一種黑痣菌子囊果提取基因組dna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種真菌DNA的提取方法，尤其涉及一種黑痣菌子囊果提取基因組DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]獲取高質(zhì)量的總DNA是進行分子生物學(xué)研究的前提和基礎(chǔ)，不少學(xué)者對不同類群真菌的的DNA提取方法進行過研究。目前用于真菌DNA的提取方法主要有CTAB法(十六烷基三甲基溴化銨)和SDS法(十二烷基苯磺酸鈉)。主要是通過對真菌的人工分離培養(yǎng)，獲得菌絲，繼而對菌絲進行DNA的提取。對于用菌絲的提取DNA，以上兩種方法廣泛應(yīng)用。不同生物(植物、動物、微生物)的DNA的提取方法有所不同；不同種類或同一種類的不同組織因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，分離方法也有差異。目前尚缺乏一種適用于絕大多數(shù)真菌種類或組織材料的細(xì)胞核DNA提取方法。
[0003]黑痣菌(Phyllachora)為活體營養(yǎng)型子囊菌，目前尚不能進行人工分離培養(yǎng)，無法獲得菌絲進行DNA的提取。只能直接從自然形態(tài)一子囊果中提取DNA。但由于子囊果膠質(zhì)化，富含多糖和蛋白質(zhì)，嚴(yán)重干擾DNA的提取，采用以往常規(guī)DNA提取方法，普遍存在著膠狀物質(zhì)及多糖去處不徹底的缺陷，無法獲得高純度，質(zhì)量優(yōu)的細(xì)胞核DNA。繼而在很大程度上影響了黑痣菌的分子生物學(xué)的后續(xù)研究工作。因此開發(fā)一種能夠利用黑痣菌在自然生長條件下子囊果為材料，進行高純度、高質(zhì)量DNA的提取方法，已成為當(dāng)前黑痣菌分子生物學(xué)研究的迫切需要。目前，對于從黑痣菌的子囊果中提取DNA的方法的研究很少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種黑痣菌子囊果提取基因組DNA的方法。
[0005]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)上述目的:
[0006]本發(fā)明包括以下步驟:
[0007](I)用鋒利的刀片將去10-15個子囊果從寄主植物上取下，盡量不帶寄主組織，置于離心管內(nèi)，加少量的二氧化硅和液氮迅速研磨成粉末狀；
[0008](2)加入800ul的CTAB-free緩沖液并迅速混勻，置于冰上1min; 4°C，9000r/min離心5min，棄上清，步驟(2)重復(fù)兩次；
[0009](3)加入750uI，65 °C預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，充分混勻后置于65 °C水浴中Ih;
[0010](4)將溫浴的材料取出置于室溫下，待冷卻至室溫后加入750μ1的苯酚-氯仿-異戊醇混合液，比例為25:24:1，搖勾3?5min，12000rmp室溫離心1min;
[0011](5)將上清液轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml的離心管中，再加入等體積的氯仿-異戊醇500-550口1混合液，搖勾3?5111；[11，120001'11^)，室溫離心10111；[11;
[0012](6)將上清液轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml的離心管中，加入350μ1的經(jīng)-20°C預(yù)冷的異丙醇，沉降DNA，充分混勻后，于-20 0C冰箱中靜置保存30min;
[0013](7)將冷凍保存的離心管取出后置于室溫中，待溫度至室溫后12000rmp室溫離心1min，可見底部沉降DNA;
[0014](8)棄去上清液，用500μ1的70%的乙醇沖洗1-2次，每次12000rmp室溫離心Imin后棄上清液，干燥后加入滅菌的蒸餾水；
[0015](9)置于-20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0016]本發(fā)明的有益效果在于:
[0017]本發(fā)明是一種黑痣菌子囊果提取基因組DNA的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明直接以黑痣菌子囊果為材料，進行DNA提取的方法。在進行DNA提取前，采用裂解液緩沖液處理2次，利用低溫下DNA溶解度低的原理去除過多的膠質(zhì)和多糖，最后加入提取液裂解細(xì)胞膜，進行DNA的提取，提取過程中加苯酚-氯仿-異戊醇進行抽提去除多余的蛋白。本方法適用于含有膠質(zhì)和多糖、蛋白等含量高的較高的真菌材料，此類雜質(zhì)存在和含量對所抽提到的DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量均無明顯的影響，為黑痣菌的后續(xù)分子研究提供了保證，具有推廣使用的價值。
【具體實施方式】
[0018]下面對本發(fā)明作進一步說明:
[0019]本發(fā)明包括以下步驟:
[0020](I)用鋒利的刀片將去10-15個子囊果從寄主植物上取下，盡量不帶寄主組織，置于離心管內(nèi)，加少量的二氧化硅和液氮迅速研磨成粉末狀；
[0021 ] (2)加入800ul的CTAB-free緩沖液并迅速混勻，置于冰上1min;4°C，9000r/min離心5min，棄上清，步驟(2)重復(fù)兩次；
[0022](3)加入750uI，65 °C預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，充分混勻后置于65 °C水浴中Ih;
[0023](4)將溫浴的材料取出置于室溫下，待冷卻至室溫后加入750μ1的苯酚-氯仿-異戊醇混合液，比例為25:24:1，搖勾3?5min，12000rmp室溫離心1min;
[0024](5)將上清液轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml的離心管中，再加入等體積的氯仿-異戊醇500-550口1混合液，搖勾3?5111；[11，120001'11^)，室溫離心10111；[11;
[0025](6)將上清液轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml的離心管中，加入350μ1的經(jīng)-20°C預(yù)冷的異丙醇，沉降DNA，充分混勻后，于-20 0C冰箱中靜置保存30min;
[0026](7)將冷凍保存的離心管取出后置于室溫中，待溫度至室溫后12000rmp室溫離心1min，可見底部沉降DNA;
[0027](8)棄去上清液，用500μ1的70%的乙醇沖洗1-2次，每次12000rmp室溫離心Imin后棄上清液，干燥后加入滅菌的蒸餾水；
[0028](9)置于-20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0029]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
【主權(quán)項】
1.一種黑痣菌子囊果提取基因組DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)用鋒利的刀片將去10-15個子囊果從寄主植物上取下，盡量不帶寄主組織，置于離心管內(nèi)，加少量的二氧化硅和液氮迅速研磨成粉末狀； (2)加入800ul的CTAB-free緩沖液并迅速混勻，置于冰上10min;4°C，9000r/min離心5min，棄上清，步驟(2)重復(fù)兩次； (3)加入750ul，65°C預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，充分混勻后置于65°C水浴中Ih； (4)將溫浴的材料取出置于室溫下，待冷卻至室溫后加入750μ1的苯酚-氯仿-異戊醇混合液，比例為25:24:1，搖勾3?5min，12000rmp室溫離心1min; (5)將上清液轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml的離心管中，再加入等體積的氯仿-異戊醇500-550μ1混合液，搖勾3?5min，12000rmp，室溫離心1min; (6)將上清液轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml的離心管中，加入350μ1的經(jīng)-20°C預(yù)冷的異丙醇，沉降DNA，充分混勻后，于-20 0C冰箱中靜置保存30min; (7)將冷凍保存的離心管取出后置于室溫中，待溫度至室溫后12000rmp室溫離心1min，可見底部沉降DNA; (8)棄去上清液，用500μ1的70%的乙醇沖洗1-2次，每次12000rmp室溫離心Imin后棄上清液，干燥后加入滅菌的蒸餾水； (9)置于-20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>【專利摘要】本發(fā)明公開了一種黑痣菌子囊果提取基因組DNA的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明直接以黑痣菌子囊果為材料，進行DNA提取的方法。在進行DNA提取前，采用裂解液緩沖液處理2次，利用低溫下DNA溶解度低的原理去除過多的膠質(zhì)和多糖，最后加入提取液裂解細(xì)胞膜，進行DNA的提取，提取過程中加苯酚-氯仿-異戊醇進行抽提去除多余的蛋白。本方法適用于含有膠質(zhì)和多糖、蛋白等含量高的較高的真菌材料，此類雜質(zhì)存在和含量對所抽提到的DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量均無明顯的影響，為黑痣菌的后續(xù)分子研究提供了保證，具有推廣使用的價值。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN105586334
【申請?zhí)枴緾N201610065875
【發(fā)明人】李曉玲, 李成云, 劉林, 楊靜, 鄢進陸, 彭莞云, 楊亞瓊, 劉立娜, 王慧, 王一, 王春梅, 楊雅婷
【申請人】云南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2016年1月29日