與豬繁殖性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其檢測(cè)方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及動(dòng)物分子育種領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種基于KISS-1基因的與豬繁殖性狀相 關(guān)的分子標(biāo)記及其檢測(cè)方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 分子標(biāo)記輔助選擇是基因工程在現(xiàn)代家畜育種中的一項(xiàng)重要應(yīng)用，利用與育種性 狀相關(guān)的各種標(biāo)記代替W表型為基礎(chǔ)的選擇，從分子水平上分析個(gè)體的遺傳組成，從而實(shí) 現(xiàn)對(duì)基因型的直接選擇，可克服直接選擇的弊端，提高選擇的準(zhǔn)確性和縮短世代間隔。
[0003] 總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)等豬的繁殖性狀是重要的經(jīng)濟(jì)性狀，直接關(guān)系到養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng) 濟(jì)效益。
[0004] KISS-1基因是Lee JH等于1996年利用消減雜交的方法研究人黑瘤素細(xì)胞不同轉(zhuǎn) 移能力時(shí)發(fā)現(xiàn)并命名，具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用。人KISS-1基因被定位于lq32-41，包含4個(gè)外 顯子和3個(gè)內(nèi)含子，前2個(gè)外顯子不翻譯。KISS-1基因的編碼產(chǎn)物為kissp邱tin,是G蛋白偶 聯(lián)受體54(G protein-coupled receptor 54,GPR54)的配體，并組成KISS-1/GPR54系統(tǒng)。越 來(lái)越多的研究表明，KI S S -1 / G P R 5 4系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物初情期的啟動(dòng)中起關(guān)鍵作用， kissp邱tin對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸具有重要調(diào)控作用。目前，尚未見(jiàn)KISS-1基因與豬繁殖 性能關(guān)聯(lián)分析的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種與豬繁殖性狀相關(guān)的 分子標(biāo)記，為豬的分子育種提供新的思路，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述分子標(biāo)記的檢 測(cè)方法和應(yīng)用。
[0006] 技術(shù)方案:本發(fā)明所述的與豬繁殖性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，它為豬KISS-1基因片段， 所述的豬KISS-1基因片段含有多態(tài)性位點(diǎn)，所述的多態(tài)性位點(diǎn)位于豬KISS-1基因核巧酸序 列中的第2343位，所述的多態(tài)性位點(diǎn)具有G/C堿基的變異。
[0007] 豬KISS-1基因序列的核巧酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的多態(tài)性位點(diǎn)，與豬總 產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)緊密相關(guān)，可利用該位點(diǎn)開(kāi)發(fā)與豬繁殖性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。本發(fā)明中， 描述多態(tài)性位點(diǎn)的位置時(shí)，W基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)核巧酸位置為Ibp，上游為負(fù)，下游為正J員 次記數(shù)，第2343bp位是指KISS-1基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)開(kāi)始的第2343bp位，該位點(diǎn)處于SEQ ID NO. 4所示序列的第2643bp位。
[000引本發(fā)明所述的豬KISS-1基因片段如SEQ ID N0.1所示。當(dāng)然，本發(fā)明所述的豬 KISS-1基因片段也可W為包含如SEQ ID N0.1所示的核巧酸序列的DNA片段。根據(jù)檢測(cè)方 法，可W選擇合適長(zhǎng)度的能夠包含多態(tài)性位點(diǎn)的DNA片段。
[0009] 本發(fā)明還提供了所述分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，包括：
[0010] (1)根據(jù)所述的分子標(biāo)記的核巧酸序列設(shè)計(jì)引物；
[0011] (2) W待檢測(cè)豬的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[001 ^ (3)判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中多態(tài)性位點(diǎn)的類(lèi)型。
[0013] 步驟(3)中，可對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序或電泳分析，判斷多態(tài)性位點(diǎn)的堿基類(lèi)型。
[0014] 優(yōu)選的，步驟(1)中，上游引物的核巧酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核巧 酸序列如SEQ ID NO.3所示。利用該引物，可采用PCR-RFLP的方法準(zhǔn)確方便的檢測(cè)多態(tài)性位 點(diǎn)的類(lèi)型。
[0015] 本發(fā)明還提供了所述的分子標(biāo)記在豬繁殖性狀選擇中的應(yīng)用。
[0016] 具體的，豬可W為小梅山豬、楓徑豬或大白豬。繁殖性狀為總產(chǎn)仔數(shù)或產(chǎn)活仔數(shù)。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0018] 本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，豬KISS-1基因第2外顯子存在一個(gè)突變位點(diǎn)（即多態(tài)性位點(diǎn)），該 位點(diǎn)位于豬KISS-1基因核巧酸序列中的第2343位，該突變位點(diǎn)與豬的繁殖性狀尤其是總產(chǎn) 仔數(shù)或產(chǎn)活仔數(shù)相關(guān)，且容易檢測(cè)，從而本發(fā)明根據(jù)該突變位點(diǎn)提供了一種與豬繁殖性狀 相關(guān)的分子標(biāo)記，并提供了該分子標(biāo)記的檢測(cè)方法及在豬繁殖性狀選擇中的應(yīng)用，為豬分 子育種、研究豬繁殖生理機(jī)制提供基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為實(shí)施例1中PCR-RFLP檢測(cè)結(jié)果；
[0020] 圖2為實(shí)施例1中PP和QQ基因型個(gè)體PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果；
[0021] 圖3為實(shí)施例1中PP和QQ基因型個(gè)體的氨基酸比對(duì)結(jié)果；
[0022] 圖4為實(shí)施例1豬KISS-1基因 G2343C酶切位點(diǎn)分析結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。
[0024] 實(shí)施例1
[0025] 2013年采集106頭小梅山豬、42頭楓徑豬和70頭大白豬的耳樣；同時(shí)整理了江蘇農(nóng) 林職業(yè)技術(shù)學(xué)院小梅山豬育種中屯、2004年~2012年期間上述106頭小梅山母豬的生產(chǎn)檔 案，共有698窩仔豬記錄，主要收集產(chǎn)仔年份、胎次、TNB、NBA等指標(biāo)。耳樣(約0.15g)用耳號(hào) 錯(cuò)采集，-20°C凍存。用常規(guī)的酪氯仿抽提法提取豬基因組DNA，對(duì)基因組DNA進(jìn)行0D值測(cè)定， 計(jì)算其濃度，并用d地2〇稀釋至終濃度為10化g/化，原液-20°C保存，稀釋液4°C保存，稀釋液 作為PCR擴(kuò)增的模板。
[00%] 第一步:根據(jù)GenBank公布的豬KISS-1基因全序列(登錄號(hào):NC_010451.2)，確定豬 KISS-1基因第2外顯子區(qū)域。
[0027]第二步：采用PrimerS.O軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，擴(kuò)增第2外顯子區(qū)域。引物為：KISS- 2.1。上游弓|物序列為：5'-1：(31：(3(31:1邑。邑曰(31:1:1邑1：(3(31：-3'，下游弓|物序列為：5'- tctcccgctgcactaacac-3'，擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?262bp-249化p(SEQ ID N0.1)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度 23f5bp。
[002引第Ξ步:PCR-RFLP檢測(cè)。
[0029] PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20化，包括：10XBuffer2.0μL，25mMMg2+2.2化， lOmM dNTPs 0.如L，10yM上、下游引物各化L，DNA模板化L(lOOng)，抓?化-iTaq酶0.2化， d地2〇 11.如UPCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性5min;31個(gè)循環(huán)（94°C變性lmin，59°C退火 30s，72°C延伸Imin);最后72°C延伸10min，4°C保存產(chǎn)物。
[0030] RFLP檢測(cè)程序:反應(yīng)體系為10化，包括化L PCR產(chǎn)物、0.2化內(nèi)切酶(Mstl)、l化10 X Buffer和6.如L d地2〇。酶切溫度水浴過(guò)夜，R化P產(chǎn)物用10 %的聚丙締酷胺凝膠120~ 200V電泳3~地，銀染，拍照保存?；蛐头中徒Y(jié)果見(jiàn)圖1，圖1中，泳道1、2、4的基因型為QQ， 泳道3、5、10、13的基因型為PP，泳道6-9、11、12的基因型為PQ，Μ為Marker。
[0031] 第四步:將PP和QQ基因型個(gè)體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序 結(jié)果見(jiàn)圖2。氨基酸比對(duì)結(jié)果顯示:G2343C導(dǎo)致谷氨酸(Glu)變?yōu)楣劝笨岚?Gln)，即E55Q，見(jiàn) 圖3。酶切位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，G2343C產(chǎn)生一個(gè)新的酶切位點(diǎn)，即MstI，見(jiàn)圖4。
[0032] 第五步:分析該位點(diǎn)在不同豬群中的分布情況。結(jié)果見(jiàn)表1，3個(gè)豬群中共檢測(cè)到3 種基因型與2個(gè)等位基因，小梅山豬與楓徑豬中等位基因 P為優(yōu)勢(shì)基因，基因頻率分別為 0.684、0.845;大白豬中未能檢測(cè)到PP型個(gè)體，QQ型為優(yōu)勢(shì)基因型，占總數(shù)的92.86%。
[0033] 表1 3個(gè)豬群KISS-1基因 G2343C位點(diǎn)的基因型頻率與等位基因型頻率
[0034]
[0035] 第六步:SPSS軟件關(guān)聯(lián)分析該突變位點(diǎn)與繁殖性狀間的關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)表2,1~2胎 小梅山母豬中，PQ型個(gè)體的TNB為11.65頭、比PP型個(gè)體高0.42頭(P〉0.05)，比QQ型個(gè)體高 0.65頭(P〉0.05);PQ型個(gè)體的NBA為11.10頭，比PP、QQ型個(gè)體分別高0.45頭(P〉0.05)、0.39 頭(P〉0.05)d2胎W上小梅山母豬中，PQ型個(gè)體的TNB為12.58頭、比？?型個(gè)體高0.16頭?！?0.05)，比QQ型個(gè)體高2.70頭(P<0.01); PQ型個(gè)體的NBA為11.93頭，比PP、QQ型個(gè)體分別高 0.38頭(P〉0.05)、2.58頭(P<0.01)。所有胎次的小梅山母豬中，PQ型個(gè)體的TNB為12.34頭、 比PP型個(gè)體高0.19頭(P〉0.05)，比QQ型個(gè)體高2.13頭(P<0.01); PQ型個(gè)體的NBA為11.72頭， ttPP、QQ 型個(gè)體分別高 0.37 頭(P<0.05)、1.97 頭(P<0.01)。
[0036] 表2 KISS-1基因 G2343C位點(diǎn)與小梅山豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析
[0037]
[003引注:N為窩數(shù);TNB為總產(chǎn)仔數(shù);NBA為產(chǎn)活仔數(shù)
[0039] 結(jié)果提示:豬KISS-1基因 G2343C位點(diǎn)雜合子繁殖性能優(yōu)于純合子，在選種時(shí)應(yīng)加 強(qiáng)雜合子的選留。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種與豬繁殖性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，其特征在于，它為豬Kiss-1基因片段，所述的豬 KISS-1基因片段含有多態(tài)性位點(diǎn)，所述的多態(tài)性位點(diǎn)位于豬KISS-1基因核苷酸序列中的第 2343位，所述的多態(tài)性位點(diǎn)具有G/C堿基的變異。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記，其特征在于，所述的豬KISS-1基因片段包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子標(biāo)記，其特征在于，所述的豬KISS-1基因片段如SEQ ID NO. 1所示。4. 一種根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的與豬繁殖性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，其 特征在于，包括： (1) 根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的分子標(biāo)記的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物； (2) 以待檢測(cè)豬的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3) 判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中多態(tài)性位點(diǎn)的類(lèi)型。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(1)中，上游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。6. -種根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的分子標(biāo)記在豬繁殖性狀選擇中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，豬為小梅山豬、楓涇豬或大白豬。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，繁殖性狀為總產(chǎn)仔數(shù)或產(chǎn)活仔數(shù)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種與豬繁殖性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其檢測(cè)方法和應(yīng)用。所述分子標(biāo)記為豬KISS-1基因片段，所述的豬KISS-1基因片段含有多態(tài)性位點(diǎn)，所述的多態(tài)性位點(diǎn)位于豬KISS-1基因核苷酸序列中的第2343位，所述的多態(tài)性位點(diǎn)具有G/C堿基的變異。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)豬KISS-1基因第2外顯子存在一個(gè)突變位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于豬KISS-1基因核苷酸序列中的第2343位，該突變位點(diǎn)與豬的繁殖性狀尤其是總產(chǎn)仔數(shù)或產(chǎn)活仔數(shù)相關(guān)，且容易檢測(cè)，本發(fā)明根據(jù)該突變位點(diǎn)提供了一種與豬繁殖性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，并提供了該分子標(biāo)記的檢測(cè)方法及在豬繁殖性狀選擇中的應(yīng)用，為豬分子育種、研究豬繁殖生理機(jī)制提供基礎(chǔ)。
【IPC分類(lèi)】C12N15/11, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105671172
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610143591
【發(fā)明人】吳井生, 陳永霞, 郭蘋(píng), 陳超
【申請(qǐng)人】江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院
【公開(kāi)日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2016年3月14日