遺傳修飾動物細(xì)胞的改進(jìn)方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求2013年9月23日提交的標(biāo)題為"IMPROVED METHODS OF CELL TRANSDUCT ION"的美國臨時(shí)申請No. 61 /881，259的權(quán)益，其整體通過引用并入本文。
[0003] 本申請中引用的每個(gè)申請、專利和論文，W及每個(gè)申請、專利和論文中引用的每個(gè) 文獻(xiàn)或參考(包括每個(gè)授權(quán)專利公訴期間；"申請引用文獻(xiàn)"），未決美國專利申請10/961， 814(下文中Wilson'814)、未決美國專利申請13/475,700(下文中Vera'700)、未決美國專利 申請13/493,768(下文中Vera'768)、未決美國專利申請11/952,848(下文中Wilson'848)、 未決美國專利申請14/313,702(下文中Welch'702)，W及對應(yīng)于和/或要求運(yùn)些申請和專利 中任意的優(yōu)先權(quán)的每一個(gè)PCT和外國申請或?qū)＠?，W及每個(gè)申請引用文獻(xiàn)中引用或參考的 每個(gè)文獻(xiàn)，均明確地通過引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明設(shè)及通過降低細(xì)胞和遺傳修飾劑(genetic modification agent)之間的 距離W提高遺傳修飾的效率和/或減少遺傳修飾劑的使用來遺傳修飾動物細(xì)胞的改進(jìn)方 法。
【背景技術(shù)】
[0005] 遺傳修飾的細(xì)胞通常是指經(jīng)歷了通常被稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程之后的經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。可W 利用多種技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，W允許基因修飾劑進(jìn)入細(xì)胞。運(yùn)樣的遺傳修飾劑包括使用病毒載 體、電穿孔或提高細(xì)胞滲透性的化學(xué)試劑。轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化是將遺傳物質(zhì)插入細(xì)胞的常見方式。
[0006] 在病毒載體的情況下，有多種使用的類型，并且運(yùn)樣的類型可W包括慢病毒、逆轉(zhuǎn) 錄病毒、腺病毒或者甚至納米工程物質(zhì)。在電穿孔的情況下，使細(xì)胞暴露于電壓，其允許基 因修飾劑(如質(zhì)粒)進(jìn)入細(xì)胞。主要的挑戰(zhàn)是提高細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率。效率提高可W包括增加 給定細(xì)胞群中經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的數(shù)目或者減少在遺傳上改變給定群中給定數(shù)目的細(xì)胞所需的 遺傳修飾劑的量。
[0007] 慢病毒提供了與細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的優(yōu)勢和問題的很好的實(shí)例。慢病毒主要是用于向 體外系統(tǒng)中引入基因產(chǎn)物的研究工具。使用高通量形式的RNA干擾技術(shù)，進(jìn)行了大規(guī)模協(xié)作 努力來使用慢病毒阻斷特定基因的表達(dá)。短發(fā)夾RNA(shRNA)的表達(dá)降低了特定基因的表 達(dá)，因此使得研究者能夠檢查模型系統(tǒng)中給定基因的必要性和作用。運(yùn)些研究可W是開發(fā) 旨在阻斷基因產(chǎn)物W治療疾病的新藥的前驅(qū)。
[000引在T細(xì)胞療法領(lǐng)域，新興的應(yīng)用是在體外從遺傳上改變T細(xì)胞W產(chǎn)生嵌合抗原受體 (CAR),其賦予轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞對祀抗原的特異性，通常是對于祀抗原之單克隆抗體的特異性。W 運(yùn)種方式，可產(chǎn)生大量CAR T細(xì)胞W用于T細(xì)胞療法。CAR T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)還可賦予細(xì)胞增強(qiáng)的 活化信號、擴(kuò)增、細(xì)胞因子的產(chǎn)生W及效應(yīng)子功能。運(yùn)種方法有很大的潛力來W意義深遠(yuǎn)的 方式改善患者特異性癌癥療法。在采集患者的T細(xì)胞后，對細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程W表達(dá)特異性 針對患者腫瘤細(xì)胞上之抗原的CAR,然后輸注回患者，CAR T細(xì)胞在患者中識別并殺傷呈遞 祀抗原的癌細(xì)胞。
[0009] 本發(fā)明的目的是改進(jìn)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，其通過增加所述過程完成后被轉(zhuǎn)導(dǎo)的任何給定群 大小的細(xì)胞的量，減少用于所述過程中的基因修飾劑的量，和/或降低所述過程的成本和復(fù) 雜性來實(shí)現(xiàn)，特別地，其設(shè)及轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞。
[0010] T細(xì)胞培養(yǎng)和/或T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中一個(gè)常見步驟是使用抗體染色的磁珠從較大的 混合群中選擇目標(biāo)細(xì)胞亞群。例如，可W從白細(xì)胞群中選擇細(xì)胞亞群（如干T細(xì)胞（stem T cell))。一旦識別抗體的細(xì)胞亞群與珠結(jié)合，將整個(gè)群從裝置中移出并且使其流經(jīng)磁場，由 此通過磁場捕獲珠，從而從主群中分離附著至珠的細(xì)胞亞群。如果可W消除對使用流動系 統(tǒng)分離亞群的需求W有利于在不需要液體流動的靜態(tài)裝置中進(jìn)行所述過程，則將發(fā)生顯著 的工藝簡化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 公開了本發(fā)明的某些實(shí)施方案，其改進(jìn)了分離細(xì)胞亞群和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)動物細(xì)胞的過 程。
[0012] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，公開了用于減少轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞所需之遺傳修飾劑的量的 方法，其通過將動物細(xì)胞和培養(yǎng)基放置在包含由可透氣、不可透液體材料構(gòu)成的細(xì)胞生長 表面的裝置中的過程來實(shí)現(xiàn)，其中所述動物細(xì)胞W超過最大細(xì)胞濃度(細(xì)胞/毫升）的濃度 駐留(reside)在培養(yǎng)基中，可W通過使用靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)方法在培養(yǎng)基高度為0.3cm的常規(guī) 組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)動物細(xì)胞獲得所述最大細(xì)胞濃度，從而減小了任何給定細(xì)胞和任何給定 遺傳修飾劑之間的距離。
[0013] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了用于減少轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞所需的遺傳修飾劑的量的方法， 其通過將動物細(xì)胞和培養(yǎng)基放置在包含由可透氣、不可透液體材料構(gòu)成的細(xì)胞生長表面的 裝置中的過程來實(shí)現(xiàn)，其中所述動物細(xì)胞W超過最大細(xì)胞濃度的濃度駐留在培養(yǎng)基中，可 W通過使用靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)方法在培養(yǎng)基高度為0.3cm的常規(guī)組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)動物細(xì)胞獲 得所述最大細(xì)胞濃度。在運(yùn)種升高的濃度下，W細(xì)胞的初始生存力為參考點(diǎn)，將遺傳修飾劑 添加到裝置中，允許遺傳修飾劑轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞一段時(shí)間，在此期間，細(xì)胞生存力不降低到低于初 始生存力的給定百分比。
[0014] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了用于減少轉(zhuǎn)導(dǎo)動物細(xì)胞之遺傳修飾劑的使 用的方法，其通過將培養(yǎng)基和動物細(xì)胞放置在包含由可透氣材料構(gòu)成的細(xì)胞生長表面的裝 置中來實(shí)現(xiàn)，其中培養(yǎng)基中動物細(xì)胞的濃度超過最大細(xì)胞濃度，可W通過使用靜態(tài)細(xì)胞培 養(yǎng)方法在培養(yǎng)基高度為0.3cm的瓶中培養(yǎng)所述細(xì)胞獲得所述最大細(xì)胞濃度。在運(yùn)種升高的 濃度下，W培養(yǎng)基的初始葡萄糖濃度為參考點(diǎn)，將遺傳修飾劑添加到裝置中并且允許遺傳 修飾劑轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞一段時(shí)間，在此期間，培養(yǎng)基的葡萄糖濃度不降低到低于初始葡萄糖濃度 的特定百分比或最小葡萄糖濃度。
[0015] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的方法，其通過將培養(yǎng)基、動 物細(xì)胞和遺傳修飾劑添加到包含由可透氣、不可透液體材料構(gòu)成的生長表面的裝置中來實(shí) 現(xiàn)，其中細(xì)胞濃度為3百萬至2千萬個(gè)細(xì)胞/毫升培養(yǎng)基，并且其中培養(yǎng)基與可透氣、不可透 液體材料接觸，然后允許經(jīng)過一段時(shí)間，在此期間，遺傳修飾劑起作用W轉(zhuǎn)導(dǎo)至少一部分細(xì) 胞。
[0016] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的方法，其通過提高可透氣 細(xì)胞培養(yǎng)裝置中每毫升培養(yǎng)基中的細(xì)胞濃度來實(shí)現(xiàn)，所述裝置包含第一細(xì)胞濃度的細(xì)胞， 培養(yǎng)基處于第一培養(yǎng)基高度，并且培養(yǎng)基處于第一培養(yǎng)基體積，所述第一細(xì)胞濃度為細(xì)胞 量除W第一培養(yǎng)基體積，所述第一培養(yǎng)基高度由當(dāng)細(xì)胞生長表面處于水平位置時(shí)培養(yǎng)基的 最上面位置與培養(yǎng)基的最下面位置之間的距離定義；從裝置中移出一部分第一培養(yǎng)基體 積，在裝置中留下第二培養(yǎng)基體積，由此在移出一部分第一培養(yǎng)基體積之后，細(xì)胞處于第二 細(xì)胞濃度，所述第二細(xì)胞濃度大于所述第一細(xì)胞濃度，培養(yǎng)基為第二培養(yǎng)基高度，所述第二 培養(yǎng)基高度由當(dāng)細(xì)胞生長表面處于水平位置時(shí)所述培養(yǎng)基的最上面位置與所述培養(yǎng)基的 最下面位置之間的距離定義；W及將遺傳修飾劑添加到裝置中，允許經(jīng)過一段時(shí)間，由此遺 傳修飾劑起作用W轉(zhuǎn)導(dǎo)至少一部分細(xì)胞。可W進(jìn)行后續(xù)步驟W擴(kuò)增轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群的大小，其 通過向裝置中添加一定體積的培養(yǎng)基，并且當(dāng)所述裝置定向成使得至少一部分細(xì)胞駐留在 細(xì)胞生長表面上，并且細(xì)胞生長表面W水平位置定向，且適合細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境氣體與可透 氣、不可透液體材料接觸時(shí)，允許用培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞一段時(shí)間。
[0017] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了從較大群中分離細(xì)胞亞群的方法，其中將 細(xì)胞群、培養(yǎng)基和包被(coat)的磁珠添加到包含可透氣、不可透液體材料的裝置中，允許細(xì) 胞亞群附著至磁珠一段時(shí)間，使裝置內(nèi)的珠暴露于磁場，移出培養(yǎng)基和細(xì)胞群，而磁珠由于 磁場駐留在裝置中，從而從較大的細(xì)胞群中分離細(xì)胞亞群。
[0018] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了從較大群中分離細(xì)胞亞群的方法，其中將 細(xì)胞群、培養(yǎng)基和包被的磁珠添加到包含可透氣、不可透液體材料的裝置中，允許細(xì)胞亞群 附著至磁珠一段時(shí)間，使裝置內(nèi)的珠暴露于磁場，移出培養(yǎng)基和細(xì)胞群，而磁珠由于磁場駐 留在裝置中，從而從較大的細(xì)胞群中分離細(xì)胞亞群。然后使用本文所述的任何方法轉(zhuǎn)導(dǎo)裝 置中的細(xì)胞。
[0019] 附圖簡述
[0020] 圖1示出了包含細(xì)胞和培養(yǎng)基之非可透氣的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的截面。
[0021] 圖1A示出了包含細(xì)胞、培養(yǎng)基和遺傳修飾劑之非可透氣的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的截面。
[0022] 圖2示出了包含細(xì)胞和培養(yǎng)基之可透氣的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的截面。
[0023] 圖2A示出了包含細(xì)胞和培養(yǎng)基之可透氣的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的截面。
[0024] 圖2B示出了包含細(xì)胞、培養(yǎng)基和遺傳修飾劑之可透氣的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的截面。
[0025] 圖2C示出了包含細(xì)胞、培養(yǎng)基和遺傳修飾劑之可透氣的細(xì)胞培養(yǎng)裝置