香蕉抗氧化相關蛋白MaBBI1及其基因的新應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了香蕉抗氧化相關蛋白MaBBI1及其編碼基因在改良植物對氧化脅迫耐受性和抗病菌的應用。該基因在工程菌釀酒酵母中表達可以提高酵母對H2O2脅迫的耐受能力，表明MaBBI1蛋白具有抗氧化的能力，同時誘導分離純化到的MaBBI1蛋白在體外還具有抑制病原菌生長的效果，表明MaBBI1蛋白具有抗菌肽的功能。該基因具有應用于植物抗病害遺傳工程育種的潛力，通過調控該基因在植物中的表達，可以改變轉基因植物對病原菌的耐受性。
【專利說明】
香蕉抗氧化相關蛋白MaBBM及其基因的新應用
技術領域
[00011本發(fā)明屬于生物基因工程領域，具體涉及香蕉抗氧化相關蛋白MaBBIl (Musa acuminata Bowman-Birk inhibitor j_)及其編碼基因和在調控釀酒酵母對氧化脅迫耐受 性和/抗病原菌方面的應用。
【背景技術】
[0002] 已有研究表明，自然界多數逆境脅迫均可引起細胞不同程度的氧化損傷，H202作為 一種活性氧，其在細胞內大量積累能夠破壞氧化代謝平衡，對細胞造成氧化損傷?？寡趸?作用途徑之一是通過阻止超氧化物陰離子基團的釋放從而達到抗氧化的目的。BBI (Bowman-Birk inh ib i tor)是一種富含半胱氨酸的植物蛋白酶抑制劑，對胰蛋白酶、糜蛋白 酶及彈性蛋白酶等絲氨酸蛋白酶均有抑制作用，BBI可以抑制病原菌蛋白酶對寄主細胞的 降解，使病原菌營養(yǎng)不足，生長繁殖受限，浸染與擴展受阻，從而達到抗病的目的。另外，BBI 蛋白可以抑制自由基的產生、減少活性氧的含量，有效清除細胞內富余的活性氧，降低細胞 的氧化損傷，維持細胞內氧化代謝的平衡，從而達到抗氧化的作用。
[0003] 香蕉測序品種芭蕉亞種的基因序列表明，香蕉中至少存在9個BBI相關蛋白。參與 應答香蕉激素處理、逆境脅迫的表達反應。該基因編碼一個香蕉抗氧化相關蛋白基因，該基 因在NCBI (http://www.ncbi ? nlm.nih.gov/)已公布的測序品種巴蕉亞種(Musa acuminata subsp)的編號為L0C103995028,命名為MaBBIl(Musa acuminata Bowman-Birk inhibitor 1)。該基因編碼一個包含381個核苷酸的開放閱讀框，其序列如SEQ ID NO. 1所示。其編碼蛋 白具有126個氨基酸殘基，其序列如SEQ ID N0.2所示。
[0004] 寒冷、干旱、鹽堿、機械損傷等逆境脅迫均可引起植物細胞內超氧陰離子的積累而 導致氧化損傷，繼而導致農作物產量下降，品質不佳。因此，通過克隆香蕉氧化脅迫耐受相 關基因，并研究該基因對香蕉抗氧化作用的影響，具有重要的意義。
[0005] 目前，還沒有文獻報道香蕉抗氧化相關蛋白MaBBIl基因是否能影響氧化損傷在香 蕉中的耐受。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種香蕉抗氧化相關蛋白MaBBIl及其編碼基因 MaBBIl的新應用。
[0007] 本發(fā)明的香蕉抗氧化相關蛋白MaBBIl，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，其編碼 基因MaBBIl的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。應當理解，考慮到密碼子的簡并性， 在不改變氨基酸序列的前提下，對上述編碼基因的核苷酸序列進行修改，也屬于本發(fā)明的 保護范圍內。
[0008] 氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的香蕉抗氧化相關蛋白MaBBIl和/或MaBBIl基因 在提高轉基因植物對氧化脅迫的耐受和/或抗病原菌中的應用，所述MaBBI 1基因的cDNA為 如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，或為與SEQ ID NO. 1互補配對的核苷酸序列，或為編碼 氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的香蕉抗氧化相關蛋白的核苷酸序列。
[0009]優(yōu)選地，所述轉基因植物為香蕉。
[0010]優(yōu)選地，造成氧化脅迫的氧化劑為H2O2。
[0011] 氨基酸序列如SEQ ID如.2所示的]\^8811和/或1^8811基因在香蕉育種中調控香 蕉抗氧化和/或抗病原菌的應用，所述MaBBIl基因的cDNA為如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序 列，或為與SEQ ID NO. 1互補配對的核苷酸序列，或為編碼氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示 的香蕉抗氧化相關蛋白的核苷酸序列。
[0012]本發(fā)明將MaBBIl基因應用于植物基因工程中，用于改變轉基因植物對氧化脅迫耐 受的可能性。本發(fā)明公開了 MaBBIl基因在甲基紫精、重金屬鎘、寒冷、干旱下的誘導表達特 征，表明了該基因參與直接的氧化脅迫和多種逆境脅迫的應答。本發(fā)明采用real-time RT-PCR的方法鑒定了 MaBBIl基因在甲基紫精、重金屬鎘、寒冷、干旱逆境脅迫及激素處理下的 表達特征，表明該基因在包括氧化脅迫在內的多種脅迫處理下均有誘導表達的特征，而在 葉中的表現尤其明顯，論證了該基因為香蕉體內應答氧化脅迫及其他脅迫的重要基因，進 一步延伸了該基因作為影響香蕉氧化脅迫的候選功能基因。在本發(fā)明中，MaBBIl基因的表 達還受茉莉酸甲酯、水楊酸、赤霉素、脫落酸誘導，進一步表明了該基因也參與調控了上述 代謝及信號轉導過程，可將該基因應用于上述基因工程領域。
[0013] 本發(fā)明的另一目的是公開一種釀酒酵母重組表達載體及其應用，該重組載體插入 了MaBBIl基因。將該重組載體轉化進入釀酒酵母中，通過半乳糖誘導該基因在酵母中的超 表達，能夠在H 2〇2脅迫下，提高酵母對H2〇2的耐受，以及表達純化得到的MaBBI 1蛋白具有抗 病菌的作用。
[0014] 實現上述目的的技術方案如下。
[0015] 插入有MaBBIl基因的釀酒酵母重組表達載體，所述MaBBIl基因的cDNA為如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或為與SEQ ID NO.2互補配對的核苷酸序列，或為編碼氨基酸序列 如SEQ ID N0.2所示的香蕉抗氧化相關蛋白的核苷酸序列。
[0016] 上述釀酒酵母重組表達載體在提高工程菌株釀酒酵母對h2〇2的耐受性和/或抗病 原菌中的應用。
[0017] 本發(fā)明的另一目的是提供一種改良香蕉中氧化脅迫的耐受性和/或抗病原菌的生 物制劑。
[0018] 實現上述目的的技術方案如下。
[0019] -種提高香蕉中氧化脅迫耐受性的生物制劑，其活性成份為上述釀酒酵母重組表 達載體，或其活性成份含有MaBBIl基因，所述MaBBIl基因的cDNA為如SEQ ID NO. 1所示的核 苷酸序列，或為與SEQ ID NO. 1互補配對的核苷酸序列，或為編碼氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的香蕉抗氧化相關蛋白的核苷酸序列。
[0020] -種提高香蕉中抗病原菌的生物制劑，其活性成份為權利要求5所述的釀酒酵母 重組表達載體，或其活性成份含有MaBBIl基因，所述MaBBIl基因的cDNA為如SEQ ID NO. 1所 示的核苷酸序列，或為與SEQ ID NO.1互補配對的核苷酸序列，或為編碼氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的香蕉抗氧化相關蛋白的核苷酸序列；或其活性成份為氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的香蕉MaBBI 1蛋白。優(yōu)選地，所述病原菌是大腸桿菌。
[0021] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0022]在本發(fā)明中，我們通過對篩選文庫獲得的MaBBIl基因的進行應用性探索，發(fā)現該 基因以下應用方式:一方面，該基因在釀酒酵母中的超量表達能夠提高酵母對H2〇2的耐受 性。另一方面，通過誘導原核超表達制備的MaBBIl蛋白在體外具有抑制病原菌生長的作用。 [0023] 本發(fā)明也可推廣至農業(yè)生物技術領域，通過改變MaBBIl基因在農作物中的表達， 一方面可以調控農作物對多種逆境脅迫引起氧化損傷的耐受性。另一方面可以調控農作物 對病害的耐受性。從改變農作物對多種逆境脅迫的適應性。
[0024] MaBB11基因具有應用于植物抗病害遺傳工程育種的潛力，通過調控該基因在植物 中的表達，可以改變轉基因植物對病原菌的耐受性。從而克服逆境脅迫引起的氧化損傷以 及病原菌感染而導致的品質下降問題。該基因具有應用于農作物抗氧化和抗病原菌的遺傳 工程育種的潛力。
【附圖說明】
[0025]圖1示香蕉MaBBIl基因應答氧化脅迫及其他逆境和激素脅迫的real-time RT-PCR 檢測。
[0026] 圖2示構建完成的釀酒酵母重組表達載體MaBBIl-pYES260示意圖。
[0027] 圖3示轉化MaBBIl_pYES260的轉基因酵母A skn7對H202脅迫的耐受性提高。
[0028] 圖4示轉化MaBBIl_pYES260的轉基因酵母A yapl對H202脅迫的耐受性提高。
[0029] 圖5示構建完成的MaBB 11蛋白表達載體MaBB 11 -PGEX-6p-l示意圖。
[0030] 圖6示成功誘導、純化GST-MaBBIl重組蛋白。
[0031] 圖7示復性的GST-MaBBIl重組蛋白體外抑制大腸桿菌(DH5a)生長圖。
【具體實施方式】
[0032]本發(fā)明描述了該MaBBIl基因在生物工程方面的應用。將本基因在釀酒酵母中誘導 表達，可以提高酵母對H2〇2的耐受性;依次列推，由于該基因來源于香蕉，通過控制該基因在 香蕉中的表達，也可將該基因應用于香蕉基因工程育種，用于培育耐氧化的香蕉轉基因品 種。
[0033] MaBBIl基因cDNA序列（SEQ ID N0.1)
[0035] MaBBIl蛋白氨基酸序列（SEQ ID NO.2)
[0037] 本發(fā)明以巴西小果野蕉苗葉為材料提取RNA，并將RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模 板，設計引物 MaBBI 1YEF: 5 ' -TACCGAGCTCGGATCCATGAGGTACAACATGGTGG-3 ' 和 MaBBI 1YER: 5 ' - TAGATGCATGCTCGAGCTACTGGGCGAGGAGCG-3'，并采用高保真的Taq酶擴增MaBBI 1 基因的cDNA 閱讀框全長，回收得到的片段連接于酵母表達載體PYES260,形成重組載體MaBBIl-PYES260,并測序。
[0038]采用醋酸鋰的方法將重組載體MaBBIl_pYES260轉化進入釀酒酵母中，采用誘導的 極限培養(yǎng)基(添加半乳糖)培養(yǎng)酵母轉化子克隆，以轉化PYES260空載體的酵母菌株為對照， 30°C培養(yǎng)酵母至OD600為1.5-2，用于檢測轉基因酵母菌對H 2〇2脅迫的耐受性。
[0039]以下通過實施例結合圖對本發(fā)明做進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0040] 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 人，分子克隆：實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press ,1989)中所 述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學試劑，均為市售 產品。
[0041] 除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術和科學術語與屬于本發(fā)明的技術領域 的技術人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實 施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術語"和/或"包括一個或多個相關的所列 項目的任意的和所有的組合。
[0042]實施例l:MaBBIl基因的表達受甲基紫精(MV)、重金屬鎘、低溫、甘露醇(Manntiol) 誘導及激素茉莉酸(JA)、水楊酸(SA)、赤霉素(GA)、脫落酸(ABA)的調控。
[0043] 本研究用巴西小果野巴蕉苗(Musa acuminata)兩周的出根苗為實驗材料，23°C培 養(yǎng)室（16h光照/8h黑暗）用1/2MS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，分別用甲基紫精（100yM)、CdCl2 (0 ? 5mM)、4°C、甘露醇（200yM)、茉莉酸（100yM)、水楊酸（100yM)、赤霉素（100yM)、ABA(100y 1)、處理。收集脅迫處理011、111、611、2411后的香蕉葉和根各0.58，用于提取總1?^。1?^的提取 依照Magen公司HiPure Plant RNA Kits(R4151)的說明書進行。采用兩步法以總RNA為模板 逆轉錄cDNAdcDNA鏈的合成依照全式金公司TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix的說明書進行。
[0044]通過網站QuantPrime(http: //www. quantprime ? de/)在線設計real-time RT-PCR 引物。引物序列如下所示。MaBBI IF : ATGGACCGGATCCCCAACTA和MaBBI 1R : Green Supermix的說明書配制real time RT-PCR反應體系(冰上操作）。選用的香蕉內參基 因八0'頂，引物如下：]\^八0'11^^(5'-丁66丁八丁66八八6(^6(^66丁八-3'）和]\^八0'11^1?(5'-TCTGCTGGAATGTGCTGAGG-3'）（SEQ ID N0.5和SEQ ID 勵.6)。采用兩步法?0?反應，擴增標準 程序如下：
[0046] 所有檢測均采用兩個生物學樣本重復，每個生物學樣本進行三次重復檢測反應。 引物第一次使用時添加程序Stage3檢測溶解曲線，確認引物的特異性。
[0047] 當植物感受到逆境脅迫后，能夠通過信號轉導過程將刺激信號傳遞到細胞內部， 調控基因的表達和蛋白質的合成，從而減少逆境脅迫對自身的傷害。外界逆境脅迫均可引 起細胞不同程度的氧化損傷，BBI蛋白可以抑制自由基的產生、減少活性氧的含量，有效清 除細胞內富余的活性氧，降低細胞的氧化損傷，維持細胞內氧化代謝的平衡，從而達到抗氧 化的作用。如圖1所示，在氧化脅迫（甲基紫精模擬)處理下，MaBBIl基因在根和葉中的表達 量均明顯上調。MaBB 11基因在根中的表達收到重金屬鎘的誘導，在葉中的表達收到低溫和 干旱脅迫(甘露醇模擬）的誘導。在茉莉酸和脫落酸處理下，MaBBIl基因在根和葉中的表達 量均顯著提高。在水楊酸和赤霉素處理下，MaBBIl基因在葉中的表達量均顯著提高?；虻?表達總是與其功能相聯系，表明MaBBIl基因參與應答甲基紫精、重金屬鎘、低溫和甘露醇脅 迫引起的氧化損傷，以及作為茉莉酸、水楊酸、赤霉素、脫落酸信號調節(jié)途徑的下游基因，參 與上述植物激素介導的對逆境脅迫的應答。
[0048] 實施例2:MaBBIl基因的克隆和酵母重組表達載體MaBBIl-pYES260的構建 [0049] 取巴西小果野蕉幼苗的葉，提取幼葉的RNA，并逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，設計 引物MaBBI 1YEF: 5 ' -TACCGAGCTCGGATCCATGAGGTACAACATGGTGG-3 ' 和]\^8811丫￡1?:5'-TAGATGCATGCTCGAGCTACTGGGCGAGGAGCG-3'（SEQ ID N 0.7和SEQ ID N0.8)，采用高保真的 Taq酶PCR擴增MaBBIl基因的cDNA閱讀框全長。采用的PCR體系參考TaKaRa公司PrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer說明書。擴增的DNA片段依照Magen公司HiPure Gel Pure DNA Kits說明書?；厥盏玫降钠斡糜诓迦胫两湍副磉_載體pYES60中。釀酒酵母表達 載體PYES260經BamHI和Xhol雙酶切處理，回收線性化質粒?；厥蘸蟮腗aBBI 1片段和線性化 pYES260質粒經Nanodrop公司紫外分光光度計測定濃度，采用TaKaRa(Clontech)公司的 In-I?U.si〇n?_HD Cloning Ki t進行DNA片段和載體的同源重組連接。按照說明書的方法將反 應產物轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)菌株。挑取單克隆，提取質粒，經測序鑒定為正確的陽性 克隆后，保存質粒備用。經測序分析后，MaBBIl的cDNA核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所編 碼的蛋白質氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。構建好的釀酒酵母重組表達載體MaBBIl-PYES260如圖2所示。
[0050]實施例3:MaBBIl基因在釀酒酵母中的表達提高酵母對氧化脅迫的耐受性 [0051 ] 培養(yǎng)釀酒酵母菌株A skn7和A yapl(購自歐洲酵母研究中心Euroscarf，http:// web ? uni-frankfurt ? de/fbl5/mikro/euroscarf /，菌株編號Y02900和Y00569)，用pYES260 質粒和重組的MaBBI l-pYES260對上述酵母進行轉化。由于MaBBI 1基因是置于酵母半乳糖誘 導的啟動子PGAL1調控之下(見圖1所示），將MaBBIl-pYES260轉化釀酒酵母并置于添加半乳 糖的生長選擇合成培養(yǎng)基（Selective Growth Synthetic Medium，SD medium)上生長，即 可誘導MaBBIl在酵母中異源超量表達。
[0052]酵母轉化采用的方法為醋酸鋰轉化法，具體步驟如下：
[0053] 1)接種待轉化的酵母菌株A skn7和A yapl的單菌落分別于5mL YPD液體培養(yǎng)基 中，于30°C恒溫搖床(200rpm)，培養(yǎng)過夜達到飽和。
[0054] 2)按照1: 100比例轉移上述培養(yǎng)物到20mL YPD液體培養(yǎng)基中于30°C恒溫搖床 (200rpm)繼續(xù)培養(yǎng)，搖3-5h至菌液0D_值達0 ? 4-0 ? 6 ?
[0055] 3)培養(yǎng)液在室溫條件下4000g離心5min，收集細胞。細胞用10mL無菌超純水重懸， 再于室溫下5000-6000g離心5min，沉淀細胞。
[0056] 4)細胞用2mL鋰鹽溶液重懸，鋰鹽溶液按照下表配制(現配現用）：
[0058] 5)將2yL待轉化質粒和10yL變性鮭魚精一起加入1.5mL離心管中混勻。
[0059] 6)往每個離心管中加入200此用鋰鹽溶液重懸的細胞懸液，再加入lmL新鮮配制的 PEG溶液。PEG溶液的配方為：
[0061 ] 3(TC 搖蕩溫育 30min。
[0062] 7)于42°C熱激15min，室溫下離心5s，細胞沉淀用200yL-l mL 1XTE緩沖液（從10 X儲液新鮮配制）重懸，并取其中200yL涂布在添加了半乳糖的SD固體培養(yǎng)基平板上。30 °C 培養(yǎng)2-5天，直到出現轉化子。
[0063] 挑取酵母菌株A skn7和Ayapl轉化空載體pYES260和MaBBIl基因超表達載體 MaBBIl-pYES260的單克隆，接種于2ml添加了半乳糖的SD液體培養(yǎng)基中，30°C恒溫搖床 (200rpm)培養(yǎng)至菌液OD600值達2。按照1:1、1:10、1:100、1:1000將菌液進行逐級稀釋，分別 吸取2yl逐級稀釋的菌液滴至添加有不同濃度(0.25禮、0.40禮、0.601111)11 202的30(添加半乳 糖)固體培養(yǎng)基平板上。30°C培養(yǎng)2天，觀察酵母生長情況。
[0064] 如圖3、4所示，超表達MaBBIl基因的轉基因酵母相比較于轉化空載體pYES260的A skn7和Ayapl酵母突變株而言，能夠在添加〇.25mM H2〇2的SD中生長，而未表達MaBBIl基因 的酵母(轉化空載體PYES260)則不能生長，表明MaBBIl基因在酵母中的表達能夠提高酵母 對氧化脅迫的耐受性。
[0065] 實施例4 :MaBBI 1蛋白表達載體MaBBI l-PGEX-6p-l的構建
[0066] 以MaBBIl-pYES260 質粒為模版，設計引物MaBBIlPEF:5'_ GGGGCCCCTGGGATCCATGAGGTACAACATGGTG-3mMaBBIlYER:5'_ Taq酶PCR擴增MaBBIl基因的全長。采用的PCR體系參考TaKaRa公司PrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer說明書?；厥盏玫降钠斡糜诓迦胫恋鞍妆磉_載體PGEX_6p_l 中。蛋白表達載體PGEX-6p-l經BamHI酶切處理，回收線性化質粒。回收后的MaBBI 1片段和線 性化PGEX-6p_l質粒經Nanodrop公司紫外分光光度計測定濃度，采用TaKaRa( Clontech)公 司的丨n-Fusion'SHD Cloning Kit進行DNA片段和載體的同源重組連接。按照說明書的方法 將反應產物轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)菌株。挑取單克隆，提取質粒，經測序鑒定為正確的 陽性克隆后，保存質粒備用。經測序分析后，MaBBIl的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示， 所編碼的蛋白質氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。構建好的釀酒酵母重組表達載體MaBBIl-PGEX-6p-l如圖5所示。
[0067] 實施例5:MaBBIl蛋白誘導及純化
[0068] 將測序正確MaBBIl-PGEX-6p_l轉入大腸桿菌Rossetta菌株中，用100ml的2XYT溶 液（加Kan，Amp，Crm，三種抗生素）培養(yǎng)含有MaBBI 1-GST的Rossetta菌株，37°C，200rpm，待 0D600至0.4-0.6時，加入終濃度為0.2mM的IPTG，37°C，200rpm再搖4h，取菌體進行SDS聚丙 烯酰胺凝膠電泳，電泳檢測誘導結果如圖6-A所示。將菌液離心后收集菌體置于冰上，用4ml 1 XPBS buffer重懸，用03的探頭，在冰上用20%的功率超聲破碎上述混合樣品，超聲 9sec，停止9sec，共超聲30min至菌液變得清澈。lOOOOrpm離心30min。取上清和沉淀，SDS聚 丙烯酰胺凝膠電泳，MaBBIl蛋白形成包涵體在沉淀中如圖6-B所示，故需將包涵體變性再復 性。
[0069] 包涵體變性復性過程為：將沉淀用洗滌緩沖液（10mM Tris-HCL pH7.8,300mM NaCl，lmM EDTA，l%TritonX-100，lM urea)洗滌，再加入2ml溶解緩沖液（50mM Tirs-HCl pH7 ? 8，5mM MgC12，2? 5mM0-mercaptoethanol，0? 1 %Tween20，8M urea)重懸，用3的探頭， 在冰上用20%的功率超聲破碎上述混合樣品，超聲986〇，停止986〇，共超聲3〇111；[11至沉淀溶 解。lOOOOrpm離心30min，取上清。再往上清中逐滴加入復性緩沖液(0.4M L-Arginine，2mM DTT，0.5M NaCl，50mM Tris-HCl pH8.0)至尿素終濃度為 1M。將復性液用lXPBS(pH8.0)透 析，PGE20000濃縮至體積為2ml，電泳檢測如圖6-C所示。
[0070] 實施例6:MaBBIl蛋白體外抑制大腸桿菌(DH5a)生長
[0071]采用瓊脂擴散的牛津杯法測試復性的MaBBIl蛋白對大腸桿菌(DH5a)活性的抑制。 采用牛血清蛋白BSA作為陰性對照，將樣品MaBBIl蛋白（實施例5純化得到)和對照BSA用PBS 緩沖液溶解，使樣品和對照的濃度分別為〇.35mg ? ml/1。
[0072] 在大腸桿菌的抑制實驗中，先在平板上薄鋪一層新鮮LB固體培養(yǎng)基，待冷卻凝固 后將兩個高溫滅菌的牛津杯分別置于平板上，用搖培過夜的菌液與加熱溶解并冷卻至55°C 的新鮮LB固體培養(yǎng)基以1:250比例混合稀釋成菌懸液，并將菌懸液均勻涂布在新鮮LB固體 培養(yǎng)基上，待菌懸液凝固時拔掉牛津杯，分別往每個牛津杯孔中加入1 〇〇此樣品溶液與對 照，放置于37°C恒溫箱培養(yǎng)15h，抑菌效果如圖7所示，加入了 MaBBIl蛋白的牛津杯孔周圍形 成了一個抑菌圈，大腸桿菌不能生長，而加入牛血清蛋白的牛津杯孔周圍的大腸桿菌則正 常生長?？梢姡鯩aBBI 1蛋白可以調控農作物對病害的耐受性。從改變農作物對多種逆境 脅迫的適應性。
[0073] 以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員 來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保 護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【主權項】
1. 氨基酸序列如SEQ ID ^).2所示的香蕉抗氧化相關蛋白1^8811和/或1^8811基因在 提高轉基因植物對氧化脅迫的耐受和/或抗病原菌中的應用，所述MaBBI 1基因的cDNA為如 SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或為與SEQ ID NO.1互補配對的核苷酸序列，或為編碼氨 基酸序列如SEQ ID NO.2所示的香蕉抗氧化相關蛋白的核苷酸序列。2. 根據權利要求1所述的應用，其特征是，所述轉基因植物為香蕉。3. 根據權利要求1所述的應用，其特征是，造成氧化脅迫的氧化劑為H2〇2。4. 氨基酸序列如SEQ ID ^).2所示的1&^811和/或1^^811基因在香蕉育種中調控香蕉 抗氧化和/或抗病原菌的應用，所述MaBBIl基因的cDNA為如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序 列，或為與SEQ ID NO. 1互補配對的核苷酸序列，或為編碼氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示 的香蕉抗氧化相關相關蛋白的核苷酸序列。5. 插入有MaBBI 1基因的釀酒酵母重組表達載體，所述MaBBI 1基因的cDNA為如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或為與SEQ ID NO.2互補配對的核苷酸序列，或為編碼氨基酸序列 如SEQ ID NO.2所示的香蕉抗氧化相關蛋白的核苷酸序列。6. 權利要求5所述的釀酒酵母重組表達載體在提高工程菌株釀酒酵母對H2〇2的耐受性 和/或抗病原菌中的應用。7. -種提高香蕉中氧化脅迫耐受性的生物制劑，其特征是，其活性成份為權利要求5所 述的釀酒酵母重組表達載體，或其活性成份含有MaBBI 1基因，所述MaBBI 1基因的cDNA為如 SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或為與SEQ ID NO.1互補配對的核苷酸序列，或為編碼氨 基酸序列如SEQ ID NO.2所示的香蕉抗氧化相關蛋白的核苷酸序列。8. 根據權利要求7所述的生物制劑，其特征是，造成氧化脅迫的氧化劑為H2〇2。9. 一種提高香蕉中抗病原菌的生物制劑，其特征是，其活性成份為權利要求5所述的釀 酒酵母重組表達載體，或其活性成份含有MaBBIl基因，所述MaBBIl基因的cDNA為如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或為與SEQ ID NO.1互補配對的核苷酸序列，或為編碼氨基酸序列 如SEQ ID NO.2所示的香蕉抗氧化相關蛋白的核苷酸序列；或其活性成份為氨基酸序列如 SEQ ID NO.2所示的香蕉MaBBIl蛋白。10. 根據權利要求9所述的生物制劑，其特征是，所述病原菌是大腸桿菌。
【文檔編號】A01P1/00GK105820240SQ201610333529
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月19日
【發(fā)明人】楊禮香, 黃司法, 唐志敏
【申請人】廣州大學