一種人NOTCH1 NICD蛋白Ser2162位點(diǎn)磷酸化抗體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及抗體及其制備技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種特異性針對(duì)人N0TCH1 NICD蛋 白Ser2162位點(diǎn)憐酸化抗體及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] NOTCH信號(hào)是一個(gè)在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的信號(hào)通路，廣泛存在于無(wú)脊椎動(dòng)物和 脊椎動(dòng)物的多個(gè)物種之中，它是介導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞之間直接接觸的主要信號(hào)通路之一，調(diào)控 了多細(xì)胞機(jī)體的細(xì)胞調(diào)亡、增殖和分化。從果蛹到人類(lèi)，NOTCH信號(hào)途徑的遺傳特征高度保 守，而在哺乳動(dòng)物中其過(guò)程尤為復(fù)雜。
[0003] NOTCH受體、NOTCH配體和細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子C化共同組成NOTCH信號(hào)通路。NOTCH受體 為單鏈跨膜蛋白，其分子由胞外區(qū)化CN)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)(NICD)組成，具有高度保守性(參 見(jiàn)圖1)。目前哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)4種NOTCH基因（N0TCH1，N0TCH 2，N0TCH 3，N0TCH 4)，各亞型 的主要差異在EGF樣重復(fù)的數(shù)目和胞內(nèi)區(qū)的長(zhǎng)度。NOTCH配體亦為細(xì)胞表面表達(dá)的單鏈跨膜 蛋白，已發(fā)現(xiàn)人的NOTCH配體有Jagged 1 Jagged 2，Del1:a l，Del1:a 3，Del1:a 4。
[0004] NOTCH信號(hào)蛋白受體與配體相互作用導(dǎo)致NOTCH蛋白連續(xù)裂解，釋放出胞內(nèi)段蛋白 (NICD)，N0T〇n NICD轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，通過(guò)與CBFl/Su化)/LAGl(CSL)相互作用形成復(fù)合物， 使后者由轉(zhuǎn)錄抑制因子轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)錄激活因子。NICD-CBFl/Su化)/LAGl(C化)復(fù)合物直接誘 導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的祀基因是皿S1，皿S1是堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)類(lèi)轉(zhuǎn) 錄因子，它又調(diào)節(jié)其它與細(xì)胞分化直接相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞分化中，NOTCH信號(hào)的功能 有W下幾個(gè)方面:①參與胚胎發(fā)育;②參與T細(xì)胞發(fā)育;③維持造血干細(xì)胞的自我更新;④調(diào) 節(jié)血管生成。
[0005] N0TCH1信號(hào)途徑參與細(xì)胞的分化、增值和調(diào)亡，并影響許多器官的發(fā)育和功能，其 病理生理改變與腫瘤、血液系統(tǒng)、屯、血管系統(tǒng)、干細(xì)胞等多種疾病相關(guān)。研究表明：在腫瘤的 發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，N0TCH1信號(hào)通路發(fā)揮著不同的作用;在大多數(shù)惡性腫瘤中，N0TCH1信號(hào) 主要為促癌作用，活化的N0TCH1蛋白可使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化發(fā)展為腫瘤，如在宮頸癌、頭頸腫 瘤、腎癌及多種血液系統(tǒng)腫瘤中均發(fā)現(xiàn)N0TCH1的異常表達(dá);N0TCH1信號(hào)的素亂會(huì)阻止細(xì)胞 分化，使得未分化細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化;而在B細(xì)胞白血病等腫瘤中，N0TCH1則可W抑制細(xì)胞生 長(zhǎng)誘導(dǎo)調(diào)亡。在宮頸癌的早期，N0TCH1信號(hào)起促癌作用，晚期則起抑癌作用。運(yùn)表明N0TCH1 在不同腫瘤和腫瘤的不同階段中，其發(fā)揮的作用也不盡相同。此外，由于N0TCH1信號(hào)通路可 能作為多條通路的重要交匯點(diǎn)，N0TCH1信號(hào)的異常不僅對(duì)腫瘤的發(fā)生有直接的作用，而且 能通過(guò)對(duì)其他通路的影響間接地誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。
[0006] 憐酸化、泛素化等翻譯后修飾在NOTCH信號(hào)通路介導(dǎo)的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著 關(guān)鍵作用。細(xì)胞中N0TCH1 NICD蛋白的降解對(duì)于N0TCH1信號(hào)通路的精準(zhǔn)調(diào)控具有非常重要 的意義，其半衰期主要由泛素化修飾和蛋白酶體介導(dǎo)的降解進(jìn)行調(diào)節(jié)。已有研究表明： NOTCH蛋白泛素化修飾的前提條件是N0TCH1 NICD蛋白必須進(jìn)行憐酸化修飾。若N0TCH1 NICD蛋白憐酸化修飾發(fā)生異常，將造成半衰期的延長(zhǎng)而導(dǎo)致白血病和其它癌癥的發(fā)生。因 此，N0TCH1 NICD蛋白的憐酸化修飾在N0TCH1信號(hào)通路的調(diào)控中扮演著重要角色。此外，已 有證據(jù)表明：N0TCH1蛋白的憐酸化修飾可依賴(lài)于GSK-3的敦酶，而GSK-3的敦酶在Wnt-1信號(hào)通 路中亦發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，因此NOTCH信號(hào)通路與Wnt-1信號(hào)通路存在交叉反應(yīng)。 N0TCH1蛋白的持續(xù)活化對(duì)Wnt-1信號(hào)通路將產(chǎn)生一定的影響，從而導(dǎo)致細(xì)胞的致癌性轉(zhuǎn)化。 ΝΟΤΟΠ 氨基酸序列中Ser2162位點(diǎn)位于NOTCH的胞內(nèi)段序列區(qū)，是ΝΟΤΟΠ NICD蛋白憐酸化 修飾的一個(gè)位點(diǎn)，在N0TCH1 NICD蛋白降解失活的動(dòng)態(tài)調(diào)控中可能具有重要的作用。
[0007] 抗體是蛋白質(zhì)功能研究的重要工具，已被廣泛用于腫瘤等疾病診斷、治療等臨床 應(yīng)用中，憐酸化抗體的制備和應(yīng)用已成為國(guó)際上關(guān)注的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明目的在于解決在N0TCH1信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用的NICD蛋白憐酸化修飾 有效研究的問(wèn)題，N0TCH1 NICD蛋白發(fā)揮作用的首要條件是進(jìn)行翻譯后修飾作用，如憐酸化 修飾。為此本發(fā)明提供一種特異性針對(duì)人N0TCH1 NICD蛋白Ser2162位點(diǎn)憐酸化抗體的制備 方法。
[0009] 本發(fā)明提供的人N0TCH1 NI CD蛋白Ser 2162位點(diǎn)憐酸化抗體的制備方法可W包括 W下步驟：（1)合成包含如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列的抗原合成膚；（2)利用步驟（1) 合成的抗原合成膚免疫動(dòng)物并收集抗血清；（3)將步驟(2)收集的抗血清進(jìn)行純化和鑒定， 得到人N0TCH1 NICD蛋白Ser2162位點(diǎn)憐酸化抗體。
[0010] 上述步驟（1)中所述的抗原合成膚可W通過(guò)W下步驟合成：W人N0TCH1 NICD蛋白 Ser2162位點(diǎn)為中屯、兩側(cè)各郵鄰4個(gè)氨基酸設(shè)計(jì)氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的合成膚， 并采用多膚合成技術(shù)進(jìn)行合成，在氨基酸Ser2162上添加憐酸化基團(tuán)，同時(shí)在N末端連接一 個(gè)半脫氨酸與載體蛋白血藍(lán)蛋白化LH)或牛血清白蛋白（BSA)進(jìn)行偶聯(lián)。
[0011] 上述步驟(2)中所述的免疫動(dòng)物的步驟可W包括：用上述步驟（1)合成的抗原合成 膚與佐劑聯(lián)合免疫新西蘭大白兔;免疫方式為經(jīng)頸部、背部皮膚較薄、松弛的部位兩側(cè)皮下 注射，臀肌與大腿部?jī)蓚?cè)分別肌肉注射，腰部?jī)蓚?cè)皮內(nèi)注射，爪墊注射等多部位多點(diǎn)注射； 免疫次數(shù)包括1次引發(fā)注射，3~4次加強(qiáng)注射和最后一次抗原直接注射。
[0012] 上述步驟(3)中所述的純化和鑒定的步驟可W包括:將上述步驟(2)收集的抗血清 WELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定抗血清針對(duì)目的合成膚的效價(jià)及其是否能夠特異性識(shí)別目的合成膚，利 用親和分離-親和純化循環(huán)技術(shù)對(duì)抗血清進(jìn)行純化，WDot blot和Western blot實(shí)驗(yàn)確定 抗血清是否能夠特異性識(shí)別憐酸化N0TCH1 NICD蛋白。
[0013] 上述利用親和分離-親和純化循環(huán)技術(shù)對(duì)抗血清進(jìn)行純化的步驟可W包括:采用 合成膚偶聯(lián)瓊脂糖層析柱的親和層析法進(jìn)行抗體親和分離及親和純化;首次采用非憐酸化 合成膚偶聯(lián)瓊脂糖作為層析柱的填料進(jìn)行親和分離除去抗血清中的非憐酸化抗體，得到含 憐酸化抗體流出液;接著使用憐酸化合成膚偶聯(lián)瓊脂糖作為層析柱的填料進(jìn)行親和純化， 除去憐酸化抗體中低親和力的低序列復(fù)雜性表位抗體。
[0014] 本發(fā)明還提供一種通過(guò)上述方法所制備的人ΝΟΤΟΠ NICD蛋白Ser2162位點(diǎn)憐酸 化抗體。
[0015] 本發(fā)明還提供上述人N0TCH1 NICD蛋白Ser2162位點(diǎn)憐酸化抗體在制備用于腫瘤、 血液系統(tǒng)、屯、血管系統(tǒng)疾病的診斷、治療及預(yù)后判定的藥物制劑中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明還提供一種用于腫瘤、血液系統(tǒng)、屯、血管系統(tǒng)疾病的診斷、治療及預(yù)后判定 的藥物制劑，其包括上述的人N0TCH1 NICD蛋白Ser2162位點(diǎn)憐酸化抗體。
[0017] 本發(fā)明還提供一種合成膚在制備用于腫瘤、血液系統(tǒng)、屯、血管系統(tǒng)疾病的診斷、治 療及預(yù)后判定的藥物制劑中的應(yīng)用，所述合成膚包含如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列。
[0018] 上述藥物制劑包括上述的人N0TCH1 NICD蛋白Ser2162位點(diǎn)憐酸化抗體。
[0019] 本發(fā)明制備得到的高特異性的人N0TCH1 NICD蛋白Ser2162位點(diǎn)憐酸化抗體可用 Western blot實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及用藥后腫瘤細(xì)胞的表達(dá)差異，有助于研究 N0TCH1 NICD蛋白的憐酸化修飾在腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，為臨床腫瘤疾病的診 斷或治療提供潛在的作用祀點(diǎn)，還可W用ICC、化ISA等免疫學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)W檢測(cè)人N0TCH1 NICD蛋白的憐酸化水平，探討其與腫瘤、血液系統(tǒng)、屯、血管系統(tǒng)等疾病的關(guān)系，在疾病診斷、 治療及預(yù)后判定等方面具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。
[0020] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及實(shí)現(xiàn)的有益效果：（1)本發(fā)明提供憐酸化抗體在實(shí)際應(yīng)用中能夠 檢測(cè)人ΝΟΤΟΠ NICD蛋白的翻譯后憐酸化修飾情況；（2)本發(fā)明提供的憐酸化抗體在實(shí)際應(yīng) 用中便于探討人N0TCH1 NICD蛋白特定位點(diǎn)憐酸化修飾與特定生物學(xué)事件如細(xì)胞應(yīng)激、DNA 損失、細(xì)胞周期等的相關(guān)性；（3)本發(fā)明是針對(duì)人N0TCH1 NICD蛋白Ser2162位點(diǎn)憐酸化多克 隆抗體，有助于研究介導(dǎo)其發(fā)生憐酸化的激酶作用，探討人N0TCH1 NICD蛋白多種生物學(xué)功 能在N0TCH1細(xì)胞信號(hào)通路及蛋白/核酸相互作用網(wǎng)絡(luò)；（4)本發(fā)明提供的憐酸化抗體有助于 探討N0TCH1 NICD蛋白的憐酸化修飾在腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制，亦可用于檢 測(cè)用藥后腫瘤相關(guān)蛋白表達(dá)的差異，為臨床腫瘤疾病的診斷與治療提供潛在的作用祀點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1是N0TCH1蛋白結(jié)構(gòu)圖。
[0022] 圖2是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的的制備與純化高特異性的人N0TCH1 NICD憐酸化抗體 技術(shù)路線圖。
[0023] 圖3是N0TCHl_Human PhosohoSitePlus查詢(xún)結(jié)果屏幕截圖，其中，SS:蛋白質(zhì)組學(xué) 檢測(cè)文獻(xiàn);MS:質(zhì)譜檢測(cè)文獻(xiàn)。
[0024] 圖4是N0TCH1 NICD抗原性分析結(jié)果。
[00巧]圖5是N0TCH1 NICD疏水性性分析結(jié)果。
[00%] 圖6a是合成膚pSer2162-KLH的HPLC純化結(jié)果。
[0027] 圖化是合成膚pSer2162-KLH的Mass Spectral檢測(cè)結(jié)果。
[0028] 圖7a是合成膚pSer2162-BSA的HPLC純化結(jié)果。
[00巧]圖7b是合成膚pSer2162-BSA的Mass Spectral檢測(cè)結(jié)果。
[0030] 圖8a是合成膚Ser2162-BSA的HPLC純化結(jié)果。
[0031] 圖8b是合成膚Ser2162-BSA的Mass Spectral檢測(cè)結(jié)果。
[0032] 圖9是S2162-BSA、pS2162-BSA蛋白電泳圖，其中，l:S2162-BSA;2:pS2162-BSA;M: Marker(Bro曰d)C
[0033] 圖10是免疫前篩選Western blot結(jié)果圖，其中，1:BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白（5yg);2:S2162- BSA合成膚(5yg) ;3:pS2162-BSA合成膚(5yg); -抗：陰性血清1:5000稀釋液。
[0034] 圖 11 是PS2162-KLH蛋白電泳圖，其中，M:Marker(Broad); 1 :pS2162-KLH。
[0035] 圖12是非憐酸化層析柱和憐酸化層析柱的偶聯(lián)效率檢測(cè)