一種利用海螺消化腺酶解紫菜獲得體細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于海產(chǎn)品養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種利用海螺消化腺酶解紫菜獲得體 細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 紫菜是海中互生藻類的統(tǒng)稱，其富含蛋白質(zhì)、艦、憐、巧等多種營(yíng)養(yǎng)成分，還具有軟 堅(jiān)化疲、清熱利水、補(bǔ)腎養(yǎng)屯、等藥用功效，是一種集營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功效于一體的天然的健 康食品，也是目前世界上經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的一種栽培海藻，其產(chǎn)值約占全世界人工栽培海藻 總產(chǎn)值的Ξ分之二。
[0003] 每年從自然種群或栽培群體中選出具有優(yōu)良性狀的紫菜成熟藻體作為種藻，再由 種藻取得果抱子或者采用腐爛法、分塊法或酶解法獲得體細(xì)胞后培養(yǎng)成絲狀體，接種貝殼， 大量培養(yǎng)貝殼絲狀體，是目前紫菜育種中最常用且傳統(tǒng)的方法。而酶解法反應(yīng)條件溫和，能 使體細(xì)胞受到的傷害降到最低程度，是目前最有效的一種獲得細(xì)胞的方法。但目前酶解法 需使用裂解酶、纖維素酶等多種酶共同進(jìn)行處理，且所使用的酶多為進(jìn)口商品，價(jià)格昂貴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用海螺消化腺酶解紫菜獲得體細(xì)胞的方法，其不僅 可簡(jiǎn)化操作，縮短酶解時(shí)間，且酶解效果好，酶解過程中無(wú)需加入纖維素酶等其他酶，可有 效降低成本，具有較好經(jīng)濟(jì)效益，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)推廣。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種利用海螺消化腺酶解紫菜獲得體細(xì)胞的方法，其包括W下步驟： 1) 取新鮮海螺的消化腺，用水漂洗2次后，放入勻漿機(jī)中進(jìn)行勻漿，然后將其溶解在pH 值為7.0、濃度為0.1mol/L的憐酸鹽緩沖液中； 2) 在步驟1)所得溶液中加入硫酸錠，使溶液中硫酸錠的飽和度為30%進(jìn)行鹽析，于4°C 透析過夜，然后于lOOOr/min離屯、15min后，取上清液加硫酸錠至飽和度為90%進(jìn)行二次鹽 析，經(jīng)透析、離屯、后取沉淀； 3) 將步驟2)所得沉淀加水配制成濃度為0.2-0.化gAiL的酶液； 4) 將紫菜組織剪碎，按l-2mL/g的量加入酶液，于10°C、8化/min搖床上酶解處理2-化， 然后用100皿篩絹過濾去除未酶解的組織碎片，2500 r/min離屯、5min，收集游離的體細(xì)胞。
[0006] 所述海螺為?；ü谛≡侣莼虺r花冠小月螺。
[0007] 海螺消化腺的提取方法為:將新鮮海螺在海水中清洗5-8次后，放在清水中饑餓2 天，再用海水清洗3-5次后，將海螺敲碎，取出消化腺。
[000引本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于:現(xiàn)有技術(shù)中往往將取出的消化器官經(jīng)鹽析后干燥制成酶 粉，再用其與纖維素酶、離析酶共同對(duì)藻類組織進(jìn)行酶解，其酶解時(shí)間一般需6-化，不僅操 作周期長(zhǎng)，烘干過程中若控制不當(dāng)易使酶失活，且多種酶的使用還增加了生產(chǎn)成本。本發(fā)明 直接將鹽析后的沉淀物作為酶液，可簡(jiǎn)化操作，縮短2/3W上的酶解時(shí)間，且其酶解率可達(dá) 95% W上，酶解效果好，酶解過程中無(wú)需加入纖維素酶等其他酶，可降低60%W上成本，而所 得紫菜體細(xì)胞的活力可提高20%W上，且抗病及抗逆性強(qiáng)，具有較好經(jīng)濟(jì)效益，適合產(chǎn)業(yè)化 生產(chǎn)推廣。
【具體實(shí)施方式】
[0009] -種利用海螺消化腺酶解紫菜獲得體細(xì)胞的方法，其包括W下步驟： 1) 取新鮮海螺的消化腺，用水漂洗2次后，放入勻漿機(jī)中進(jìn)行勻漿，然后將其溶解在pH 值為7.0、濃度為0.1mol/L的憐酸鹽緩沖液中； 2) 在步驟1)所得溶液中加入硫酸錠，使溶液中硫酸錠的飽和度為30%進(jìn)行鹽析，于4°C 透析過夜，然后于lOOOr/min離屯、15min后，取上清液加硫酸錠至飽和度為90%進(jìn)行二次鹽 析，經(jīng)透析、離屯、后取沉淀； 3) 將步驟2)所得沉淀加水配制成濃度為0.2-0.化gAiL的酶液； 4) 將紫菜組織剪碎，按l-2mL/g的量加入酶液，于10°C、8化/min搖床上酶解處理2-化， 然后用100皿篩絹過濾去除未酶解的組織碎片，2500 r/min離屯、5min，收集游離的體細(xì)胞。
[0010] 所述海螺為粒花冠小月螺或朝鮮花冠小月螺。
[0011] 海螺消化腺的提取方法為:將新鮮海螺在海水中清洗5-8次后，放在清水中饑餓2 天，再用海水清洗3-5次后，將海螺敲碎，取出消化腺。
[0012] 為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明所述的 技術(shù)方案做進(jìn)一步的說(shuō)明，但是本發(fā)明不僅限于此。
[OOU]實(shí)施例1 1) 將新鮮?；ü谛≡侣菰诤Ｋ星逑?次后，放在清水中饑餓2天，再用海水清洗3次 后，將海螺敲碎，取出消化腺，用水漂洗2次； 2) 將漂洗后的消化腺放入勻漿機(jī)中進(jìn)行勻漿，然后將其溶解在pH值為7.0、濃度為 O.lmol/L的憐酸鹽緩沖液中； 3) 在步驟2)所得溶液中加入硫酸錠，使溶液中硫酸錠的飽和度為30%進(jìn)行鹽析，于4°C 透析過夜，然后于lOOOr/min離屯、15min后，取上清液加硫酸錠至飽和度為90%進(jìn)行二次鹽 析，經(jīng)透析、離屯、后取沉淀； 4) 將步驟3)所得沉淀加水配制成濃度為0.化gAiL的酶液； 5) 將紫菜組織剪碎，按ImL/g的量加入酶液，于10°C、8化/min搖床上酶解處理化，然后 用100WI1篩絹過濾去除未酶解的組織碎片，2500 r/min離屯、5min，收集游離的體細(xì)胞，其酶 解率為95.2%。
[0014] 實(shí)施例2 1) 將新鮮粒花冠小月螺在海水中清洗6次后，放在清水中饑餓2天，再用海水清洗4次 后，將海螺敲碎，取出消化腺，用水漂洗2次； 2) 將漂洗后的消化腺放入勻漿機(jī)中進(jìn)行勻漿，然后將其溶解在pH值為7.0、濃度為 O.lmol/L的憐酸鹽緩沖液中； 3) 在步驟2)所得溶液中加入硫酸錠，使溶液中硫酸錠的飽和度為30%進(jìn)行鹽析，于4°C 透析過夜，然后于lOOOr/min離屯、15min后，取上清液加硫酸錠至飽和度為90%進(jìn)行二次鹽 析，經(jīng)透析、離屯、后取沉淀； 4) 將步驟3)所得沉淀加水配制成濃度為ο.化gAiL的酶液； 5) 將紫菜組織剪碎，按2mL/g的量加入酶液，于12°C、8化/min搖床上酶解處理2.化，然 后用100皿篩絹過濾去除未酶解的組織碎片，2500 r/min離屯、5min，收集游離的體細(xì)胞，其 酶解率為95.6%。
[001引實(shí)施例3 1) 將新鮮朝鮮花冠小月螺在海水中清洗8次后，放在清水中饑餓2天，再用海水清洗5次 后，將海螺敲碎，取出消化腺，用水漂洗2次； 2) 將漂洗后的消化腺放入勻漿機(jī)中進(jìn)行勻漿，然后將其溶解在pH值為7.0、濃度為 O.lmol/L的憐酸鹽緩沖液中； 3) 在步驟2)所得溶液中加入硫酸錠，使溶液中硫酸錠的飽和度為30%進(jìn)行鹽析，于4°C 透析過夜，然后于lOOOr/min離屯、15min后，取上清液加硫酸錠至飽和度為90%進(jìn)行二次鹽 析，經(jīng)透析、離屯、后取沉淀； 4) 將步驟3)所得沉淀加水配制成濃度為0.化gAiL的酶液； 5) 將紫菜組織剪碎，按2mL/g的量加入酶液，于10°C、8化/min搖床上酶解處理化，然后 用100WI1篩絹過濾去除未酶解的組織碎片，2500 r/min離屯、5min，收集游離的體細(xì)胞，其酶 解率為95.7%。
[0016]采用化kada法對(duì)實(shí)施例1步驟3)所得沉淀與等量現(xiàn)有技術(shù)中制備的酶粉（胡遠(yuǎn)皆 等，"鮑魚酶的制備和應(yīng)用試驗(yàn)"）進(jìn)行酶活力測(cè)定，其結(jié)果見表1。
[0017]表1酶活力現(xiàn)憶結(jié)果
由表1可見，按本發(fā)明處理所得沉淀中酶活力明顯高于現(xiàn)有酶粉。
[0018] W上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用海螺消化腺酶解紫菜獲得體細(xì)胞的方法，其特征在于:包括以下步驟： 1) 取新鮮海螺的消化腺，用水漂洗2次后，放入勻漿機(jī)中進(jìn)行勻漿，然后將其溶解在pH 值為7.0、濃度為0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液中； 2) 在步驟1)所得溶液中加入硫酸銨，使溶液中硫酸銨的飽和度為30%進(jìn)行鹽析，于4°C 透析過夜，然后于l〇〇〇r/min離心15min后，取上清液加硫酸銨至飽和度為90%進(jìn)行二次鹽 析，經(jīng)透析、離心后取沉淀； 3) 將步驟2)所得沉淀加水配制成濃度為0.2-0.3yg/mL的酶液； 4) 將紫菜組織剪碎，按l_2mL/g的量加入酶液，于10°C、80r/min搖床上酶解處理2-3h， 然后用100μπι篩絹過濾去除未酶解的組織碎片，2500 r /min離心5min，收集游離的體細(xì)胞。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用海螺消化腺酶解紫菜獲得體細(xì)胞的方法，其特征在于:所述 海螺為粒花冠小月螺或朝鮮花冠小月螺。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用海螺消化腺酶解紫菜獲得體細(xì)胞的方法，其特征在于:海螺 消化腺的提取方法為:將新鮮海螺在海水中清洗5-8次后，放在清水中饑餓2天，再用海水清 洗3-5次后，將海螺敲碎，取出消化腺。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用海螺消化腺酶解紫菜獲得體細(xì)胞的方法，其是將新鮮海螺的消化腺經(jīng)勻漿、鹽析后直接作為酶液，對(duì)紫菜組織進(jìn)行酶解獲得所需體細(xì)胞。按本發(fā)明方法進(jìn)行處理，可簡(jiǎn)化操作，縮短酶解時(shí)間，且酶解效果好，酶解過程中無(wú)需加入纖維素酶等其他酶，可有效降低成本，具有較好經(jīng)濟(jì)效益，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)推廣。
【IPC分類】A01G33/02, C12N5/04
【公開號(hào)】CN105670984
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610122944
【發(fā)明人】高麗華, 高文, 劉燕飛
【申請(qǐng)人】福建省平潭縣水產(chǎn)良種實(shí)驗(yàn)有限公司
【公開日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2016年3月4日