一種海洋弧菌褐藻膠裂合酶的純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種海洋弧菌褐藻膠裂合酶的純化方法。具體地， 本發(fā)明涉及一種從海洋弧菌QY101發(fā)酵液中純化褐藻膠裂合酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 褐藻膠是由β-D-甘露糖酸酸（β-D-mannuronate acid, M)及其C5差向異構(gòu)體 α-L-古羅糖酸酸（a- L- guluronate acid，G)通過1，4糖苷鍵聚合而成的一種酸性多 糖，主要存在于褐藻的細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)中。褐藻膠一般由三種片段組成：由β-D-甘露糖 醛酸構(gòu)成的均聚物（polyM);由α-L-古羅糖醛酸構(gòu)成的均聚物（ployG);由β-D-甘露糖 醛酸與a-L-古羅糖醛酸組成的MG隨機(jī)交替片段（polyMG)。近年來，褐藻膠寡糖的生物 活性不斷被發(fā)現(xiàn)，如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗心血管疾病、促進(jìn)植物根生長等，具有廣 闊的應(yīng)用前景。褐藻膠裂合酶能以β消除方式降解褐藻膠，在新產(chǎn)生的非還原性末端生成 C4, 5雙鍵，該結(jié)構(gòu)在230-240 nm有強(qiáng)烈的吸收峰。利用褐藻膠裂合酶制備褐藻膠寡糖因反 應(yīng)條件溫和可控、對環(huán)境友好等特點(diǎn)已逐漸引起人們的關(guān)注?，F(xiàn)已從細(xì)菌、無脊椎動物中分 離到數(shù)十種褐藻膠裂合酶，但因為酶產(chǎn)量低、分離純化困難，導(dǎo)致難以大規(guī)模應(yīng)用，大大限 制了褐藻膠寡糖的應(yīng)用與開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種從海洋弧菌QY101發(fā)酵液中純化褐藻膠裂合酶的方法。
[0004] 本發(fā)明的褐藻膠裂合酶純化方法時通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：將海洋弧菌QY101 的發(fā)酵液3000-12000 r/min離心5-30 min，棄去沉淀；上清液用截留分子量為50-100 kDa 的超濾膜進(jìn)行超濾，去除大分子蛋白，然后把濾出液利用截留分子量為1-10 kDa的超濾膜 濃縮2-10倍；超濾液上樣于離子交換層析柱（DEAE Sepharose High Performance),按照 NaCl濃度進(jìn)行梯度洗脫，檢測收集物中的褐藻膠裂合酶活性。
[0005] 本發(fā)明所用的弧菌QY101發(fā)酵液可利用中國發(fā)明專利申請03112325. 2、 201210068851.0提供的方法制備。發(fā)酵液體積為0.1-1000 L。
[0006] 本發(fā)明的純化方法可以得到純度達(dá)到75%的褐藻膠裂合酶，回收率達(dá)到45%以上， 具有工藝簡單、容易控制、純化效果好、回收率高、成本低的優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0007] 圖1 :純化后的褐藻膠裂合酶的SDS-PAGE圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0008] 實(shí)施例1弧菌QY101發(fā)酵液上清的制備 將弧菌QY101發(fā)酵所得的發(fā)酵液3000-12000 r/min離心5-30 min，棄去沉淀，保留上 清液。
[0009] 實(shí)施例2超濾 上清液用截留分子量為50-100 kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，去除大分子蛋白，收集濾出液。 然后把濾出液利用截留分子量為1-10 kDa的超濾膜濃縮2-10倍，收集被超濾膜截留的液 體。濃縮液加入等體積的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6. 5-7. 5)，再次用截留分子量為 1-10 kDa的超濾膜濃縮2-10倍，收集被超濾膜截留的液體。
[0010] 實(shí)施例3離子交換層析 以平衡緩沖液（50 mmol/L 憐酸鹽，pH 6. 5-7. 5)平衡 DEAE Sepharose High Performance柱2-10個柱體積，將上步所得濃縮液上樣至層析柱。用平衡緩沖液沖洗層析 柱，將未結(jié)合的蛋白去除。用洗脫緩沖液（0.4 M NaCl，50 mM的磷酸鹽，pH6. 5-7. 5)洗 脫，收集洗脫液。
[0011] 經(jīng)過離心、超濾、離子交換層析收集的酶液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)果表明純 化后的樣品純度達(dá)到75%，回收率達(dá)到45. 7%。
[0012] 表1褐藻膠裂合酶純化總結(jié)1
1按1 L發(fā)酵液計算。
【主權(quán)項】
1. 一種從海洋弧菌發(fā)酵液中純化褐藻膠裂合酶的方法，其特征在于，該方法包括： (1) 將弧菌QY101發(fā)酵所得的發(fā)酵液離心，棄去沉淀，保留上清液； (2) 上清液用截留分子量為50-100 kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，去除大分子蛋白，收集濾出 液；然后把濾出液利用截留分子量為1-10 kDa的超濾膜濃縮2-10倍，收集被超濾膜截留的 液體；濃縮液加入等體積的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6. 5-7. 5)，再次用截留分子量為 1-10 kDa的超濾膜濃縮2-10倍，收集被超濾膜截留的液體； (3) 以平衡緩沖液（50 mmol/L 憐酸鹽，pH 6. 5-7. 5)平衡 DEAE Sepharose High Performance柱2-10個柱體積，將上步所得濃縮液上樣至層析柱；用平衡緩沖液沖洗層析 柱，將未結(jié)合的蛋白去除；用洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫液。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的離心轉(zhuǎn)速為3000-12000 r/min，離心 溫度為0-30 °C，離心時間為5-30 min。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的平衡緩沖液為50 mmol/L磷酸鹽（pH 6. 5-7. 5)，所述的洗脫緩沖液為含有0. 4 M NaCl的50 mM的磷酸鹽（pH6. 5-7. 5)。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的弧菌發(fā)酵液體積從0. 1升到1000升。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所得到的褐藻膠裂合酶純度達(dá)到75%，回收 率達(dá)到45%以上。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種海洋弧菌褐藻膠裂合酶的純化方法。本發(fā)明將弧菌QY101發(fā)酵液進(jìn)行離心獲得上清液；上清液經(jīng)超濾、離子交換層析，得到純度75%的褐藻膠裂合酶，回收率達(dá)到45%以上。本發(fā)明的純化方法適用于中試和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)褐藻膠裂合酶，有工藝簡單、容易控制、純化效果好、回收率高、成本低的優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】C12N9/88, C12R1/63
【公開號】CN105624135
【申請?zhí)枴緾N201410584557
【發(fā)明人】于文功, 韓峰, 路新枝
【申請人】中國海洋大學(xué)
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2014年10月28日