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      一種改變脂肪酶催化活性的活性重塑方法_3

      文檔序號:9919759閱讀:來源:國知局
      化活性由0.03U ? mg-1分別提高到3. IU ? mg-哺5. IU ? mg-i,提高了 近103.3倍和170倍,變性時添加膜環(huán)境復合物處理使醋化活性總活力回收率達到814.3%, 復性時添加膜環(huán)境復合物處理使醋化活性總活力回收率達到1028.6% ;水解活性由0.9U ? mg-1分別改變?yōu)?.4U ? mg-哺0.抓? mg-1,略有下降。水解活性總活力回收率分別達至Ij4%和 3.5%。
      [0092] 表2活性重塑前后外源表達華根霉成熟膚脂肪酶包涵體的醋化活性和水解活性對 比
      [0093]
      [0094] 實施例5:商品化華根霉脂肪酶r27R化活力的恢復
      [0095] 商品化的華根霉脂肪酶r27R化購自江蘇一鳴生物科技有限公司,具有較高的水解 活性,但不具有合成醋的能力。將該脂肪酶酶粉復溶后取上清進行活性重塑處理,結(jié)果如表 3所示,醋化活性由IU ? mg-i提高到18U ? mg-i,總醋化活性回收率達至1]132.5%,同時水解活 性由1328U ? mg-i降低為735U ? mg-i;若在復性時同時添加膜環(huán)境復合物和表面活性劑 Triton X-100,則醋化活性提高到31U ? mg-i,總醋化活性回收率達到225.4%,同時水解活 性恢復到1363U ? mg^。
      [0096] 表3活性重塑前后的華根霉脂肪酶r27R化的醋化活性和水解活性對比 [00971
      [009引實施例6:商品化黑曲霉脂肪酶A活力的恢復
      [0099] 商品化的黑曲霉脂肪酶A購買自Amano公司,非固定化酶制劑粉末,復溶后取上清 進行活性重塑處理,結(jié)果如表4所示,醋化活性由OU ? mg-i提高到4.2U ? mg-i,總醋化活性回 收率達到257 %。
      [0100] 表4活性重塑前后的黑曲霉脂肪酶A的醋化活性和水解活性對比
      [0101]
      [0102]實施例7:商品化疏棉狀嗜熱絲抱菌脂肪酶Lipozyme TL IM活力的恢復 [0103] 商品化疏棉狀嗜熱絲抱菌脂肪酶Lipozyme TL IM購買自Novozymes公司,非固定 化酶制劑粉末,復溶后取上清進行活性重塑處理(復性時單獨添加膜環(huán)境復合物,或者同時 添加膜環(huán)境復合物和表面活性劑)。結(jié)果如表5所示,醋化活性由0 .洲? mg-i提高到8.3U ? mg-i,總醋化活性回收率達到269%。其中添加膜環(huán)境復合物和表面活性劑是指在復性過程 中同時添加運兩者,表面活性劑的添加量為1.5%(v/v)T;riton X-100。
      [0104] 表5活性重塑前后的Lipozyme TL IM的醋化活性和水解活性對比 [01051
      [0106]實施例8:商品化洋蔥假單胞菌脂肪酶62309活力的恢復
      [0107] 商品化洋蔥假單胞菌脂肪酶62309購買自Sigma-Al化ich公司,非固定化酶制劑粉 末,復溶后取上清進行活性重塑處理(復性時單獨添加膜環(huán)境復合物,或者同時添加膜環(huán)境 復合物和表面活性劑),結(jié)果如表6所示,醋化活性由0.抓? mg-i提高到16U ? mg-i,總醋化活 性回收率達到196%。若在復性時同時添加膜環(huán)境復合物和表面活性劑化iton X-100,則醋 化活性提高到78U ? mg-i,總醋化活性回收率達到299%。
      [010引表6活性重塑前后的洋蔥假單胞菌脂肪酶62309的醋化活性和水解活性對比
      [0109]
      [0110] 實施例9:商品化南極假絲酵母脂肪酶CALB活力的恢復
      [0111] 商品化南極假絲酵母脂肪酶CALB購買自Novozymes公司,非固定化酶制劑粉末,復 溶后取上清進行活性重塑處理(復性時同時添加膜環(huán)境復合物和表面活性劑),結(jié)果如表7 所示,在復性時同時添加膜環(huán)境復合物和表面活性劑化iton X-100,則醋化活性由23U ? mg氣是高到73U ? mg^,總醋化活性回收率達到105%。
      [0112] 表7活性重塑前后的南極假絲酵母脂肪酶CALB的醋化活性和水解活性對比 [01131
      [0114] 實施例10:不同表面活性劑對商品化華根霉脂肪酶r27R化活力恢復的影響
      [0115] 商品化生產(chǎn)的華根霉脂肪酶r27R化具有較高的水解活性,但不具有合成醋的能 力。將該酶制劑酶粉復溶后取上清酶液采用實施例2的方案A和C進行活性重塑處理,醋化活 性由0.019U ? mg-i提高到1.56U ? mg-i,總醋化活性回收率達到451.6% ;若在添加膜環(huán)境復 合物復性時,同時添加不同表面活性劑化iton X-100,DiC6PC和LPC14,,則醋化活性分別可 提高到2.0411*111邑^,3.19和6.261]*111邑^,總醋化活性回收率分別達到1068.3%,1035.1% 和1892.2%,表明不同表面活性劑對于該蛋白活性重塑也有一定的影響(表7)。
      [0116] 表8不同表面活性劑對脂肪酶醋化活力恢復的影響 「0/1/1-71
      [0118] 綜上,本發(fā)明通過模擬蛋白折疊所處的細胞微環(huán)境對脂肪酶進行體外活性重塑改 造,成功獲得恢復了高醋化活性的可溶性脂肪酶。工程菌大腸桿菌E. COli表達的可溶性華 根霉成熟膚脂肪酶MPi經(jīng)重塑后醋化活性由0.93U ? mg-i提高到5.26U ? mg-i,醋化活性總活 力回收率達到441 % ;而工程菌表達的華根霉成熟膚脂肪酶包涵體,經(jīng)活性重塑后醋化活性 由0.03U ? mg-i提高到3.1~5.1U ? mg-i,提高了 103.3~170倍,醋化活性總活力回收率達至。 814.3~1028.6% ;工程菌己斯德畢赤酵母Pichiapastoris表達的帶有27個前導膚氨基酸 的華根霉脂肪酶r27RCL經(jīng)重塑后醋化活性由IU ? mg-i提高到31U ? mg-i,總醋化活性回收率 達到225.4% ;商品化黑曲霉脂肪酶A經(jīng)重塑后醋化活性由OU ? mg-i提高到4.2U . mg-i,總醋 化活性回收率達到257%;商品化疏棉狀嗜熱絲抱菌脂肪酶Lipozyme TL IM經(jīng)重塑后醋化 活性由0.洲? mg-i提高到8.3U ? mg-i,總醋化活性回收率達到269% ;商品化洋蔥假單胞菌 脂肪酶62309經(jīng)重塑后醋化活性由0.3U ? mg-i提高到78U ? mg-i,總醋化活性回收率達到 299% ;商品化南極假絲酵母脂肪酶CALB經(jīng)重塑后醋化活性由23U . mg-i提高到73U . mg-i, 總合醋化活性回收率達到105%。醋化活性相對比活力及總活力回收率的共提高,表明體外 模擬細胞微環(huán)境的活性重塑處理對脂肪酶的活性恢復產(chǎn)生了積極影響,并且不僅針對華根 霉脂肪酶有效,而在一定程度上對多種脂肪酶具有普遍適用性。
      [0119] 雖然本發(fā)明已W較佳實施例公開如上,但其并非用W限定本發(fā)明,任何熟悉此技 術(shù)的人,在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi),都可做各種的改動與修飾,因此本發(fā)明的保護范 圍應該W權(quán)利要求書所界定的為準。
      【主權(quán)項】
      1. 一種改變脂肪酶催化活性的活性重塑方法,其特征在于,所述方法是對脂肪酶進行 變性和復性處理,在變性或者復性的過程中添加膜環(huán)境復合物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述膜環(huán)境復合物是來自華根霉菌體細胞 的膜環(huán)境復合物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述活性重塑方法,在變性或者復性時單 獨添加膜環(huán)境復合物,或者同時添加膜環(huán)境復合物和表面活性劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述活性重塑是指脂肪酶催化酯化反應的 活性重塑。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于,所述同時添加膜環(huán)境復合物和表面活性劑 中的表面活性劑為以下任意一種或者兩種以上:兩性離子表面活性劑、非離子表面活性劑、 CTAB陽離子表面活性劑。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述脂肪酶為外源表達的華根霉成熟肽脂 肪酶(包括包涵體)、華根霉脂肪酶r27RCL、疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶Lipozyme TL 1M、洋蔥 假單胞菌脂肪酶62309或南極假絲酵母脂肪酶CALB。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述膜環(huán)境復合物的提取,是先從培養(yǎng)好 的華根霉菌體上利用表面活性劑提取膜環(huán)境復合物及膜結(jié)合蛋白,然后通過吸附提取液中 的表面活性劑使膜結(jié)合蛋白沉淀,經(jīng)離心分離后所得上清液即為膜環(huán)境復合物。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法,其特征在于,所述膜環(huán)境復合物的的提取,具體是:(1) 利用華根霉菌體經(jīng)丙酮洗滌制備丙酮粉;(2)將丙酮粉懸浮于磷酸緩沖液中,攪拌、離心、取 沉淀、洗滌兩次以上,然后將洗滌后的沉淀重新懸浮于含有0.05-0.15 %Triton X-100的磷 酸緩沖液中,攪拌、離心,將得到的沉淀懸浮于l-2%Triton X-100磷酸緩沖液中,振蕩4-12 小時、離心,得到的上清液為膜環(huán)境復合物及膜結(jié)合蛋白;(3)在提取液中加入吸附劑Biobeads , 振蕩 、離心 ,所得上清液即為膜環(huán)境復合物 WTS 。9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述方法得到的活性重塑的脂肪酶。10. 權(quán)利要求9所述的脂肪酶在催化酯化反應方面的應用。
      【專利摘要】本發(fā)明公開了一種改變脂肪酶催化活性的活性重塑方法,屬于酶工程技術(shù)領域。本發(fā)明通過脂肪酶體外重塑過程中添加不同的調(diào)節(jié)因子,獲得具有高酯化活性的重構(gòu)脂肪酶,以滿足脂肪酶非水相催化的需要。將不具有酯化活性或者活性較低的各種微生物脂肪酶,包括大腸桿菌工程菌外源表達的脂肪酶以及商品脂肪酶,經(jīng)8M尿素變性處理,在復性過程中添加從華根霉細胞提取的膜環(huán)境復合物WTS,可獲得酯化活性顯著提高的活性重塑脂肪酶,同時脂肪酶常見的水解活性也發(fā)生變化。酯化活性的恢復使脂肪酶更適合工業(yè)化應用。
      【IPC分類】C12N9/20
      【公開號】CN105695432
      【申請?zhí)枴緾N201610261953
      【發(fā)明人】王棟, 徐巖, 張璋
      【申請人】江南大學
      【公開日】2016年6月22日
      【申請日】2016年4月25日
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