3-硝基-4-氯-苯磺酰胺類谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)硫酶的顯色底物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及通過跟蹤吸收變化測定谷脫甘膚-S-轉(zhuǎn)硫酶即 GST活性的顯色底物;此類底物在GST作用下與谷脫甘膚G細(xì)反應(yīng)生成對應(yīng)苯環(huán)上4-位氯原 子被GSH中硫原子取代的苯硫酸，便于通過測定產(chǎn)物吸收確定酶活性和篩選GSWW制劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 谷脫甘膚硫轉(zhuǎn)硫酶(GST)是廣泛分布于各種生物體內(nèi)的一組多功能同工酶，其主 要功能是催化某些內(nèi)源性或外來有害物質(zhì)的親電子基團(tuán)與還原型谷脫甘膚的琉基偶聯(lián)生 成加合物，降低其化學(xué)反應(yīng)活性，并促進(jìn)偶聯(lián)的加合物被排出細(xì)胞，避免對細(xì)胞的毒性。GST 的運(yùn)些活性使得其抑制劑成為抑制腫瘤生長的藥物，用酶標(biāo)板高通量篩選65巧巧制劑就成 為重要的技術(shù)。常用的酶標(biāo)儀能通過跟蹤吸收高通量測定GST活性，運(yùn)就需要顯色底物用于 高通量篩選GST的抑制劑。目前測定GST活性常用還原性谷脫甘膚即G甜與1-氯-2,4-二硝基 苯即CDNB反應(yīng)，生成苯環(huán)上氯原子被取代的苯硫酸產(chǎn)物;此產(chǎn)物相對于兩種底物的吸收在 340nm顯著增強(qiáng)，便于測定GST活性和表征GST的抑制劑。但CDNB在水中溶解性太差而依賴于 有機(jī)溶劑作為溶劑。常用作為藥物篩選祀的GST同工酶對有機(jī)溶劑很敏感。因此，需要水溶 性更強(qiáng)的GST顯色底物測定GST活性，W便于高通量篩選GSWW制劑。
[0003] 設(shè)計(jì)GST顯色底物的最簡易思路是設(shè)計(jì)苯環(huán)上帶有易于在GST催化下被G細(xì)取代的 離去基團(tuán)的苯環(huán)衍生物。作為GST的顯色底物，其苯環(huán)上的離去基團(tuán)需要有鄰對位的基團(tuán)促 進(jìn)其離去W提高GST活性;其離去基團(tuán)應(yīng)吸電子但共而效應(yīng)弱，使得被G甜取代后共輛體系 增大而在長波長處出現(xiàn)新的吸收峰或吸收顯著增強(qiáng)。CDNB就在鄰對位分別用了兩個(gè)硝基吸 電子促進(jìn)氯原子的離去和增加產(chǎn)物的共輛體系，使產(chǎn)物吸收峰紅移且酶催化活性較高;在 遠(yuǎn)離運(yùn)類離去基團(tuán)的位置引入不共輛但能增溶的基團(tuán)，就能得到水溶性更好的顯色底物。
[0004] 為便于合成，本發(fā)明設(shè)計(jì)在氯苯對位有便于引入增溶基團(tuán)的苯橫酷胺衍生物，并 在氯原子鄰位用硝基促進(jìn)氯原子離去、增加酶活性和增大產(chǎn)物的共輛體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 1.3-硝基-4-氯-苯橫酷胺類谷脫甘膚-S-轉(zhuǎn)硫酶的顯色底物，其結(jié)構(gòu)特征如下：
[0006]
[0007] 2.據(jù)權(quán)利要求1所述3-硝基-4-氯-苯橫酷胺類谷脫甘膚-S-轉(zhuǎn)硫酶的顯色底物，其 應(yīng)用特征是在谷脫甘膚-S-轉(zhuǎn)硫酶即GST催化作用下，該顯色底物與還原性谷脫甘膚即GSH 反應(yīng)生成4-位氯原子被G細(xì)琉基取代的苯硫酸；相對于所述顯色底物，此苯硫酸產(chǎn)物在 285皿前后10皿范圍內(nèi)的吸收有顯著增加;選擇在285皿前后IOnm波長范圍內(nèi)的某個(gè)波長作 為測定波長，測定此波長下吸收變化的初速度表示GST的活性，或者據(jù)產(chǎn)物的差消光系數(shù)進(jìn) 一步換算成產(chǎn)物生成初速度表示GST活性。
[0008] 3.據(jù)權(quán)利要求1所述3-硝基-4-氯-苯橫酷胺類谷脫甘膚-S-轉(zhuǎn)硫酶的顯色底物，其 合成過程特征為用所需甘氨酸、乙醇胺、氨基乙橫酸、N，N-二甲基乙二胺之一，與3-硝基-4-氯苯橫酷氯在不高于30攝氏度下反應(yīng);反應(yīng)溶劑、反應(yīng)物投料比及操作特征如下：
[0009] (1)甘氨酸和氨基乙橫酸用四氨巧喃或1,4-二氧六環(huán)與水的混合溶劑溶解，添加 碳酸鋼/鐘或碳酸氨鋼/鐘中和所生成的酸，且氨基化合物摩爾量比3-硝基-4-氯苯橫酷氯 過量5倍W上；
[0010] (2)乙醇胺和N，N-二甲基乙二胺直接作為溶劑，或用二氯甲燒、氯仿將氨基化合物 稀釋后與3-硝基-4-氯苯橫酷氯反應(yīng)，且氨基化合物摩爾量比3-硝基-4-氯苯橫酷氯過量2 倍W上；
[0011] (3)將氨基化合物的混合物或溶液轉(zhuǎn)移到密閉的容器中；3-硝基-4-氯苯橫酷氯用 四氨巧喃、1,4-二氧六環(huán)或其他與氨基化合物溶液相容的溶劑溶解，用恒壓漏斗滴加到含 氨基化合物的密閉容器中，攬拌反應(yīng)2小時(shí)W上，得到產(chǎn)物混合物；
[0012] (4)用乙醇胺或N，N-二甲基乙二胺所得產(chǎn)物混合物，濾去沉淀，過硅膠柱層析純 化；
[0013] (5)用甘氨酸所得產(chǎn)物混合物濾去沉淀，減壓去有機(jī)溶劑進(jìn)行濃縮，加濃鹽酸到抑 <2.0收集固體;水相再用二氯甲燒或氯仿萃取，萃取液濃縮后與酸化后收集的固體合并， 用二氯甲燒或氯仿溶解，過硅膠柱純化；
[0014] (6)用氨基乙橫酸所得產(chǎn)物混合物濃縮后濾去沉淀，再加濃鹽酸到抑<2.0收集固 體為目標(biāo)產(chǎn)物;用異丙醇、丙酬或乙臘和水的混合溶劑重結(jié)晶收集所得固體為目標(biāo)產(chǎn)物。
[0015] 應(yīng)用實(shí)施例1:3-硝基-4-氯本橫酷乙醇胺的合成
[0016] (1)取4-氯-3-硝基苯甲酯氯1. Og溶解在5mL二氯甲燒中作為混合液A;
[0017] (2)取乙醇胺0.7g溶解在25mL二氯甲燒中作混合液B;
[0018] (3)將混合液A加入到恒壓漏斗中，將混合液B轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中，置于冰浴下；
[0019] (4)圓底燒瓶冰浴下，W2到3秒每滴的速度滴加混合液A，同時(shí)磁力攬拌；
[0020] (5)混合液A滴加完全后，撤去冰浴，使其自行升溫到室溫;持續(xù)攬拌持續(xù)反應(yīng)16h;
[0021] (6)反應(yīng)16h后，圓底燒瓶中有固體析出；
[0022] (7)反應(yīng)混合物抽濾，將濾液收集在IOOmL圓底燒瓶中；
[0023] (8)混合液用ISmL 5%的鹽酸水洗，混合液在分液漏斗中分層，取上層有機(jī)相；
[0024] (9)上步混合液用ISmL 5%的碳酸氨鋼溶液水洗有機(jī)層；
[0025] (10)混合液用飽和的氯化鋼溶液洗涂成中性；
[0026] (11)混合液過濾后，加壓蒸干，得到黃色固體;溶解于2.Oml四氨巧喃中；
[0027] (12)過硅膠柱層析，二氯甲燒洗脫;收集不同于原料成分為所需顯色底物(CNBS)。
[0028] 應(yīng)用實(shí)施例2 :GST催化3-硝基-4-氯本橫酷乙醇胺與GSH反應(yīng)
[0029] (1)血吸蟲GST的重組表達(dá)
[0030] 完全參照文獻(xiàn)進(jìn)行(楊憲峰，張靈，楊曉蘭，龍高波，張奕，廖飛。融合標(biāo)簽谷脫甘膚 S-轉(zhuǎn)硫酶高親和配體的設(shè)計(jì)與篩選。重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2012; 37(9): 791-795)。
[0031] (2)GST催化應(yīng)用實(shí)施例中合成的顯色產(chǎn)物CNBS與GSH反應(yīng)的吸收光譜
[0032] 用重組表達(dá)GST,在20mM pH 6.5的憐酸鹽緩沖液中，催化合成產(chǎn)物和G細(xì)加合，用 化iadzu UV2550掃描，記錄吸收光譜隨著反應(yīng)進(jìn)行產(chǎn)生的變化，見附圖1。
[0033] (3)連續(xù)跟蹤GST催化合成顯色底物CNBS和GSH反應(yīng)過程檢測酶活性
[0034] 用重組表達(dá)GST，在20mMpH6.5的憐酸鹽緩沖液中，，用化imadzuUV2550連續(xù)測 定285nm吸收變化，結(jié)果如附圖2;用285nm的吸收變化初速度表示酶活性。 【附圖說明】 圖1是合成的顯色產(chǎn)物CNBS與G甜反應(yīng)的吸收光譜圖 圖2是GST催化合成顯色底物CNBS和G甜反應(yīng)過程酶活性連續(xù)跟蹤檢測圖。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.3-硝基-4-氯-苯磺酰胺類谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)硫酶的顯色底物，其結(jié)構(gòu)特征如下：R: -COOH-CH2OH-CH2-SO3H-CH2-N- (CH3) 2。2. 據(jù)權(quán)利要求1所述3-硝基-4-氯-苯磺酰胺類谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)硫酶的顯色底物，其應(yīng)用 特征是在谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)硫酶即GST催化作用下，該顯色底物與還原性谷胱甘肽即GSH反應(yīng) 生成4-位氯原子被GSH巰基取代的苯硫醚;相對于所述顯色底物，此苯硫醚產(chǎn)物在285nm前 后10nm范圍內(nèi)的吸收有顯著增加;選擇在285nm前后10nm波長范圍內(nèi)的某個(gè)波長作為測定 波長，測定此波長下吸收變化的初速度表示GST的活性，或者據(jù)產(chǎn)物的差消光系數(shù)進(jìn)一步換 算成產(chǎn)物生成初速度表示GST活性。3. 據(jù)權(quán)利要求1所述3-硝基-4-氯-苯磺酰胺類谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)硫酶的顯色底物，其合成 過程特征為用所需甘氨酸、乙醇胺、氨基乙磺酸、N，N_二甲基乙二胺之一，與3-硝基-4-氯苯 磺酰氯在不高于30攝氏度下反應(yīng);反應(yīng)溶劑、反應(yīng)物投料比及操作特征如下： (1) 甘氨酸和氨基乙磺酸用四氫呋喃或1，4_二氧六環(huán)與水的混合溶劑溶解，添加碳酸 鈉/鉀或碳酸氫鈉/鉀中和所生成的酸，且氨基化合物摩爾量比3-硝基-4-氯苯磺酰氯過量5 倍以上； (2) 乙醇胺和N，N-二甲基乙二胺直接作為溶劑，或用二氯甲烷、氯仿將氨基化合物稀釋 后與3-硝基-4-氯苯磺酰氯反應(yīng)，且氨基化合物摩爾量比3-硝基-4-氯苯磺酰氯過量2倍以 上； (3) 將氨基化合物的混合物或溶液轉(zhuǎn)移到密閉的容器中；3-硝基-4-氯苯磺酰氯用四氫 呋喃、1，4-二氧六環(huán)或其他與氨基化合物溶液相容的溶劑溶解，用恒壓漏斗滴加到含氨基 化合物的密閉容器中，攪拌反應(yīng)2小時(shí)以上，得到產(chǎn)物混合物； (4) 用乙醇胺或N，N-二甲基乙二胺所得產(chǎn)物混合物，濾去沉淀，過硅膠柱層析純化； (5) 用甘氨酸所得產(chǎn)物混合物濾去沉淀，減壓去有機(jī)溶劑進(jìn)行濃縮，加濃鹽酸到pH< 2.0收集固體;水相再用二氯甲烷或氯仿萃取，萃取液濃縮后與酸化后收集的固體合并，用 二氯甲烷或氯仿溶解，過硅膠柱純化； (6) 用氨基乙磺酸所得產(chǎn)物混合物濃縮后濾去沉淀，再加濃鹽酸到pH<2.0收集固體為 目標(biāo)產(chǎn)物;用異丙醇、丙酮或乙腈和水的混合溶劑重結(jié)晶收集所得固體為目標(biāo)產(chǎn)物。
【專利摘要】3-硝基-4-氯-苯磺酰胺類谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)硫酶的顯色底物，其結(jié)構(gòu)特征是用3-硝基-4-氯-苯磺酰氯與乙醇胺、氨乙基磺酸、甘氨酸、N，N-二甲基乙二胺之一反應(yīng)生成的苯磺酰胺；在谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)硫酶即GST催化下，該顯色底物與還原型谷胱甘肽即GSH反應(yīng)生成苯硫醚；所得苯硫醚產(chǎn)物相對于顯色底物在285nm附近的吸收顯著增強(qiáng)；測定GST催化該顯色底物與GSH反應(yīng)過程中在285nm附近的吸收變化初速度，可表示GST活性并用于篩選抑制劑。
【IPC分類】C07C311/18, C07C311/19, G01N21/77, C07C311/16, C07C311/17, C07C303/38
【公開號】CN105669502
【申請?zhí)枴緾N201610093546
【發(fā)明人】廖飛, 劉芳, 楊曉蘭, 胡小蕾, 種慧敏
【申請人】重慶醫(yī)科大學(xué)
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年2月18日