一種霜霉病高效生防菌株的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種霜霉病高效生防菌株的篩選方法。本發(fā)明提供的霜霉病高效生防菌株的篩選方法，通過測定生防菌對游動孢子降解率來進行菌種篩選，較好地解決了傳統(tǒng)方法篩選的生防菌株對霜霉病防治效果低的問題，通過對葡萄霜霉病和黃瓜霜霉病的田間防治試驗表明，以游動孢子降解率為新篩選方法獲得的LB 10.9、LB 7.1和LX 10.2對霜霉病的防效均好于以孢子囊萌發(fā)率為篩選方法（傳統(tǒng)方法）獲得的LX 7.3的防效。CGMCC NO．1047720150130
【專利說明】
一種霜霉病高效生防菌株的篩選方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體是一種霜霉病高效生防菌株的篩選方法。
【背景技術】
[0002] 霜霉病屬于難以防治的植物病害，自1882年波爾多液發(fā)明至今，化學防控一直是 其防治的主要措施。近年來，隨著綠色農業(yè)的蓬勃發(fā)展，微生物源農藥以其資源豐富、生物 安全性高和環(huán)境友好等特點，成為當前的研究熱點。
[0003] 傳統(tǒng)的霜霉病生防菌的篩選方法有兩種，一種是拮抗篩選，一般經過平板對峙培 養(yǎng)、溫室育苗篩選和田間試驗三步。但霜霉病至今不能在離體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，人們常用與其 親緣關系較近的疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)代替篩選。菌株不同，活性不同， 替代法篩選出的菌株對霜霉病防治效果不高。另外一種是抑制篩選，通常先經過玻片法測 定孢子囊萌發(fā)情況來篩選生防菌，然后進行溫室育苗篩選和田間試驗。此種方法篩選出的 生防菌株較拮抗篩選法，理論上對霜霉病防治效果要高。因為它是針對霜霉病病原菌篩選 的。然而，孢子囊雖是起傳染作用的重要器官，卻不是霜霉病的直接浸染體，游動孢子才是 霜霉病菌的直接侵染體，篩選降解游動孢子的生防菌株，是篩選霜霉病高效生防菌株的有 效方法。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明針對傳統(tǒng)方法篩選的生防菌株對霜霉病防治效果低的問題，提供一種霜霉 病高效生防菌株的篩選方法，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0005] -種霜霉病高效生防菌株的篩選方法，包括以下步驟：
[0006] (1)孢子囊懸浮液的制備:取4°C條件下保存的采集不超過2天的霜霉病病葉，置于 培養(yǎng)皿中，于20~25°C的生化培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)7d，待新的孢子囊產生后用毛刷將孢子囊 刷下，配成孢子囊懸浮液，備用；
[0007] (2)孢子囊萌發(fā)誘導液的制備:將4 °C條件下保存的采集不超過2天的葡萄新葉榨 汁，過100目篩后，再依次過0.45mi、0.22mi微孔濾膜，即獲得孢子囊萌發(fā)誘導液，備用；
[0008] (3)游動孢子懸浮液的制備:在孢子囊懸浮液中加入孢子囊萌發(fā)誘導液，置于15~ 18°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10~12h，待孢子囊萌發(fā)出游動孢子后，配成游動孢子懸浮液，備 用；
[0009] (4)生防菌對游動孢子降解率的測定:在96孔培養(yǎng)盤中加入游動孢子懸浮液和生 防菌發(fā)酵液，置于15~18°C生化培養(yǎng)箱，黑暗培養(yǎng)5h后，于倒置顯微鏡下計游動孢子數量， 計算降解率，以游動孢子降解率為參考標準篩選菌株。
[0010] 作為優(yōu)選，所述孢子囊懸浮液的制備過程中，將采集到的霜霉病病葉先在流動自 來水中沖洗，然后用潤濕的脫脂棉包被葉柄，再將病葉背面朝上置于帶有濕潤濾紙的培養(yǎng) 皿中。
[0011] 作為優(yōu)選，所述孢子囊懸浮液的制備過程中，待新的孢子囊產生后用毛刷將孢子 囊刷下，用蒸餾水配成終濃度為1 x 105cfu/mL孢子囊懸浮液備用。
[0012] 作為優(yōu)選，所述孢子囊萌發(fā)誘導液的制備過程中，將葡萄新葉按1:5~10的比例加 入蒸餾水榨汁。
[0013] 作為優(yōu)選，所述游動孢子懸浮液的制備過程中，在孢子囊懸浮液中加入體積分數1 ~5%的孢子囊萌發(fā)誘導液。
[0014] 作為優(yōu)選，所述游動孢子懸浮液的制備過程中，待孢子囊懸浮液中的孢子囊萌發(fā) 出游動孢子后，用蒸餾水配成終濃度為1 X 105cfu/mL的游動孢子懸浮液。
[0015] 作為優(yōu)選，所述生防菌對游動孢子降解率的測定過程中，在96孔培養(yǎng)盤中按體積 比1:1的比例加入游動孢子懸浮液和生防菌發(fā)酵液。
[0016] 作為優(yōu)選，所述生防菌對游動孢子降解率的測定過程中，以游動孢子降解率超過 75 %作為菌株篩選的合格標準。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供的一種霜霉病高效生防菌株的篩選方法，本發(fā) 明先通過孔盤共培養(yǎng)的方法，選擇霜霉病病原菌游動孢子的降解菌，然后利用直接生物測 定法篩選菌株，有效地解決了傳統(tǒng)方法篩選的生防菌株對霜霉病防治效果低的問題。本發(fā) 明方法針對性強，方法簡單、效率高、成本低，避免了過多的試驗所造成的浪費。通過對葡萄 霜霉病和黃瓜霜霉病的田間防治試驗表明，以游動孢子降解率為新篩選方法獲得的LB 10.9、LB 7.1和LX 10.2對霜霉病的防效均好于以孢子囊萌發(fā)率為篩選方法(傳統(tǒng)方法)獲 得的LX 7.3的防效。
【具體實施方式】
[0018] 為能清楚說明本發(fā)明的技術特點，下面通過【具體實施方式】對本發(fā)明的方案進行闡 述。以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，但本發(fā)明并不局限于此。
[0019] 實施例一
[0020] 霜霉病高效生防菌株的篩選：
[0021] 1.1霜霉病病原菌的制備
[0022] 1.1.1孢子囊懸浮液的制備
[0023] 取4°C保存條件下采集不超過2天的霜霉病病葉，于流動自來水中沖洗，用潤濕的 脫脂棉包被葉柄，將病葉背面朝上置于帶有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿，于22°C的生化培養(yǎng)箱中保 濕培養(yǎng)7d，待新的孢子囊產生。用無菌毛刷將孢子囊刷下，用蒸餾水配成終濃度為IX 10 5cfu/mL孢子囊懸浮液，備用。
[0024] 1.1.2孢子囊萌發(fā)誘導液的制備
[0025]將4°C保存條件下采集不超過2天的葡萄新葉按1:5~10的比例加入蒸餾水榨汁， 過100目篩后，再依次過0.45mi、0.22mi微孔濾膜，即獲得孢子囊萌發(fā)誘導液。
[0026] 1.1.3游動孢子懸浮液的制備
[0027] 將孢子囊懸浮液，加入體積分數1~5%的誘導液，置于15~18°C的生化培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)12h，待孢子囊萌發(fā)出游動孢子，用蒸餾水配成終濃度為lX10 5cfu/mL游動孢子懸浮 液，備用。
[0028] 1.2孔盤觀察法檢測孢子囊萌發(fā)率(傳統(tǒng)方法）
[0029] 采用傳統(tǒng)的孢子囊萌發(fā)抑制法篩選霜霉病高效生防菌，在96孔培養(yǎng)板上，每孔加 生防菌發(fā)酵液40此、孢子囊懸浮液40此，蒸餾水和波爾多液為對照。每組處理重復3次，置于 15~18°C生化培養(yǎng)箱，黑暗培養(yǎng)24h后，于倒置顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，計算孢子囊萌 發(fā)率。萌發(fā)率（％ )=(已萌發(fā)孢子囊數/總孢子囊數）X 100%。試驗結果見表1。
[0030]表1孢子囊萌發(fā)抑制法篩選霜霉病高效生防菌(傳統(tǒng)方法）
[0032] 由表1可知，供試的50株生防菌中，有11株對霜霉病孢子囊萌發(fā)抑制作用高于波爾 多液，其中LX 7.3抑制作用最強，孢子囊萌發(fā)率為8.11%。
[0033] 1.3孔盤觀察法檢測游動孢子降解率(新方法）
[0034] 用本發(fā)明的游動孢子降解法篩選霜霉病高效生防菌，在96孔培養(yǎng)板上，每孔加生 防菌發(fā)酵液40此、新制備的游動孢子懸浮液40此，蒸餾水為對照。每組處理重復3次，置于15 ~18°C生化培養(yǎng)箱，黑暗培養(yǎng)5h后，于倒置顯微鏡下計游動孢子數量，計算降解率。降解率 (% )=(處理后游動孢子數-處理前游動孢子數)/處理前游動孢子數X 100%。結果見表2。
[0035] 表2游動孢子降解法篩選霜霉病高效生防菌(新方法）
[0037]由表2可知，供試的50株生防菌中，有3株對游動孢子降解率超過75%以上，符合篩 選標準，篩選出的3株生防菌分別為:1^10.9、1^7.1、1^10.2，其中1^10.9降解作用最 強，降解率達90.58%。篩選出的LB 10.9,經鑒定為蠟樣芽孢桿菌，Bacillus cereus，命名 為BCJB01，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏編號是： CGMCC N0.10477，保藏日期為2015年1月30日。
[0038] 實施例二
[0039] 不同篩選方法所得菌株對霜霉病的防治效果試驗。
[0040] (1)1^10.9、1^7.1、1^10.2和1^7.3懸浮劑對葡萄霜霉病田間試驗
[0041] 試驗在山東省科學院生物中心葡萄園內進行，品種為澤山一號和夏黑。
[0042] 試驗按農業(yè)部藥檢所田間試驗準則設計，共11個處理:LB 10.9、LB 7.1、LX 10.2 和LX 7.3懸浮劑用清水分別稀釋成50倍和100倍或50倍和20倍，66.5%霜霉威鹽酸鹽水劑 1000倍液，50 %烯酰嗎啉可濕性粉劑2000倍，清水對照。采用噴霧法施藥，在下午16:00后進 行，每處理10株，3次重復，隨機區(qū)組設計。每小區(qū)隨機調查10個當年抽生新蔓，自上而下調 查10片葉，記錄各級病葉數。葉片分級標準同葉盤法。在田間有零星發(fā)病時開始施藥，間隔7 天用藥1次，連續(xù)用藥3次。在末次藥后3天、7天調查藥后病情指數。試驗期間平均溫度26°C， 降水量96~426.4mm。
[0043]病情指數=2(病級葉數X該級代表值)/調查總葉數X發(fā)病最高級
[0044]防效（％ ) = [1 -（對照區(qū)藥前病指X處理區(qū)藥后病指)/(對照區(qū)藥后病指X處理 區(qū)藥前病指）]X100。
[0045] 在藥后連續(xù)晴天的情況下，LB 10.9、LB 7.1、LX 10.2和LX 7.3懸浮劑對葡萄霜霉 病田間防治效果見表3。
[0046] 表3 1^10.9、1^7.1、1^10.2和1^7.3懸浮劑對葡萄霜霉病田間防效
[0048] 注:每周施藥一次，連續(xù)三次，最后一次用藥后連續(xù)一周未降雨;葡萄品種:澤山一 號。
[0049] 試驗結果顯示，在藥后連續(xù)晴天的情況下，50倍的LB 10.9、LB 7.1、LX 10.2和LX 7.3懸浮劑，在末次藥后3天的防治效果均在75%以上，在末次藥后7天的防治效果分別為 84.05%、81.63%、80.92%和73.30%。其中，新篩選方法獲得的1^10.9、1^7.1和1^(10.2 50倍懸浮劑的防效均高于對照藥劑霜霉威和烯酰嗎啉。而LX 7.3的防效低于對照藥劑霜霉 威，且隨著藥后處理時間的延長，防效下降。
[0050] 在藥后連續(xù)陰雨天的情況下，1^10.9、1^7.1、1^10.2和1^7.3懸浮劑對葡萄 霜霉病田間防效見表4。
[0051] 表4 1^10.9、1^7.1、1^10.2和1^7.3懸浮劑對葡萄霜霉病田間防效
[0053] 注:施藥后連續(xù)降雨，雨后補噴藥劑;葡萄品種:夏黑。
[0054]由表4可知，在藥后連續(xù)陰雨天的情況下，50倍的LB 10.9、LB 7.1、LX 10.2和LX 7.3懸浮劑在末次藥后7天的防治效果分別為58.30%、55.84%、57.70%和29.08%，其中LB 10.9和LX 10.2的防治效果略高于對照藥劑烯酰嗎啉。
[0055] (2)1^10.9、1^7.1、1^10.2和1^7.3懸浮劑對黃瓜霜霉病溫室試驗
[0056]試驗在山東省科學院生物中心溫室內進行，品種為玉璽。
[0057]在黃瓜幼苗生長至2~3片真葉時，用噴霧器將黃瓜霜霉病孢子囊懸浮液對植株進 行全株噴霧接種，用保鮮膜保濕24h，在發(fā)病初期噴施50倍LB 10.9、LB 7.1、LX 10.2和LX 7.3懸浮劑稀釋液，隔6天再噴1次，共噴3次，記錄病情指數和治療效果。以50%烯酰嗎啉可 濕性粉劑2000倍為藥劑對照，清水為空白對照。
[0058]病情指數=2 (病級葉數X該級代表值)/調查總葉數X發(fā)病最高級。
[0059]防治效果=[(對照病級指數-處理病級指數)/對照病級指數]X 100%。
[0060] LB 10.9、LB 7.1、LX 10.2和LX 7.3懸浮劑對黃瓜霜霉病溫室防效見表5。
[0061] 表5 1^10.9、1^7.1、1^10.2和1^7.3懸浮劑對黃瓜霜霉病溫室防效
[0063] 由表5可知，在藥后處理7天時，50倍的LB 10.9、LB 7.1、LX 10.2和LX7.3懸浮劑對 黃瓜霜霉病的防治效果分別為70.73%、66.49 %、62.06%和48.47 %。其中，LB 10.9的防治 效果與對照藥劑烯酰嗎啉相當。
[0064] 1^10.9、1^7.1、1^10.2和1^7.3對葡萄霜霉病和黃瓜霜霉病的防治試驗表明， 以游動孢子降解率為新篩選方法獲得的LB 10.9、LB 7.1和LX 10.2對霜霉病的防效均好于 以孢子囊萌發(fā)率為篩選方法(傳統(tǒng)方法)獲得的LX 7.3的防效。因此，本發(fā)明提供的一種霜 霉病高效生防菌株的篩選方法，較好地解決了傳統(tǒng)方法篩選的生防菌株對霜霉病防治效果 低的問題。
【主權項】
1. 一種霜霉病高效生防菌株的篩選方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 孢子囊懸浮液的制備:取4°C條件下保存的采集不超過2天的霜霉病病葉，置于培養(yǎng) 皿中，于20~25°C的生化培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)7 d，待新的孢子囊產生后用毛刷將孢子囊刷 下，配成孢子囊懸浮液，備用； (2) 孢子囊萌發(fā)誘導液的制備:將4°C條件下保存的采集不超過2天的葡萄新葉榨汁，過 100目篩后，再依次過0.45 μπι、0.22 μπι微孔濾膜，即獲得孢子囊萌發(fā)誘導液，備用； (3) 游動孢子懸浮液的制備:在孢子囊懸浮液中加入孢子囊萌發(fā)誘導液，置于15~18°C 的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10~12h，待孢子囊萌發(fā)出游動孢子后，配成游動孢子懸浮液，備用； (4) 生防菌對游動孢子降解率的測定:在96孔培養(yǎng)盤中加入游動孢子懸浮液和生防菌 發(fā)酵液，置于15~18°C生化培養(yǎng)箱，黑暗培養(yǎng)5 h后，于倒置顯微鏡下計游動孢子數量，計算 降解率，以游動孢子降解率為參考標準篩選菌株。2. 如權利要求1所述的一種霜霉病高效生防菌株的篩選方法，其特征在于:所述孢子囊 懸浮液的制備過程中，將采集到的霜霉病病葉先在流動自來水中沖洗，然后用潤濕的脫脂 棉包被葉柄，再將病葉背面朝上置于帶有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中。3. 如權利要求1所述的一種霜霉病高效生防菌株的篩選方法，其特征在于:所述孢子囊 懸浮液的制備過程中，待新的孢子囊產生后用毛刷將孢子囊刷下，用蒸餾水配成終濃度為1 X105 cfu /mL的孢子囊懸浮液備用。4. 如權利要求1所述的一種霜霉病高效生防菌株的篩選方法，其特征在于:所述孢子囊 萌發(fā)誘導液的制備過程中，將葡萄新葉按1:5~10的比例加入蒸餾水榨汁。5. 如權利要求3或4所述的一種霜霉病高效生防菌株的篩選方法，其特征在于:所述游 動孢子懸浮液的制備過程中，在孢子囊懸浮液中加入體積分數1~5%的孢子囊萌發(fā)誘導液。6. 如權利要求1所述的一種霜霉病高效生防菌株的篩選方法，其特征在于:所述游動孢 子懸浮液的制備過程中，待孢子囊懸浮液中的孢子囊萌發(fā)出游動孢子后，用蒸餾水配成終 濃度為IX 1〇5 cfu /mL的游動孢子懸浮液。7. 如權利要求6所述的一種霜霉病高效生防菌株的篩選方法，其特征在于:所述生防菌 對游動孢子降解率的測定過程中，在96孔培養(yǎng)盤中按體積比1:1的比例加入游動孢子懸浮 液和生防菌發(fā)酵液。8. 如權利要求1所述的一種霜霉病高效生防菌株的篩選方法，其特征在于:所述生防菌 對游動孢子降解率的測定過程中，以游動孢子降解率超過75%作為菌株篩選的合格標準。
【文檔編號】C12N1/00GK105820953SQ201610210220
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月6日
【發(fā)明人】李紀順, 王貽蓮, 謝雪迎, 扈進冬, 楊合同, 陳凱, 魏艷麗
【申請人】山東省科學院生物研究所