一種人原代氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種人原代氣道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，通過清除氣道脂肪及纖維組織，切成小塊貼在預(yù)鋪有IV胎盤膠原的24孔培養(yǎng)板中，加入150μl BMGM培養(yǎng)基，待上皮細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，密度達(dá)70％時將組織塊移至新的預(yù)鋪IV膠原的孔內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)5?8次，至細(xì)胞增殖80?90％豐度時，用胰酶?EDTA消化；采用差異貼壁法去除成纖維細(xì)胞后，加入BEGM培養(yǎng)基重懸上皮細(xì)胞，接種于新的預(yù)鋪IV胎盤膠原的培養(yǎng)皿中，傳代比例不大于1:3，每3天換液1次，即完成細(xì)胞培養(yǎng)。本發(fā)明培養(yǎng)方法設(shè)計合理，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)均一，生長良好，且具有典型的氣道上皮細(xì)胞細(xì)胞的形態(tài)及特點。
【專利說明】
_種人原代氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種原代細(xì)胞培養(yǎng)方法，尤其是一種氣道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]支氣管哮喘及慢性阻塞性肺疾病是最常見的慢性氣道疾病。中國是一個慢性氣道疾病大國，預(yù)計有超過I億患者。氣道上皮作為肺固有免疫的第一道防線在慢性氣道疾病的發(fā)病中扮演重要角色。正常人支氣管上皮細(xì)胞主要功能:(I)支氣管表面的上皮細(xì)胞構(gòu)成了基底柱狀結(jié)構(gòu)，清除粘液纖毛。(2)由纖毛、無纖毛和分泌黏液的細(xì)胞等組成物理屏障。(3)產(chǎn)生和分泌大量化學(xué)介質(zhì)和細(xì)胞因子形成高度復(fù)雜的宿主防御系統(tǒng)。因此氣道上皮細(xì)胞是研究慢性氣道疾病發(fā)病機(jī)制的重要材料。
[0003]目前針對氣道上皮細(xì)胞的研究主要采用永生化的上皮細(xì)胞系，而原代培養(yǎng)多采用酶消化法，動物來源主要是小鼠。然而細(xì)胞系及小鼠氣道上皮細(xì)胞與在體人氣道上皮細(xì)胞差異大，故若能采用原代人氣道上皮細(xì)胞進(jìn)行慢性氣道疾病相關(guān)研究的意義明顯優(yōu)于細(xì)胞系和動物細(xì)胞。但因取材困難，且人類是高等進(jìn)化的生物體其細(xì)胞在體外成功培養(yǎng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)難于低等生物，同時因為成人細(xì)胞體外生長的潛伏期明顯長于嚙齒類動物，所以體外成功培養(yǎng)愈加困難?，F(xiàn)有的研究采用酶消化法分離培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞，但該方法需要組織較大，消化條件要求嚴(yán)格，往往因不同廠家，甚至同一廠家不同批次的消化酶的差異，需要重新優(yōu)化培養(yǎng)條件，培養(yǎng)穩(wěn)定性差。部分學(xué)者也從海外購買原代人氣道上皮細(xì)胞株進(jìn)行實驗，但細(xì)胞株價格昂貴且無法多次傳代，國內(nèi)一般的實驗室難以大量使用；同時生物制品進(jìn)口海關(guān)審批手續(xù)繁瑣，周期長，往往得到的細(xì)胞株狀態(tài)差，成活率極低。綜上所述，尋找一種高效、簡便、成本低的人氣道上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法成為了實驗成功的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種人氣道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法。該培養(yǎng)方法技術(shù)穩(wěn)定，重復(fù)性好，培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)均一，生長良好，且具有典型的上皮細(xì)胞的形態(tài)及特點。
[0005]本發(fā)明的一種人原代氣道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0006](I)收集帶有氣道相對正常的肺組織樣品，將組織儲存在預(yù)冷的含有雙抗的無菌PBS溶液中；
[0007]其中預(yù)冷條件優(yōu)選為在冰上預(yù)冷;含有雙抗的無菌PBS溶液配方為100mg/ml青霉素及100mg/ml鏈霉素，肺組織樣品在PBS溶液中儲存時間為12h以內(nèi)。
[0008](2)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)預(yù)鋪IV型胎盤膠原醋酸溶液:用醋酸溶液溶解IV型胎盤膠原(商品化制劑:Sigma-alorich C5533)，溶液終濃度為0.05mg/ml，每個24孔板加入500μI，每孔膠原濃度為13.2yg/cm2，置于超凈臺內(nèi)過夜風(fēng)干備用；
[0009]其中所述醋酸溶液為無菌去離子水1ml+冰乙酸200ul，預(yù)鋪膠原板儲存條件為-20°C，1 個月。
[0010](3)將步驟(I)組織樣品放入含預(yù)冷PBS的無菌培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下分離出直徑約Icm帶軟骨環(huán)的氣道，在顯微鏡下仔細(xì)去除氣道外層的脂肪及纖維組織，用預(yù)冷的含有雙抗的無菌PBS溶液沖洗氣道內(nèi)分泌物，將組織樣品切成大小約3 X 3mm的組織塊，貼于步驟
(2)制備的培養(yǎng)板中，貼塊方向為氣管上皮面貼于板上；
[0011](4)每個培養(yǎng)孔加入150μ I的BEGM培養(yǎng)基，置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
[0012](5)待上皮細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，密度達(dá)70%時將組織塊移至新的預(yù)鋪IV胎盤膠原的孔內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，由此獲得原代氣道上皮細(xì)胞；
[0013](6)當(dāng)原代氣道上皮細(xì)胞擴(kuò)增至80-90 %豐度時，用室溫?zé)o菌I3BS溶液清洗后，加入加入0.3-0.5ml 0.1 % -0.2 %胰蛋白酶溶液37 °C消化I_2分鐘，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)回縮、細(xì)胞間隙增大時，加入Iml DMEM完全培養(yǎng)基終止消化并離心，采用差異貼壁法純化上皮細(xì)胞后，沉淀用BEGM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于預(yù)鋪IV胎盤膠原的培養(yǎng)皿中，每3天換液I次，即完成傳代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得傳代培養(yǎng)的人氣道上皮細(xì)胞。優(yōu)選的傳代比例不大于1:3。
[0014]差異貼壁法:離心去上清，用預(yù)熱DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種于沒有預(yù)鋪IV胎盤膠原的培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)箱中靜置1min后小心吸取上清，再次離心去上清，取沉淀。離心條件為I OOOrpm離心I分鐘。其中DMEM完全培養(yǎng)基的預(yù)熱的優(yōu)選條件為37 °C水浴。
[0015]所述的BEGM為BEBM(BronchialEpithelial Basal Medium)500ml中加入表皮生長因子(hEGF，0.5ml)、牛膜島素(Insulin，0.5ml)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferring.5mI)、三碘甲狀腺素(1'1'；[；[0(101:117!'011；[116，0.51111)、氫化可的松(取(11'0(301'1:丨80116，0.51111)、視橫酸(Retinoic Acid,0.5mI)、腎上腺素(Epinephrine，0.5ml)、小牛垂體提取物(ΒΡΕ,2.0ml)、GA,0.5ml ο
[0016]所述的步驟(4)和(6)中的培養(yǎng)條件為37°C、5 % CO2。
[0017]所述的步驟(5)中細(xì)胞爬出時間約為3-5天，組織塊可重復(fù)貼塊5-8次。
[0018]所述的步驟(6)中的胰蛋白酶溶液中含有0.1 % -0.2 % EDTA(乙二胺四乙酸)，每孔加量0.3-0.5ml，消化時間為1-2分鐘;DMEM完全培養(yǎng)基為加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。
[0019]本發(fā)明方法中患者年齡、性別及原發(fā)病不限。
[0020]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點和效果:
[0021](I)成纖維細(xì)胞污染是現(xiàn)有方法培養(yǎng)氣道上皮細(xì)胞的缺陷之一。本方法借助顯微鏡等精細(xì)工具去除氣道外層纖維組織;使用上皮細(xì)胞特異性培養(yǎng)基;傳代時又利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞貼壁的時間差異性，在培養(yǎng)及傳代中最大限度純化上皮細(xì)胞。
[0022](2)培養(yǎng)方法所需標(biāo)本來源豐富，所有帶有Icm直徑氣道的標(biāo)本均可作為組織來源。
[0023](3)培養(yǎng)方法成本低，技術(shù)穩(wěn)定，重復(fù)性好，培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)均一，生長良好。
[0024](4)本發(fā)明可培養(yǎng)正常及病理狀態(tài)下氣道上皮細(xì)胞，用于上皮細(xì)胞的生理及病理生理學(xué)研究，離體細(xì)胞特性更接近與疾病狀態(tài)，為進(jìn)一步深入探索支氣管肺疾病，尤其是哮喘及慢性阻塞性肺疾病等慢性氣道疾病的發(fā)病機(jī)制奠定了條件，提供了豐富的材料來源。
【附圖說明】
[0025]圖1是倒置相差顯微鏡(100X)下組織貼塊后3-5天上皮細(xì)胞逐漸從組織塊周邊爬出的照片。
[0026]圖2是倒置相差顯微鏡(400X)下組織第5次貼塊培養(yǎng)后3-5天人氣道上皮細(xì)胞的照片。
[0027]圖3是倒置相差顯微鏡(100X)下采用酶消化法分離培養(yǎng)7天的氣道上皮細(xì)胞。
[0028]圖4是倒置相差顯微鏡(400X)下組織貼塊后上皮細(xì)胞生長至90%豐度的照片。
[0029]圖5是倒置相差顯微鏡(400X)下傳代培養(yǎng)3天人氣道上皮細(xì)胞的照片。
【具體實施方式】
[0030]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想的前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0031 ]實施例1:人原代氣道上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)
[0032]具體步驟:
[0033](I)收集手術(shù)切除的癌旁正常組織。將肺組織儲存在4°C含有雙抗的無菌PBS溶液中，雙抗配方為100mg/ml青霉素及100mg/ml鏈霉素。
[0034](2)用無菌去離子水1ml+冰乙酸200ul溶解5mg IV型胎盤膠原，終濃度為0.05mg/ml，每個24孔板加入500μ1，置于超凈臺內(nèi)過夜風(fēng)干備用。
[0035](3)將組織樣品放入含預(yù)冷PBS的無菌培養(yǎng)皿中，用消毒滅菌器械分離出直徑約Icm帶軟骨環(huán)的氣道，在顯微鏡下仔細(xì)去除氣道外層的脂肪及纖維組織。用預(yù)冷的含有雙抗的無菌PBS溶液沖洗氣道內(nèi)分泌物。將氣管組織切成大小約3 X3mm的組織塊，氣道上皮面緊貼于預(yù)鋪有IV胎盤膠原的培養(yǎng)板上。
[0036](4)每個培養(yǎng)孔加入 150μ1 的BEGM培養(yǎng)基，BEGM為BEBM(Bronchial EpithelialBasal Medium)500ml中加入表皮生長因子(hEGF，0.5ml)、牛膜島素(lnsulin，0.5mI)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin，0.5ml)、三鵬甲狀腺素(Tri 1dothyronine，0.5ml)、氫化可的松(Hydrocortisone , 0.5ml)、視橫酸(Retinoic Acid，0.5ml)、腎上腺素(Epinephrine ,0.5ml),小牛垂體提取物(BPE，2.0ml)、GA，0.5ml。培養(yǎng)板置入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為37 °C、5 %CO2o
[0037](5)待3-5天上皮細(xì)胞從組織塊邊緣爬出(圖1)，密度達(dá)70 %時將組織塊移至新的預(yù)鋪IV胎盤膠原的孔內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，組織塊可重復(fù)貼塊5-8次(圖2)。
[0038](6)實驗同期采用目前最常用的酶消化法分離培養(yǎng)氣道上皮細(xì)胞，消化法培養(yǎng)的上皮細(xì)胞中可見大量成纖維細(xì)胞污染(圖3)，細(xì)胞純度較差。
[0039]實施例2:人原代氣道上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)
[0040]具體步驟:
[0041](I)在病人或病人授權(quán)人知情同意的前提下，收集肺癌患者手術(shù)切除的癌旁正常組織。將肺組織儲存在4°C含有雙抗的無菌PBS溶液中，雙抗配方為100mg/ml青霉素及100mg/ml鏈霉素。
[0042](2)用無菌去離子水1ml+冰乙酸200ul溶解5mg IV型胎盤膠原，終濃度為0.05mg/ml，每個12孔板加入1000μ1，置于超凈臺內(nèi)過夜風(fēng)干備用。
[0043](3)將組織樣品放入含預(yù)冷PBS的無菌培養(yǎng)皿中，用消毒滅菌器械分離出直徑約Icm帶軟骨環(huán)的氣道，在顯微鏡下去除氣道外層的脂肪及纖維組織。用預(yù)冷的含有雙抗的無菌PBS溶液沖洗氣道內(nèi)分泌物。將氣管組織切成大小約3X3mm的組織塊，氣道上皮面緊貼于預(yù)鋪有IV胎盤膠原的培養(yǎng)板上。
[0044](4)每個培養(yǎng)孔加入 150μ1 的BEGM培養(yǎng)基，BEGM為BEBM(Bronchial EpithelialBasal Medium)500ml中加入表皮生長因子(hEGF，0.5ml)、牛膜島素(lnsulin，0.5mI)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin，0.5ml)、三鵬甲狀腺素(Tri 1dothyronine，0.5ml)、氫化可的松(Hydrocortisone , 0.5ml)、視橫酸(Retinoic Acid，0.5ml)、腎上腺素(Epinephrine ,0.5ml),小牛垂體提取物(BPE，2.0ml)、GA，0.5ml。培養(yǎng)板置入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為37 °C、5 %CO2o
[0045](5)待3-5天上皮細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，密度達(dá)70%時將組織塊移至新的預(yù)鋪IV胎盤膠原的孔內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，組織塊可重復(fù)貼塊5-8次。
[0046]實施例3:原代人氣道上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)
[0047]具體步驟:
[0048](I)收集手術(shù)切除的癌旁正常組織。將肺組織儲存在4°C含有雙抗的無菌PBS溶液中，雙抗配方為100mg/ml青霉素及100mg/ml鏈霉素。
[0049](2)用無菌去離子水5ml+冰乙酸200ul溶解5mg IV型胎盤膠原，終濃度為0.1mg/ml，每個24孔板加入250μ1，置于超凈臺內(nèi)過夜風(fēng)干備用。
[0050](3)將組織樣品放入含預(yù)冷PBS的無菌培養(yǎng)皿中，用消毒滅菌的器械分離出直徑約Icm帶軟骨環(huán)的氣道，在顯微鏡下仔細(xì)去除氣道外層的脂肪及纖維組織。用預(yù)冷的含有雙抗的無菌PBS溶液沖洗氣道內(nèi)分泌物。將氣管組織切成大小約3 X3mm的組織塊，氣道上皮面緊貼于預(yù)鋪有IV胎盤膠原的培養(yǎng)板上。
[0051 ] (4)每個培養(yǎng)孔加入 150μ1 的BEGM培養(yǎng)基，BEGM為BEBM(Bronchial EpithelialBasal Medium)500ml中加入表皮生長因子(hEGF，0.5ml)、牛膜島素(lnsulin，0.5mI)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin，0.5ml)、三鵬甲狀腺素(Tri 1dothyronine，0.5ml)、氫化可的松(Hydrocortisone , 0.5ml)、視橫酸(Retinoic Acid，0.5ml)、腎上腺素(Epinephrine ,
0.5ml),小牛垂體提取物(BPE，2.0ml)、GA，0.5ml。培養(yǎng)板置入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為37 °C、5 %CO2o
[0052](5)待3-5天上皮細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，密度達(dá)70%時將組織塊移至新的預(yù)鋪IV胎盤膠原的孔內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，組織塊可重復(fù)貼塊5-8次。
[0053]實施例4:人原代氣道上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
[0054]具體步驟:
[0055](I)人氣道上皮細(xì)胞擴(kuò)增至80-90 %時(圖4)，用室溫?zé)o菌I3BS溶液清洗后，加入含有0.1 %EDTA胰蛋白酶溶液，每孔加量0.2-0.3ml，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)回縮、細(xì)胞間隙增大時，加入含10 %胎牛血清DMEM中和消化反應(yīng)后，使之形成細(xì)胞懸浮液。
[0056](2) 100rpm離心I分鐘后去上清，用37 °C水浴預(yù)熱DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種于普通培養(yǎng)皿中。
[0057](3)在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中靜置1min后小心吸取上清，100rpm再次離心I分鐘后去上清，沉淀用BEGM培養(yǎng)基重懸后接種于預(yù)鋪有IV胎盤膠原的培養(yǎng)皿中，傳代比例為1:2(圖 5)。
【主權(quán)項】
1.一種人原代氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于:通過以下步驟實現(xiàn): (1)收集帶有氣道的肺組織樣品，將組織樣品儲存在預(yù)冷的含有雙抗的無菌PBS溶液中； (2)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)預(yù)鋪IV型胎盤膠原醋酸溶液，置于超凈臺內(nèi)過夜風(fēng)干備用； (3)將步驟(I)組織樣品放入含預(yù)冷PBS的無菌培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下分離出直徑約Icm的氣道，用預(yù)冷的含有雙抗的無菌PBS溶液沖洗后，切塊貼于步驟(2)制備的培養(yǎng)板中； (4)每個培養(yǎng)孔加入150μ1的BEGM培養(yǎng)基，置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)； (5)待上皮細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，密度達(dá)70%時將組織塊移至新的預(yù)鋪IV膠原的孔內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，由此獲得原代氣道上皮細(xì)胞； (6)當(dāng)原代氣道上皮細(xì)胞擴(kuò)增至80-90%豐度時，加入0.3-0.5ml 0.1%~0.2%胰蛋白酶溶液37°C消化1-2分鐘，加入Iml DMEM完全培養(yǎng)基終止消化并離心，采用差異貼壁法純化上皮細(xì)胞后，用BEGM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于預(yù)鋪IV胎盤膠原的培養(yǎng)皿中，每3天換液I次，即完成傳代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得傳代培養(yǎng)的人氣道上皮細(xì)胞。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人原代氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(2)所述IV胎盤膠原溶液終濃度為0.05mg/ml，IV胎盤膠原鋪板濃度為13.2yg/cm2，IV胎盤膠原板儲存條件為-20 °C，I個月。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人原代氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(3)所述組織塊為3 X 3_。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人原代氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(5)中組織塊可重復(fù)貼塊5-8次。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人原代氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(6)中胰蛋白酶溶液中含有0.1 % -0.2 %乙二胺四乙酸，所述的細(xì)胞接種密度為2-3 X 15個/ml，所述的DMEM完全培養(yǎng)基是:DMEM和胎牛血清的混合溶液，所述的胎牛血清占培養(yǎng)基總體積的10%，離心條件為100rpm，I分鐘。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人原代氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(6)中所述的差異貼壁法為用預(yù)熱的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種于沒有預(yù)鋪IV胎盤膠原的培養(yǎng)皿中，靜置10分鐘后吸取培養(yǎng)基再次尚心。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人原代氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(6)中傳代比例不大于1:3。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人原代氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(4)和(6)中所述的BEGM培養(yǎng)基是:BEBM500ml中加入0.5ml表皮生長因子、0.5ml牛胰島素、0.5ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、0.5ml三碘甲狀腺素、0.5ml氫化可的松、0.5ml視磺酸、0.5ml腎上腺素、2.0ml小牛垂體提取物、0.5ml GA。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人原代氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(4)和(6)中培養(yǎng)條件為37°C、5%C02。
【文檔編號】C12N5/071GK105820996SQ201610247201
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月18日
【發(fā)明人】夏旸, 富禎禎, 王紹斌, 張斌, 李雯, 沈華浩
【申請人】浙江大學(xué)