腸道病毒熒光pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種采用熒光PCR技術(shù)特異性檢測(cè)樣品中腸道病毒核酸存在的試劑 盒，屬于腸道病毒的體外診斷領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸道病毒屬于單鏈正股RNA病毒，病毒體呈球型，衣殼為20面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，無(wú)包膜， 具有感染性。在宿主細(xì)胞漿內(nèi)增殖，迅速引起細(xì)胞病變。主要經(jīng)糞一口途徑傳播，臨床表現(xiàn) 多樣化，引起人類多種疾病，如脊髓灰質(zhì)炎、手足口病、麻痹、無(wú)菌性腦炎、心肌損傷、腹瀉和 皮疹等。
[0003] 人腸道病毒至少由72個(gè)血清型組成，其種類有： ① 人脊髓灰質(zhì)炎病毒1~3型； ② 人柯薩奇病毒A組1~22型和24型(A-23型為埃可病毒9型），B組1~6型； ③ 埃可病毒1~9,11~27,29~34共32個(gè)血清型； ④ 新型腸道病毒68~72型，其中1971年分出的70型，能引起急性出血性結(jié)膜炎備受重 視，72型為甲型肝炎病毒。輪狀病毒、腸道腺病毒。
[0004] 在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中，PCR法由于其快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)逐漸呈現(xiàn)出要替代以細(xì)胞培養(yǎng)和 血清學(xué)檢測(cè)為主的傳統(tǒng)檢測(cè)方法的趨勢(shì)。而對(duì)于PCR方法來(lái)說(shuō)，引物的特異性是其檢測(cè)的特 異性和敏感性的基礎(chǔ)。本發(fā)明針對(duì)腸道病毒特異的靶序列設(shè)計(jì)引物和Taqman探針，利用 real-time RT-PCR的方法，用來(lái)鑒別檢測(cè)樣品中腸道病毒核酸，可以快速獲得特異性檢測(cè) 結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是快速準(zhǔn)確地檢測(cè)樣品中是否存在腸道病毒，提供一 種特異性檢測(cè)腸道病毒的熒光PCR試劑盒。
[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的： 一種特異性檢測(cè)樣品中腸道病毒的試劑盒，組分包括PCR反應(yīng)液、酶混合液、陰性質(zhì)控 品和陽(yáng)性質(zhì)控品。其中PCR反應(yīng)液主要含有相關(guān)的引物和探針、反應(yīng)緩沖液、Mg2+和dNTP等， 酶混合液主要含有逆轉(zhuǎn)錄酶和熱啟動(dòng)Taq酶，陰性質(zhì)控品為無(wú) RNase和DNase水，陽(yáng)性質(zhì)控品 為含有腸道病毒檢測(cè)靶序列的RNA。
[0007] PCR反應(yīng)液中用于核酸擴(kuò)增的引物為P1和P2，P1和P2為針對(duì)腸道病毒基因組群特 異性保守序列設(shè)計(jì)并經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出的特異性引物;PCR反應(yīng)液中用于熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)的寡 核苷酸探針為Probel、2、3,為針對(duì)腸道病毒基因組群特異性保守序列設(shè)計(jì)并經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選 出的特異性探針，其中熒光報(bào)告基團(tuán)Χι為FAM，熒光淬滅基團(tuán)YiSEclipse(見表1)。
[0008] 表1檢測(cè)腸道病毒的引物和探針序列

本發(fā)明的為一個(gè)目的是提供本熒光PCR檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)腸道病毒的應(yīng)用方法，包括： 試劑盒選用的PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括2XPCR緩沖液10 yUlOmmol/L dNTP 1.0 μ 1、25_〇1/1引物各0.5 yUlOymol/L探針0.2 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶和熱啟動(dòng)Taq酶混合液0.8 μL、 樣品RNA 2 μL，加滅菌水至終體系20 μL。
[0009] 試劑盒的PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為逆轉(zhuǎn)錄階段:42°C，lOmin;預(yù)變性階段:94°C，lOsec; 預(yù)擴(kuò)增階段:變性94°C，5sec;退火50°C，20sec;延伸72°C，20sec;共5個(gè)循環(huán)。注意本階 段不采集熒光信號(hào)。檢測(cè)階段:變性94°C，5se C;退火56°C，5〇sec;延伸72°C，15seC;共40 個(gè)循環(huán)。在退火步驟檢測(cè)熒光信號(hào)。
[0010] 質(zhì)量控制:每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)立陰、陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照無(wú) Ct值(或Ct值為0)，陽(yáng)性對(duì)照 Ct值< 30，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果不成立。
[0011] 結(jié)果判讀： 陽(yáng)性：出現(xiàn)"S"型擴(kuò)增曲線，Ct值< 35;可疑：出現(xiàn)"S"型擴(kuò)增曲線，但Ct值> 35;陰性:沒 有出現(xiàn)"S"型擴(kuò)增曲線，或者曲線雖然超過(guò)了閾值，但不呈"S"型;對(duì)可疑結(jié)果，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)， 如果重復(fù)實(shí)驗(yàn)還是出現(xiàn)"S"型擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照沒有污染，可判斷為陽(yáng)性。
[0012] 樣本要求：臨床樣本類型包括奠便標(biāo)本、皰疹液、咽拭子和病毒培養(yǎng)物；臨床樣本 采集后應(yīng)帶冰運(yùn)輸，-20°C保存，不能反復(fù)凍融;從臨床樣本提取RNA，建議采用性能穩(wěn)定可 靠的商品化試劑盒，具體方法參見相應(yīng)商品化試劑盒說(shuō)明書，提取的RNA應(yīng)立即檢測(cè)，否則， 應(yīng)將RNA分裝后-80°C~_20°C保存。
[0013] 本發(fā)明提供的試劑盒具有很好的特異性，可以檢出腸道病毒的核酸，但不能檢出 非腸道病毒病原體的核酸;對(duì)腸道病毒核酸的檢測(cè)下限為10拷貝每反應(yīng)體系；只需要2小時(shí) 即可完成檢測(cè)，可為腸道病毒的疾病監(jiān)測(cè)和臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)腸道病毒核酸靈敏度的擴(kuò)增曲線圖。從左至右的5條 曲線分別為腸道病毒體外轉(zhuǎn)錄RNA梯度稀釋后(2X 106-2X 102 copies/μL)擴(kuò)增結(jié)果。橫坐 標(biāo)為反應(yīng)循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為不同循環(huán)數(shù)熒光檢測(cè)信號(hào)的DRn值。
[0015] 圖2為單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系對(duì)腸道病毒核酸檢測(cè)特異性擴(kuò)增曲線圖。腸道病 毒出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，而其他病原微生物質(zhì)控毒株均未出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線。橫坐標(biāo)為反應(yīng)循 環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為不同循環(huán)數(shù)熒光檢測(cè)信號(hào)的DRn值。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。需要指出的是，這里列出 的實(shí)施例僅僅為示例性說(shuō)明的目的，而不應(yīng)將其解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的任何限制。其中使 用的試劑盒、緩沖液等試劑僅僅為該具體實(shí)施例中具體選擇的試劑，應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可根據(jù)需要選擇其他公司的相應(yīng)試劑以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0017] 弓丨物和TaqMan探針的設(shè)計(jì)與合成 利用Blast工具對(duì)Genbank和國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中所有的腸道病毒基因組序列進(jìn)行分析，分別 選擇其穩(wěn)定的保守區(qū)域作為檢測(cè)靶序列，腸道病毒檢測(cè)靶序列為5'UTR;并針對(duì)這檢測(cè)靶序 列設(shè)計(jì)和合成引物和探針(見表1)。引物和探針均由日本TaKaRa大連寶生物公司合成，其中 腸道病毒的檢測(cè)探針5 '端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3 '端標(biāo)記Eel ipse熒光淬滅基團(tuán)。
[0018] 檢測(cè)菌種的準(zhǔn)備 本實(shí)施例中所使用的腸道病毒以及其他陰性對(duì)照毒株（腺病毒3型、7型，流感病毒 AH1N1、AH3N2、AH7N9，麻疹病毒，風(fēng)疹病毒，副流感病毒3型，鼻病毒)均購(gòu)買于中國(guó)藥品生物 制品檢定所。
[0019] 菌株RNA的抽提 選用德國(guó)QIAGEN公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑QIAamp DSP Virus Spin Kit (國(guó) 械備20140008 QIAGEN GmbH)提取毒株RNA。具體步驟參考試劑盒操作說(shuō)明書。
[0020] 引物和探針的篩選 采用設(shè)計(jì)的引物和探針?lè)謩e檢測(cè)提取的腸道病毒和陰性對(duì)照毒株的基因組RNA，經(jīng)反 復(fù)實(shí)驗(yàn)，篩選出靈敏度、特異性和重復(fù)性最佳的引物探針組合(見序列表，腸道病毒正向引 物P1、反向引物P2和探針Probe 1、2、3 )。
[0021]標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與制備 分別利用P1、P2引物，RT-PCR擴(kuò)增腸道病毒特異性基因片段，并克隆至含有T7啟動(dòng)子序 列的質(zhì)粒(如pGEM-T easy vector)，使用大連寶生物公司的RNA Polymerase，合成RNA，加 入無(wú) RNA酶的胰DNA酶I以終止體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，通過(guò)用酚:氯仿抽提純化RNA。利用紫外可見分 光光度計(jì)分別測(cè)定在波長(zhǎng)260nm處、280nm處的吸光率，然后計(jì)算RNA濃度與純度，然后10倍 梯度稀釋至200拷貝每微升。
[0022]反應(yīng)條件優(yōu)化 對(duì)引物、探針、酶等要素逐一優(yōu)化，確定的反應(yīng)體系為:2 X PCR緩沖液10 μ 1、1 Ommo 1 /L dNTP 1.0 μ1、25μπιο1/1引物各0.5 yUlOymol/L探針0.2 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶和熱啟動(dòng)Taq酶混 合液0.8 μL、模板2ul，加滅菌水至終體系20 μL。
[0023]根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)短、引物和探針的退火溫度以及酶的特性，主要對(duì)反應(yīng)的退火溫 度和延伸時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定循環(huán)參數(shù)為:逆轉(zhuǎn)錄階段:42°C，10min;預(yù)變性階段:94 °(：，1〇86(3 ;預(yù)擴(kuò)增階段:變性94°(：，586(3;退火50°(：，2〇86(3 ;延伸72°(：，2〇86(3;共5個(gè)循環(huán)。 注意本階段不采集熒光信號(hào)。檢測(cè)階段:變性94°C，5se C;退火56°C，5〇sec;延伸72°C， 15seC;共40個(gè)循環(huán)。在退火步驟檢測(cè)熒光信號(hào)。
[0024]在擴(kuò)增結(jié)束后按同一條件分析數(shù)據(jù)，確定各樣品的Ct值。
[0025] 檢測(cè)限的評(píng)價(jià) 以上述5中的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品評(píng)價(jià)本發(fā)明提供的試劑盒的檢測(cè)限，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品濃度為:2X lC^copies/yl、2 XlC^copies/yl、2 X104copies/yl、2 X lC^copies/yl、2 X 102copies/yl，本 發(fā)明提供的試劑盒對(duì)腸道病毒核酸的檢測(cè)下限為10拷貝每反應(yīng)體系。
[0026] 檢測(cè)特異性的評(píng)價(jià) 以上述2中的毒株RNA為模板評(píng)價(jià)了本試劑盒的特異性。對(duì)腸道病毒RNA進(jìn)行檢測(cè)時(shí)均 可見明確的擴(kuò)增曲線，對(duì)上述9種其他腸道常見病原微生物RNA檢測(cè)時(shí)，未產(chǎn)生陽(yáng)性擴(kuò)增曲 線，說(shuō)明我們使用的探針和引物與我們選定的其他毒株之間不存在交叉反應(yīng)。
[0027]盡管上文中以優(yōu)選的方式，通過(guò)具體實(shí)施例示例性說(shuō)明了本發(fā)明的某些實(shí)施方 式，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明并不限于上面所公開的實(shí)施方式，而是可以根據(jù)本 發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的知識(shí)對(duì)其進(jìn)行修改，所作修改不會(huì)超出本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。例如， 本發(fā)明所使用的熒光實(shí)時(shí)PCR也可以根據(jù)需要采用說(shuō)明書中所列出的實(shí)施例中指出的熒光 報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)以外的標(biāo)記物質(zhì)，如 物;或使用Taqman技術(shù)之外的其他標(biāo)記體系，例如MGB探針、分子信標(biāo)MB探針、蝎形探針、熒 光雙雜交探針等熒光探針標(biāo)記技術(shù);或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不飽和染料與LC Green等飽和染料，只要其使用了本發(fā)明所述的特異性引物序列，即可定性或定量檢測(cè)目的 基因的存在，進(jìn)而特異性地檢測(cè)腸道病毒的存在。所以，這些本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的改變 和慣用手段的替換也落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)由所附的權(quán)利要求書 所限定。
[0028
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于特異性檢測(cè)樣品中腸道病毒的試劑盒，其中包括PCR反應(yīng)液、酶混合液、陰 性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品，PCR反應(yīng)液中用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的引物序列如下： PI：5'-CCCTGAATGCGGCTAATC-3', P2:5'-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3'， PCR反應(yīng)液中用于熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)的寡核苷酸探針的序列如下： Probe 1:5' -Xi-CCGACTACTTTGGGWGTCCGTGT-Yi-3'， Probe2:5' -Xi-AACTGCGGAGCACACGCCCAC-Yi-3'， Probe3:5' -Xi-TAACTGCGGAGCRCGCACCCTC-Yi-3'， Probe熒光報(bào)告基團(tuán)X^FAM，焚光淬滅基團(tuán)Y^Eclipse。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括2 XPCR緩沖液 10 yl、10mmol/L dNTP 1.0 yl、25ymol/L引物各0.5 yl、10ymol/L 探針0.2 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶 和熱啟動(dòng)Taq酶混合液0.8μ1、樣品RNA 2 μL，加滅菌水至終體系20 μL。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種采用熒光PCR技術(shù)特異性檢測(cè)樣品中腸道病毒核酸存在的試劑盒。利用本發(fā)明的試劑盒，可快速檢測(cè)樣品中是否存在腸道病毒核酸，該試劑盒能夠靈敏地檢測(cè)并鑒別樣品中存在的腸道病毒，其檢測(cè)下限為10拷貝每反應(yīng)體系，在疾病監(jiān)測(cè)、臨床診斷等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】C12Q1/70, C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105624331
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610019626
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請(qǐng)人】江蘇和創(chuàng)生物科技有限公司
【公開日】2016年6月1日
【申請(qǐng)日】2016年1月13日