直插入2mL離心管中，樣品端淹沒(méi)入樣品液的深度約為0.5cm，Imin后取出放平閱讀檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為:在Pat/bar檢測(cè)試紙條上出現(xiàn)兩條紫紅色條帶，一條為紫紅色檢測(cè)線，一條為紫紅色質(zhì)控線，即為陽(yáng)性結(jié)果(圖4中A);在Pat/bar檢測(cè)試紙條上僅出現(xiàn)一條紫紅色質(zhì)控線即陰性結(jié)果(圖4中B)。
[0158]按照上述方法，將LI植株依次替換為L(zhǎng)2植株-L20植株，分別獲得L2-L20植株的bar蛋白檢測(cè)結(jié)果。
[0159]按照上述方法，將LI植株替換為X178、作為陰性對(duì)照，將LI植株替換為等質(zhì)量超純水、作為空白對(duì)照，將LI植株替換為等質(zhì)量的步驟I鑒定為轉(zhuǎn)bar基因陽(yáng)性植株的葉片、作為陽(yáng)性對(duì)照。
[0160]實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5(泳道1-20依次為L(zhǎng)I植株-L20植株，泳道21為陰性對(duì)照，泳道22為空白對(duì)照，泳道23為陽(yáng)性對(duì)照))，結(jié)果表明，LI植株、L2植株、L4植株、L8植株、L9植株、LI2植株、L14植株、L16植株、L17植株和L20植株均能得到兩條紫紅色條帶，即為陽(yáng)性轉(zhuǎn)bar基因植株。陽(yáng)性對(duì)照能得到兩條紫紅色條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照均得到一條紫紅色條帶。
[0161]用Pat/bar檢測(cè)試紙條和步驟I的分子檢測(cè)方法分別對(duì)步驟八獲得的20株擬轉(zhuǎn)PCAMBIA3301植株檢測(cè)，檢測(cè)的陽(yáng)性植株結(jié)果完全一致。
[0162]九、轉(zhuǎn)化效率
[0163]遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行兩組試驗(yàn)(第一組對(duì)2014玉米的幼胚進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，第二組對(duì)2015玉米的幼胚進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化)，每組試驗(yàn)中設(shè)置三個(gè)重復(fù)處理，每個(gè)重復(fù)處理中對(duì)100個(gè)玉米幼胚進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。
[0164]按照步驟一至八的方法對(duì)2014年和2015年兩年的X178的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì):轉(zhuǎn)化效率在0.1-5%之間。轉(zhuǎn)化效率(% ) =PCR陽(yáng)性植株株數(shù)/侵染的幼胚總數(shù)X100%。
[0165]按照實(shí)施例1和實(shí)施例2的方法，將X178替換為綜31，其它步驟均不變，2014年和2015年兩年的綜31的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:轉(zhuǎn)化效率在0.1-5%之間。
[0166]可見(jiàn)，將本發(fā)明提供的玉米自交系遺傳轉(zhuǎn)化的方法應(yīng)用在X178和綜31的遺傳轉(zhuǎn)化中，可獲得較高的轉(zhuǎn)化率。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種玉米自交系遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟: (1)將含有目的基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，得到重組農(nóng)桿菌； (2)取步驟(I)得到的重組農(nóng)桿菌，對(duì)玉米自交系的外植體進(jìn)行侵染； (3)完成步驟(2)后，取所述外植體，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基，進(jìn)行共培養(yǎng)； (4)完成步驟(3)后，取所述外植體，置于恢復(fù)培養(yǎng)基I，進(jìn)行初次恢復(fù)培養(yǎng)； (5)完成步驟(4)后，取所述外植體，依次在篩選培養(yǎng)基I和篩選培養(yǎng)基Π上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得抗性愈傷組織； (6)完成步驟(5)后，取所述抗性愈傷組織，置于恢復(fù)培養(yǎng)基Π，進(jìn)行二次恢復(fù)培養(yǎng)； (7)完成步驟(6)后，取所述抗性愈傷組織，置于分化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，獲得幼苗； (8)完成步驟(7)后，取所述幼苗置于生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，獲得玉米自交系轉(zhuǎn)化苗。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 每IL所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基包括:MS鹽3.90?4.80g、煙酸1.2?I0.23?0.28mg、VB6 0.23?0.28mg、泛酸鈣0.23?0.28mg、鹽酸硫胺0.45?0.55mg、蔗糖27.0?33.0g、L_脯氨酸 I.24?I.52g、2，4-D 0.45 ?0.55mg、6-BA 0.009 ?0.0I Img、植物凝膠3.15?3.85g和90?I ΙΟμπιοΙ乙酰丁香酮，所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的溶劑為水，所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的pH值為5.4?6.0; 每IL所述恢復(fù)培養(yǎng)基I包括:MS鹽3.90?4.80g、煙酸I.2?I.4mg,VBi 0.23?0.28mg、VB6 0.23?0.28mg、泛酸鈣0.23?0.28mg、鹽酸硫胺0.45?0.55mg、蔗糖27.0?33.0g、L_脯氨酸1.24?1.52g、2，4-D 0.45?0.55mg、6_BA 0.009?0.0llmg、植物凝膠3.15?3.85g、特美汀90?I 1mg和AgN033.1?3.7mg，所述恢復(fù)培養(yǎng)基I的溶劑為水，所述恢復(fù)培養(yǎng)基I的pH值為5.4?6.0; 每IL所述篩選培養(yǎng)基I包括:MS鹽3.90?4.80g、煙酸I.2?I.4mg,VBi 0.23?0.28mg、VB6 0.23?0.28mg、泛酸鈣0.23?0.28mg、鹽酸硫胺0.45?0.55mg、蔗糖27.0?33.0g、L_脯氨酸1.24?1.52g、2，4-D 0.45?0.55mg、6_BA 0.009?0.0llmg、植物凝膠3.15?3.85g、特美汀90?11 Omg、雙丙氨膦1.35?1.65mg和AgNO33.1?3.7mg，所述篩選培養(yǎng)基I的溶劑為水，所述篩選培養(yǎng)基I的PH值為5.4?6.0; 每IL所述篩選培養(yǎng)基Π包括:MS鹽3.90?4.80g、煙酸1.2?1.^igJB1 0.23?0.28mg、VB6 0.23?0.28mg、泛酸鈣0.23?0.28mg、鹽酸硫胺0.45?0.55mg、蔗糖27.0?33.0g、L_脯氨酸1.24?1.52g、2，4-D 0.45?0.55mg、6_BA 0.009?0.0llmg、植物凝膠3.15?3.85g、特美汀90?110mg、雙丙氨膦2.7?3.3mg和AgN033.1?3.7mg，所述篩選培養(yǎng)基Π的溶劑為水，所述篩選培養(yǎng)基Π的pH值為5.4?6.0; 每IL所述恢復(fù)培養(yǎng)基Π包括:MS鹽3.90?4.80g、煙酸1.2?1.^igJB1 0.23?0.28mg、VB6 0.23?0.28mg、泛酸鈣0.23?0.28mg、鹽酸硫胺0.45?0.55mg、蔗糖27.0?33.0g、L_脯氨酸1.24?1.52g、6-BA 3.15?3.85mg、毒莠定0.9?I.lmg、植物凝膠3.15?3.85g、特美汀90?11Omg和雙丙氨膦1.35?1.65mg，所述恢復(fù)培養(yǎng)基Π的溶劑為水，所述恢復(fù)培養(yǎng)基Π的pH值為5.4?6.0; 每IL所述分化培養(yǎng)基包括al)或a2): &1)]\^鹽3.90?4.8(^、煙酸1.2?1.411^、￥81 0.23?0.28mg、VB6 0.23?0.28mg、泛酸鈣0.23?0.28mg、鹽酸硫胺0.45?0.5511^、鹿糖10?158、葡萄糖15?2(^、1^-脯氨酸0.63?0.778、植物凝膠3.15?3.858、酪蛋白水解物0.18?0.228、甘氨酸0.036?0.0448、肌醇0.09?0.1Ig和雙丙氨勝2.7?3.3mg， &2)蔗糖27.0?33.(^、1^-脯氨酸0.63?0.778、植物凝膠3.15?3.858、題03 2547?3113mg、(NH4)2S04 417?509mg、KH2P04 360?440mg、MgS04.7H20 167?204mg、CaCl2.2H20149?183mg、MnS04.H2O 6.8?8.4mg、ZnS04*7H20 1.8?2.2mg、H3B03 2.7?3.3mg、KI0.68?0.83mg、Na2Mo04.2H20 0.23?0.28mg、CuS04.5H20 0.023?0.028mg、CoCl2.6H2O0.023?0.028mg、乙二胺四乙酸鈉鐵鹽32.9?40.lmg、氯化膽堿0.088?0.108mg、VB20.044?0.054mg、D-生物素0.09?0.I lmg、煙酸0.18?0.22mg、葉酸0.0437?0.0534mg、VBi0.425?0.519mg、D_泛酸I丐0.09?0.llmg、VB6 0.18?0.22mg、VBi20.0014?0.0017mg、對(duì)氛基苯甲酸0.044?0.054mg、酪蛋白水解物0.18?0.22g、甘氨酸0.036?0.044g、肌醇0.09?0.1lg和雙丙氨膦2.7?3.3mg， 所述分化培養(yǎng)基的溶劑為水，所述分化培養(yǎng)基的pH值為5.5?6.1; 每IL所述生根培養(yǎng)基包括:MS鹽1.949?2.382g、蔗糖27.0?33.0g、植物凝膠3.15?3.85g和雙丙氨膦2.7?3.3mg，所述生根培養(yǎng)基的溶劑為水，所述生根培養(yǎng)基的pH值為5.4?6.003.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述步驟(I)中，所述玉米自交系的外植體為玉米自交系的幼胚。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述玉米自交系的幼胚的直徑為1.5mm±0.5mm ο5.如權(quán)利要求1至4任一所述的方法，其特征在于:所述“侵染”的方法如下:將所述玉米自交系的幼胚置于農(nóng)桿菌侵染液中10?20min; 所述農(nóng)桿菌侵染液為將所述重組農(nóng)桿菌懸浮于侵染培養(yǎng)基得到的； 每IL所述侵染培養(yǎng)基包括:蔗糖61.6?75.2g，(NH4)2S04 417?509mg ,KNO3 2547?3113mg、KH2P04 360?440mg、MgS04.7H20 167?204mg、CaCl2.2H20 149?183mg、MnS04.H2O6.8?8.4mg、ZnS04.7H2O I.8?2.2mg、H3B03 2.7?3.3mg、KI 0.68?0.83mg、Na2Mo04.2H200.23?0.28mg、CuS04.5H20 0.023?0.028mg、CoCl2.6H2O 0.023?0.028mg、乙二胺四乙酸鈉鐵鹽32.9?40.lmg、氯化膽堿0.088?0.108mg、VB20.044?0.054mg、D_生物素0.09?0.I lmg、煙酸0.18?0.22mg、葉酸0.0437?0.0534mg、VBi 0.425?0.519mg、D_泛酸鈣0.09?0.11mg、VB6 0.18?0.22mg、VBi2 0.0014?0.0017mg、對(duì)氨基苯甲酸0.044?0.054mg和90?IlOmol乙酰丁香酮，所述侵染培養(yǎng)基的溶劑為水，所述侵染培養(yǎng)基的pH值為4.9?5.5ο6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述農(nóng)桿菌侵染液的OD55Qnm值為0.3?0.4。7.如權(quán)利要求1至6任一所述的方法，其特征在于: 所述步驟(3)中所述共培養(yǎng)的條件為18?22°C、暗培養(yǎng)24?48h; 所述步驟(4)中所述初次恢復(fù)培養(yǎng)的條件為28?31°C、暗培養(yǎng)7?14天； 所述步驟(5)中所述培養(yǎng)的條件為28?31°C、暗培養(yǎng)10?18天； 所述步驟(6)中所述二次恢復(fù)培養(yǎng)的條件為28?31°C、暗培養(yǎng)7?14天； 所述步驟(7)中所述培養(yǎng)的條件為25?29 °C、光照培養(yǎng)7?14天； 所述步驟(8)中所述培養(yǎng)的條件為25?29 °C。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于: 所述步驟(3)中所述共培養(yǎng)的條件為20 °C、暗培養(yǎng)36h; 所述步驟(4)中所述初次恢復(fù)培養(yǎng)的條件為29 °C，暗培養(yǎng)10天； 所述步驟(5)中所述培養(yǎng)的條件為290C，暗培養(yǎng)14天； 所述步驟(6)中所述二次恢復(fù)培養(yǎng)的條件為29 °C，暗培養(yǎng)10天； 所述步驟(7)中所述培養(yǎng)的條件為270C，光照培養(yǎng)10天； 所述步驟(8)中所述培養(yǎng)的條件為27 0C。9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于:所述光照培養(yǎng)具體為光暗交替培養(yǎng)，光暗交替培養(yǎng)的周期具體為18小時(shí)光照培養(yǎng)/6小時(shí)黑暗培養(yǎng)，所述光暗交替培養(yǎng)時(shí)的光照強(qiáng)度為 80 ?100yE/m2/so10.用于玉米自交系遺傳轉(zhuǎn)化的試劑盒: 所述試劑盒含有權(quán)利要求1中所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基和/或所述恢復(fù)培養(yǎng)基I和/或所述篩選培養(yǎng)基I和/或所述篩選培養(yǎng)基π和/或所述恢復(fù)培養(yǎng)基Π和/或所述分化培養(yǎng)基和/或所述生根培養(yǎng)基。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種玉米自交系遺傳轉(zhuǎn)化的方法。本發(fā)明所提供的玉米自交系遺傳轉(zhuǎn)化的方法包括下述步驟：將含有目的基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，得到重組農(nóng)桿菌；重組農(nóng)桿菌對(duì)玉米自交系的幼胚進(jìn)行侵染；取所述玉米自交系的幼胚，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基，進(jìn)行共培養(yǎng)；取所述玉米自交系的幼胚，依次置于恢復(fù)培養(yǎng)基I、篩選培養(yǎng)基I、篩選培養(yǎng)基II、恢復(fù)培養(yǎng)基II和分化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，獲得幼苗；取所述幼苗置于生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，獲得玉米自交系轉(zhuǎn)化苗。將本發(fā)明提供的玉米自交系遺傳轉(zhuǎn)化的方法應(yīng)用在玉米自交系遺傳轉(zhuǎn)化中，可獲得較高的轉(zhuǎn)化率，對(duì)玉米育種及玉米基因功能研究工作具有重要意義。
【IPC分類(lèi)】A01H4/00, C12N15/82
【公開(kāi)號(hào)】CN105567730
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610069994
【發(fā)明人】賴(lài)錦盛, 宋偉彬, 趙海銘
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2016年2月1日