羰基還原酶及其在制備手性n-保護(hù)-羥基氮雜環(huán)中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種羰基還原酶，及所述羰基還原酶在催化N?叔丁氧羰基?羰基氮雜環(huán)化合物的不對稱還原，生成高光學(xué)純度的相應(yīng)(S)?構(gòu)型的N?叔丁氧羰基?羥基氮雜環(huán)化合物中的應(yīng)用。所述羰基還原酶為由SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第90位、第92位、第94位、第99位、第138位或第174位氨基酸殘基經(jīng)過氨基酸替換后所形成的新氨基酸序列構(gòu)成的N?叔丁氧羰基?羰基哌啶還原活性提高的羰基還原酶突變體。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的工程化羰基還原酶具有活性高、底物譜廣的優(yōu)勢，在制備(S)?N?Boc?羥基氮雜環(huán)中具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【專利說明】
羰基還原酶及其在制備手性N-保護(hù)-羥基氮雜環(huán)中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種工程化羰基還原酶及其在制備手性N-保護(hù)羥基氮雜環(huán)及其衍生物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 許多天然和非天然的藥物中都含有羥基氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)，光學(xué)純的羥基哌啶和羥基吡 咯烷及其衍生物作為合成這些藥物的重要前體，具有廣泛的應(yīng)用前景。其中，（S)-N-Boc-3-羥基哌啶(其中Boc是叔丁氧羰基的縮寫）是合成抗癌新藥BTK抑制劑依魯替尼（Ibrutinib) 的重要前體，利用(S)-N-Boc-3-羥基哌啶合成依魯替尼的工藝如下所示：
[0004]目前手性N-Boc-3-羥基哌啶的制備方法主要有三種，分別是化學(xué)拆分法、化學(xué)不 對稱還原法以及生物轉(zhuǎn)化法?；瘜W(xué)拆分法中將外消旋的哌啶醇溶解于單一構(gòu)型的手性酸 中，特定構(gòu)型的哌啶醇與手性酸形成鹽而沉淀，從而達(dá)到與另一構(gòu)型的哌啶醇分離的目的， 該法存在操作繁瑣、拆分效率低、成本高等缺點(diǎn)?；瘜W(xué)不對稱還原法使用金屬催化劑，催化 效率低，反應(yīng)條件苛刻，并且存在比較嚴(yán)重的環(huán)境污染。生物催化合成方法由于立體選擇性 好、效率高、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、成本低等優(yōu)勢已經(jīng)逐漸成為有機(jī)手性合成尤其是手 性醇合成的重要方法。目前已經(jīng)有多篇專利文獻(xiàn)報(bào)道使用生物催化劑生產(chǎn)光學(xué)純（S)-N-Boc-3-羥基哌啶，中國發(fā)明專利201310054684.9中，使用醇脫氫酶PAR催化N-Boc-3-羰基哌 啶還原，底物濃度33.3 g/L(0.17mol/L)，酶用量為2g/L，NADH添加量為3.3g/L，用異丙醇作 為輔底物，濃度為267g/L，轉(zhuǎn)化32h，產(chǎn)物收率90%，光學(xué)純度>99% ;中國發(fā)明專利 201310173088.2中，使用酮還原酶KRED作為催化劑，進(jìn)行了（S)-N-Boc-3-羥基哌啶的公斤 級(jí)規(guī)模制備，底物濃度為45g/L(0.226mol/L)，酶用量為2.25g/L，用異丙醇作為輔底物，NAD +的用量為〇. 225g/L，轉(zhuǎn)化24h，轉(zhuǎn)化率高于99 %，產(chǎn)品收率80 %，光學(xué)純度99.5 % ;中國發(fā)明 專利201310596266.2中，由3-羥基哌啶出發(fā)，制備N-Boc-3-羰基哌啶，進(jìn)而使用酮還原酶 KRED198作為催化劑，催化N-Boc-3-羰基哌啶還原，在500ml酶促還原反應(yīng)體系中，加入由 100ml的3-羥基-哌啶制備的N-Boc-3-羰基哌啶，10g還原酶KRED198和10g葡萄糖脫氫酶 ⑶H105酶粉，NADP+的添加量為0.1g/L，以葡萄糖作為輔底物，反應(yīng)24h，總產(chǎn)品收率為72%， 光學(xué)純度99.2% ;此外，？(^專利冊2013/190341中，使用系列氧化還原酶催化18〇(3-3-羰基 哌啶還原制備(3)4-8〇〇-3-羥基哌啶，1001111反應(yīng)體系中，底物濃度10(^/1，加酶液5.71111， 以異丙醇作為輔底物，NAD+的添加量為O.lg/L，轉(zhuǎn)化24h，轉(zhuǎn)化率95%，產(chǎn)物光學(xué)純度〉 99.8%〇
[0005] 總的來說，已報(bào)道的N-Boc-3-羰基哌啶還原酶催化劑的活性不高，已報(bào)道的專利 文獻(xiàn)中，所用的催化劑都是游離酶液或酶粉催化劑，催化劑制備過程步驟多，成本高，難以 大規(guī)模應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)；由于使用酶制劑催化反應(yīng)，因此反應(yīng)過程中必須額外添加價(jià)格昂 貴的輔酶，導(dǎo)致生產(chǎn)成本進(jìn)一步提高。另外，已報(bào)道的N-Boc-3-羰基哌啶還原酶催化劑的底 物譜比較狹窄，盡管專利201310054684.9中公開的醇脫氫酶PAR還能催化其他一些羰基底 物的還原，但未見催化不同位點(diǎn)羰基取代的N-Boc-羰基哌啶及其結(jié)構(gòu)類似物N-Boc-羰基吡 咯的報(bào)道，從而限制了這類羰基還原酶的應(yīng)用范圍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種廣譜的、能高效催 化N-Boc-羰基哌啶以及N-Boc-羰基吡咯不對稱還原制備相應(yīng)(S)-羥基產(chǎn)物的高活性的酶， 在此基礎(chǔ)上，直接使用表達(dá)該酶的重組菌株整細(xì)胞作為催化劑，催化N-Boc-羰基哌啶以及 N-Boc-羰基吡咯的不對稱還原，高效利用細(xì)胞自身的輔酶，少加甚至不額外添加價(jià)格昂貴 的輔酶。
[0007] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0008] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案之一是:一種高活性的N-Boc-羰基哌啶還原酶。
[0009] 以N-Boc-羰基哌啶作為底物，對實(shí)驗(yàn)室酶庫進(jìn)行篩選，其中，如序列表SEQ ID 如.2所示氨基酸序列的羰基還原酶0810?1可以催化底物不對稱還原生成(5)-18〇(3-羥基哌 啶，比活力為：1.4U/mg;并且該酶還可以催化N-Boc-羰基吡咯的不對稱還原，生成相應(yīng)的 (S)-N-Boc-羥基吡咯。
[0010] 在此基礎(chǔ)上，采用易錯(cuò)PCR策略對CgKRl進(jìn)行突變改造，以提高該酶對N-Boc-羰基 哌啶以及N-Boc-羰基吡咯的反應(yīng)活性。結(jié)果表明，所有活性顯著提高的突變體都含有90位 絲氨酸殘基的突變。因此，得出一種高活性的N-Boc-羰基哌啶還原酶為由SEQ ID No.2所示 氨基酸序列的第90位氨基酸殘基經(jīng)過氨基酸替換后所形成的新氨基酸序列構(gòu)成的N-叔丁 氧羰基-羰基哌啶還原活性提高的羰基還原酶突變體。SEQ ID No.2所示氨基酸序列對應(yīng)的 喊基序列如SEQ ID No. 1所不。
[0011] 在此基礎(chǔ)上，將所獲得的90位突變點(diǎn)與之前已公開的CgKRl的突變點(diǎn)F92L、F94V、 I99Y、D138N以及G174A(在專利CN 102618513B、CN104099305A中有記載)進(jìn)行組合，對獲得 的組合突變體進(jìn)行活力篩選，獲得兩個(gè)活性顯著提高的突變體CgKRls9Q(；/F92L/F94V/I99Y/G174A和 CgKRl S90F/F92L/I99Y/D138N/G174A 〇
[0012] 突變體0&1(1?159()(；/卩9217卩94￥/199￥/。174纟為由3￡( >)10 1'1〇.2所不氨基酸序列的第90位絲氨 酸替換為半胱氨酸、第92位苯丙氨酸替換為亮氨酸、第94位苯丙氨酸替換為纈氨酸、第99位 異亮氨酸替換為酪氨酸、第174位甘氨酸替換為丙氨酸后所形成的新氨基酸序列構(gòu)成的羰 基還原酶。
[0013] 突變體CgKRls9QF/F92L/I99Y/D138N/G174A為由SEQ ID N〇.2所不氨基酸序列的第90位絲氨 酸替換為苯丙氨酸、第92位苯丙氨酸替換為亮氨酸、第99位異亮氨酸替換為酪氨酸、第138 位天冬氨酸替換為天冬酰胺、第174位甘氨酸替換為丙氨酸后所形成的新氨基酸序列構(gòu)成 的羰基還原酶。
[0014]與母本相比，突變體CgKRls9Q(VF92L/F94V/I99Y/G174A和CgKRls9QF/F92L/I99Y/D138N/G174A對N- Boc-羰基哌啶的反應(yīng)活性分別提高了8.3倍和10.8倍。
[0015]本發(fā)明采用的技術(shù)方案之二是：一種分離的核酸，所述核酸是編碼上述N-Boc-羰 基哌啶還原酶的核酸分子。
[0016] 本發(fā)明所述的核酸的制備方法較佳為:可以從含編碼表達(dá)所述氨基酸序列的蛋白 質(zhì)的表達(dá)質(zhì)?；蛑亟M轉(zhuǎn)化體中分離獲得，也可以通過全基因序列人工合成獲得。
[0017] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知：由于密碼子的簡并性，編碼所述工程化羰基還原酶的堿 基序列不僅限于一種，還可以適當(dāng)引入替換來提供一個(gè)多聚核苷酸的同系物。本發(fā)明中多 聚核苷酸的同系物可以通過對編碼該蛋白序列基因的一個(gè)或多個(gè)堿基在保持酶活性范圍 內(nèi)進(jìn)行替換來制得。
[0018] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案之三是：一種包含本發(fā)明所述的核酸序列的重組表達(dá)質(zhì) 粒。
[0019] 本發(fā)明所述的重組表達(dá)質(zhì)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域常規(guī)方法制備，即將編碼本發(fā)明所述的 工程化羰基還原酶的核酸序列連接于各種表達(dá)載體上構(gòu)建而成。所述的表達(dá)載體可為本領(lǐng) 域常規(guī)的各種質(zhì)粒，優(yōu)選質(zhì)粒pET_28a( + )。
[0020] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案之四是:一種包含上述重組表達(dá)質(zhì)粒的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。
[0021] 本發(fā)明所述重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體可通過將上述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中制得。 所述的宿主細(xì)胞可為本領(lǐng)域常規(guī)的宿主細(xì)胞，只要能滿足重組表達(dá)質(zhì)?？煞€(wěn)定地自行復(fù) 制，且所攜帶的本發(fā)明的基因可被有效表達(dá)即可。較佳地為大腸桿菌，更佳地為大腸桿菌 E.coli BL21(DE3)。其中所述的轉(zhuǎn)化方法為本領(lǐng)域常規(guī)方法，如熱激法，電轉(zhuǎn)法等，較佳地 為熱激法。
[0022] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案之五是:一種重組羰基還原酶的制備方法，其中包括如下 步驟:培養(yǎng)本發(fā)明所述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組羰基還原酶。
[0023] 其中所述的制備方法可采用本領(lǐng)域常規(guī)的培養(yǎng)方法。對于重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化體， 較佳地為:將上述重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體接種至蛋白胨、酵母膏以及氯化鈉配制的培養(yǎng)基中，30~ 40°C，攪拌混合，通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)液的光密度OD600達(dá)到一定指標(biāo)(較佳地為6~8)，加入0.05 ~l.OmM(較佳地為0.5mM)的異丙基-0-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度為 16~37°C (優(yōu)選25°C)，誘導(dǎo)8~24小時(shí)即可得到高效表達(dá)的重組工程化羰基還原酶。
[0024] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案之六是:使用如上所述的重組羰基還原酶催化N-Boc-羰基 氮雜環(huán)不對稱還原制備(S)-N-Boc-羥基氮雜環(huán)的方法。
[0025] 其中所述的N-Boc-羰基氮雜環(huán)的結(jié)構(gòu)如下所示：
[0027] 其中，I :N-Boc-3-羰基哌啶；II :N-Boc-2-羰基哌啶；III :N-Boc-3-羰基吡咯，其中 Boc是叔丁氧羰基的縮寫。
[0028] 所述的不對稱還原反應(yīng)的條件可按本領(lǐng)域此類反應(yīng)的常規(guī)條件進(jìn)行選擇，較佳 的，所述的應(yīng)用包括下述步驟:將表達(dá)重組羰基還原酶與葡萄糖脫氫酶的大腸桿菌整細(xì)胞 加入反應(yīng)緩沖液中，加入羰基反應(yīng)底物與葡萄糖，在一定溫度下混合反應(yīng)。所述工程化羰基 還原酶與N-Boc-羰基氮雜環(huán)化合物的用量比較佳的為80kU/mol~240kU/mol底物，葡萄糖 與N-Boc-羰基氮雜環(huán)化合物的用量比較佳的為200g/mol~300g/mol。反應(yīng)緩沖液為實(shí)驗(yàn)室 常規(guī)緩沖液，pH范圍在5.5~7.0，優(yōu)選為磷酸鉀緩沖液，濃度較佳的為0.1~0.2mol/L。反應(yīng) 溫度較佳的為25~35°C。反應(yīng)過程以在攪拌條件下進(jìn)行較佳。羰基還原酶以及葡萄糖脫氫 酶是由重組基因工程大腸桿菌通過發(fā)酵表達(dá)得到，所述的催化劑是以含有酶的菌體整細(xì)胞 形式加入，額外添加的NADP+的用量以0~0.1mmol/L較佳。在底物以及葡萄糖加入之前，可 先在緩沖液中加入菌體，充分?jǐn)嚢瑭?5h~lh。不對稱還原反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間以產(chǎn)物濃度不再 繼續(xù)增長的時(shí)間為準(zhǔn)。反應(yīng)結(jié)束后，可按本領(lǐng)域常規(guī)方法從反應(yīng)液中提取(S)-N-Boc-羥基 哌啶和(S) -N-Boc-羥基吡咯。
[0029] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的工程化羰基還原酶具有活性高、底物譜廣的優(yōu)勢，在制 備(S)-N-Boc-羥基氮雜環(huán)中具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0031 ]實(shí)施例1高活性N-Boc-羰基哌啶還原酶突變體的篩選
[0032] 采用易錯(cuò)PCR策略對如序列表SEQ ID如.2所示氨基酸序列的羰基還原酶081〇?1進(jìn) 行突變改造，以提高該酶對N-Boc-羰基哌啶以及N-Boc-羰基吡咯的反應(yīng)活性，發(fā)現(xiàn)90位絲 氨酸殘基是影響CgKRl活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。
[0033] 在此基礎(chǔ)上，將90位絲氨酸的不同突變體與已公開的F92L、F94V、I99Y、D138N&& G174A的突變進(jìn)行組合，對獲得的組合突變體進(jìn)行活力篩選，獲得兩個(gè)活性顯著提高的突變 體 CgKRl S90C/F92L/F94V/I99Y/G174A 矛口CgKRl S90F/F92L/I99Y/D138N/G174A。
[0034]篩選獲得的活性顯著提高的突變體如表1所示。
[0035] 表1 N-Boc-羰基哌啶還原活性提高的羰基還原酶突變體
[0037]上述 S90C、S90F、F92L/F94V/I99Y/G174A、F92L/I99Y/D138N/G174A、S90C/F92L/ 卩94￥/199￥/61744、59(^/^9217199￥/0138~/61744分別表示由5￡〇10如.2所示氨基酸序列 的相應(yīng)位點(diǎn)發(fā)生改變后的突變體。
[0038]實(shí)施例 2 重組酶 CgKRls9Q(VF92L/F94V/I99Y/G174A 的發(fā)酵生產(chǎn)
[0039] 重組酶0&1(1?159()(；/卩9217卩94￥/199￥/。174纟為由3￡( >)10 1'1〇.2所不氨基酸序列的第90位絲氨 酸替換為半胱氨酸、第92位苯丙氨酸替換為亮氨酸、第94位苯丙氨酸替換為纈氨酸、第99位 異亮氨酸替換為酪氨酸、第174位甘氨酸替換為丙氨酸后所形成的新氨基酸序列構(gòu)成的羰 基還原酶。
[0040] 重組酶CgKRls9Q(VF92L/F94V/I99Y/G174A是由重組基因工程大腸桿菌通過發(fā)酵表達(dá)得到 的。
[0041] 在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)酶，發(fā)酵培養(yǎng)基采用2 X LB配方，即20g/L蛋白胨，10g/L酵母 粉及l(fā)〇g/L NaCl。補(bǔ)料氮源采用60g/L蛋白胨及60g/L酵母粉的混合液，碳源采用50%(w/w) 的甘油。發(fā)酵液的pH通過采用外源補(bǔ)加酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的出50 4)以及堿(濃氨水)來調(diào)節(jié)恒 定于pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌前調(diào)節(jié)pH至7.2,于121°C滅菌20min。發(fā)酵初始，采用1.5%接 種量接種OD600約1.0左右的新鮮種子液，待菌體生長至為OD600約6~8左右時(shí)加入IPTG至終 濃度0.5mM，于25°C誘導(dǎo)表達(dá)至發(fā)酵活力不再繼續(xù)增長，發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速以及補(bǔ)料 速度使溶氧維持在10~30 %。發(fā)酵16h，結(jié)束發(fā)酵，離心(8000 X g，lOmin)收集菌體，用生理 鹽水洗滌兩次，備用。濕細(xì)胞比活力為4100U/g。
[0042]實(shí)施例 3 重組酶 CgKRls9QF/F92L/I99Y/D138N/G174A 的發(fā)酵生產(chǎn)
[0043] 重組酶CgKRls9QF/F92L/I99Y/D138N/G174A為由SEQ ID N〇.2所不氨基酸序列的第90位絲氨 酸替換為苯丙氨酸、第92位苯丙氨酸替換為亮氨酸、第99位異亮氨酸替換為酪氨酸、第138 位天冬氨酸替換為天冬酰胺、第174位甘氨酸替換為丙氨酸后所形成的新氨基酸序列構(gòu)成 的羰基還原酶。
[0044] 重組酶CgKRls9QF/F92L/I99Y/D138N/G174A是由重組基因工程大腸桿菌通過發(fā)酵表達(dá)得到 的。
[0045]在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)酶，發(fā)酵培養(yǎng)基采用2 X LB配方，即20g/L蛋白胨，10g/L酵母 粉及l(fā)〇g/L NaCl。補(bǔ)料氮源采用60g/L蛋白胨及60g/L酵母粉，碳源采用50% (w/w)的甘油。 發(fā)酵液的pH通過采用外源補(bǔ)加酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的秘04)以及堿(濃氨水)來調(diào)節(jié)恒定于pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌前調(diào)pH至7.2,于121°C滅菌20min。發(fā)酵初始，采用1.5%接種量接種 0D6qq約1.0左右的新鮮種子液，待菌體生長至為0D6qq約6~8左右時(shí)加入IPTG至終濃度 0.5mM，于25°C誘導(dǎo)表達(dá)至發(fā)酵活力不再繼續(xù)增長，發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速以及補(bǔ)料速度 使溶氧維持在10~30%。發(fā)酵20h，結(jié)束發(fā)酵，離心(8000 X g，lOmin)收集菌體，用生理鹽水 洗滌兩次，備用。濕細(xì)胞比活力為4700U/g。
[0046]實(shí)施例4重組葡萄糖脫氫酶的發(fā)酵生產(chǎn)
[0047]以實(shí)驗(yàn)室保存的表達(dá)葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌作為菌種，在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵 產(chǎn)酶，發(fā)酵培養(yǎng)基采用2 X LB配方，即20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉及10g/LNaCl。補(bǔ)料氮源采 用60g/L蛋白胨及60g/L酵母粉，碳源采用50% (w/w)的甘油。發(fā)酵液的pH通過采用外源補(bǔ)加 酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的出504)以及堿(濃氨水)來調(diào)節(jié)恒定于pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌前調(diào)pH至 7.2，于121°C滅菌20min。發(fā)酵初始，采用1.5 %接種量接種OD600約1.0左右的新鮮種子液，待 菌體生長至為〇D6〇〇約6~8左右時(shí)加入IPTG至終濃度0.5mM，于25°C誘導(dǎo)表達(dá)至發(fā)酵活力不 再繼續(xù)增長，發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速以及補(bǔ)料速度使溶氧維持在10~30%。發(fā)酵18h，結(jié) 束發(fā)酵，離心（8000 Xg，10min)收集菌體，用生理鹽水洗滌兩次，備用。濕細(xì)胞比活力為 770U/g〇
[0048]實(shí)施例 5 重組酶 CgKRls9Q(VF92L/F94V/I99Y/G174A 催化 N-BoC-3-幾基哌啶還原
[0049] 取0.2g如實(shí)施例1制備的還原酶濕細(xì)胞(4100U/g)以及0.7g如實(shí)施例3制備的葡萄 糖脫氫酶濕細(xì)胞(770U/g)加入20ml夾套反應(yīng)容器中，加入9mL磷酸鉀緩沖液(0.2mol/L，pH 7.0) ，加入O.lmM NADP+，磁力攪拌，充分?jǐn)嚢鑜h。隨后加入lg的N-Boc-3-羰基哌啶 (0.005mol)以及1.5g葡萄糖，開始反應(yīng)。反應(yīng)過程中滴加IN NaOH，控制pH值為7.0。間歇取 樣，HPLC檢測，反應(yīng)6h后，轉(zhuǎn)化率>99%，終止反應(yīng)。反應(yīng)液離心，上清液加入乙酸乙酯萃取三 次，合并有機(jī)相，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌兩次，用無水硫酸鈉干燥6小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得 到黃色油狀物。將獲得的粗產(chǎn)品在正己烷中結(jié)晶，得到〇.81g(S)-N-Boc-3-羥基哌啶，摩爾 收率為80.1 %，GC純度為98.2%，ee值>99%。
[0050]實(shí)施例6 重組酶 CgKRls9QF/F92L/I99Y/D138N/G174A 催化 N-BOC-3-幾基哌啶還原
[00511 取0.2g如實(shí)施例2制備的還原酶濕細(xì)胞(4700U/g)以及0.7g如實(shí)施例3制備的葡萄 糖脫氫酶濕細(xì)胞(770U/g)加入20ml夾套反應(yīng)容器中，加入9mL磷酸鉀緩沖液(0.2mol/L，pH 7.0) ，加入0.1 mM NADP+，磁力攪拌，充分?jǐn)嚢鑜h。隨后加入lg(0.005mol)的N-Boc-3-羰基哌 啶以及1.5g葡萄糖，開始反應(yīng)。反應(yīng)過程中滴加IN NaOH，控制pH值為7.0。間歇取樣，HPLC檢 測，反應(yīng)4h后，轉(zhuǎn)化率>99%，終止反應(yīng)。反應(yīng)液離心，上清液加入乙酸乙酯萃取三次，合并有 機(jī)相，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌兩次，用無水硫酸鈉干燥6小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到黃色油 狀物。將獲得的粗產(chǎn)品在正己烷中結(jié)晶，得到0 . 80g (S) -N-Boc-3-羥基哌啶，摩爾收率為 79 ? 1 %，GC純度為98 ? 5%，ee值>99%。
[0052]實(shí)施例 7 重組酶 CgKRls9QF/F92L/I99Y/D138N/G174A 催化 N-BoC-2-幾基哌啶還原
[0053] 取0. lg如實(shí)施例2制備的還原酶濕細(xì)胞(4700U/g)以及0.7g如實(shí)施例3制備的葡萄 糖脫氫酶濕細(xì)胞(770U/g)加入20ml夾套反應(yīng)容器中，加入9mL磷酸鉀緩沖液(0.2mol/L，pH 7.0) ，加入0.1 mM NADP+，磁力攪拌，充分?jǐn)嚢鑜h。隨后加入lg(0.005mol)的N-Boc-2-羰基哌 啶以及1.5g葡萄糖，開始反應(yīng)。反應(yīng)過程中滴加IN NaOH，控制pH值為7.0。間歇取樣，HPLC檢 測，反應(yīng)4h后，轉(zhuǎn)化率>99%，終止反應(yīng)。反應(yīng)液離心，上清液加入乙酸乙酯萃取三次，合并有 機(jī)相，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌兩次，用無水硫酸鈉干燥6小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到黃色油 狀物。將獲得的粗廣品在正己燒中結(jié)晶，得到〇 . 84g(S)-N-Boc-2-羥基哌啶，摩爾收率為 83 ? 1 %，GC純度為98 ? 5%，ee值>99%。
[0054] 實(shí)施例8 (S)-N-Boc-3-羥基哌啶的十克級(jí)規(guī)模制備
[0055]取2g如實(shí)施例2制備的還原酶濕細(xì)胞(4700U/g)以及7g如實(shí)施例3制備的葡萄糖脫 氫酶濕細(xì)胞（770U/g)加入250ml三口燒瓶中，加入90mL磷酸鉀緩沖液(0.2mol/L，pH 6.0)， 機(jī)械攪拌，充分?jǐn)嚢?11。隨后加入1(^(0.0541]1〇1)的1'1-13〇〇-3-羰基哌啶以及158葡萄糖，開 始反應(yīng)。反應(yīng)過程中滴加IN NaOH，控制pH值為6.0。間歇取樣，HPLC檢測，反應(yīng)3h后，轉(zhuǎn)化率〉 99%，終止反應(yīng)。反應(yīng)液離心，上清液中加入乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，有機(jī)相用飽和 食鹽水洗滌兩次，用無水硫酸鈉干燥6小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到黃色油狀物。將獲得的粗產(chǎn) 品在正己烷中結(jié)晶，得到8.5 g (S) - N - B 〇 c - 3 -羥基哌啶，摩爾收率為8 4.1 %，G C純度為 98.0%，ee值>99%。
[0056]實(shí)施例9 (S)-N-Boc-3-羥基吡咯的十克級(jí)規(guī)模制備
[0057]取2g如實(shí)施例2制備的還原酶濕細(xì)胞(4700U/g)以及7g如實(shí)施例3制備的葡萄糖脫 氫酶濕細(xì)胞（770U/g)加入250ml三口燒瓶中，加入90mL磷酸鉀緩沖液(0.2mol/L，pH 6.0)， 機(jī)械攪拌，充分?jǐn)嚢鑜h。隨后加入10g(0.05mol)的N-Boc-3-羰基吡略以及15g葡萄糖，開始 反應(yīng)。反應(yīng)過程中滴加IN NaOH，控制pH值為6.0。間歇取樣，HPLC檢測，反應(yīng)24h后，轉(zhuǎn)化率〉 99%，終止反應(yīng)。反應(yīng)液離心，上清液中加入乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，有機(jī)相用飽和 食鹽水洗滌兩次，用無水硫酸鈉干燥6小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到黃色油狀物。將獲得的粗產(chǎn) 品在正己烷中結(jié)晶，得到8.6g(S)-N-Boc-3-羥基吡咯，摩爾收率為85.1 %，GC純度為 98.3%，ee值>99%。
[0058]實(shí)施例10 (S)-N-Boc-3-羥基哌啶的百克級(jí)規(guī)模制備
[0059]取25g如實(shí)施例2制備的還原酶濕細(xì)胞(4700U/g)以及75g如實(shí)施例3制備的葡萄糖 脫氫酶濕細(xì)胞(770U/g)加入2L夾套玻璃反應(yīng)釜中，加入0.9L磷酸鉀緩沖液(0.2mol/L，pH 6.0) ，機(jī)械攪拌，充分?jǐn)嚢鑜h。隨后加入100g的N-Boc-3-羰基哌啶以及150g葡萄糖，開始反 應(yīng)。反應(yīng)過程中滴加IN NaOH，控制pH值為6.0。間歇取樣，HPLC檢測，反應(yīng)2.5h后，轉(zhuǎn)化率〉 99%，終止反應(yīng)。反應(yīng)液離心，上清液中加入乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，有機(jī)相用飽和 食鹽水洗滌兩次，用無水硫酸鈉干燥6小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到黃色油狀物。將獲得的粗產(chǎn) 品在正己烷中結(jié)晶，得到89.3g(S)-N-Boc-3-羥基哌啶，摩爾收率為88.5 %，GC純度為 98.5%，ee值>99%。
[0060]實(shí)施例11 (S)-N-B〇C-3-羥基吡咯的百克級(jí)規(guī)模制備
[00611取25g如實(shí)施例2制備的還原酶濕細(xì)胞(4700U/g)以及75g如實(shí)施例3制備的葡萄糖 脫氫酶濕細(xì)胞(770U/g)加入2L夾套玻璃反應(yīng)釜中，加入0.9L磷酸鉀緩沖液(0.2mol/L，pH 6.0) ，機(jī)械攪拌，充分?jǐn)嚢鑜h。隨后加入100g的N-Boc-3-羰基R比略以及150g葡萄糖，開始反 應(yīng)。反應(yīng)過程中滴加IN NaOH，控制pH值為6.0。間歇取樣，HPLC檢測，反應(yīng)24h后，轉(zhuǎn)化率〉 99%，終止反應(yīng)。反應(yīng)液離心，上清液中加入乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，有機(jī)相用飽和 食鹽水洗滌兩次，用無水硫酸鈉干燥6小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到黃色油狀物。將獲得的粗產(chǎn) 品在正己烷中結(jié)晶，得到84.0g(S)-N-Boc-3-羥基吡咯，摩爾收率為83.1%，GC純度為 98.1%，66值>99%。
[0062]上述的對實(shí)施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。 熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對這些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說明的一般 原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，本領(lǐng) 域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。 <110>華東理工大學(xué) <120>羰基還原酶及其在制備手性iV-保護(hù)-羥基氮雜環(huán)中的應(yīng)用 <1602 <170> Patent丨n version 3.3 <210> 1 <211> 1Q59 <：212> DNA <213> Candida glabrata <400> 1
<21i> 352 <212> PRT <213> Candida glabrata <400> 2 Met Ala Scr Asp Asn Scr Asn Thr Thr Val Phe Val Scr Giy Ala 1 5 10 15 Thr Gly Phe lie Ala Gin I Iis Va! V7al Arg Gin Leu Leu Asp Gin 20 25 30 Asn Tyr Lys Val He Gly Ser Val Arg Ser Ala Glu Lys Giy Asp 35 40 45 His Leu Lys Asn Val lie Phe Lys Gly Gly Asp Pile Asn Tyr (iiu 50 55 60 lie Va! Lvs Asp lie Ser Asp Pro Thr Ala PheAsp His Val Phe 65 70 75 Glu Lys His Gly Lys Asp lie Lys Val Val Leu His Thr Ala Ser
[0064] ' 80 85 90 Pro Phe His Phe Asn Thr Thr Asp lie Gin Lys Asp Leu I.eu He 95 100 105 Pro Ala Val Asn Gly Thr Lys Gly He Leu Glu Scr lie Lys Lys 110 115 120 Tyr Ala Ala Gin Thr Vai Glu Arg Val Val Val Thr Ser Ser Phe 125 130 13:5 Ala Aia Asp Ser Ser Thr Val Asp Met Phe Tyr Ala Lys Asp Ser 140 145 150 Ser Lys Thr lie Thf Glu Glu Ser Trp Asn Gin Asp Thr Trp Glu 155 160 165 Ser Cys Gin Ser Asp Pro lie Arg Gly Tvr Cys Gly Ser Lys Lvs 170 175 180 Phe Ala (Mu Lys Ala Ala Trp Asp Phe Asn Ala Asn Lys Asp 185 190 195 Ser Val Lys Phe Lys Leu Ser lie 1 le Asn Pro Yal Tyr Val Phe 200 205 210 Gly Pro Gin Asn Tyr Val Glu Pro Gly Lys Lys He Leu Asn Thr 215 220 225 Ser Ser Glu Val lie Asn Ser Leu Val His Leu Lys Lys Asp Asp 23：0 235 240 Pro Leu Pro Glu Phe Ala C51y Gly His He Asp Val Arg Asp Val 24S 250 255 Ala Lys Aia His He Leu Ala Phe Gin Lys Asp Glu Leu He Glu 260 26^ 2，(； Gin Arg Leu Met Leu His Ala Gly Leu Phe Thr Thr Gin Thr Leu [0065] 。 275 280 285 Leu Asp lie lie Asn Glu C51n Phe Pro Glu Leu Lys Gly Lys lie 290 295 300 Pro Ala Gly Lys Pro Gly Thr Gly Asn Pro Asp Asp Ala Leu Thr 310 315 Pro Val Asp Asn Ser Lys Thr Lys Lys Leu Leu Gly Phe Glu Phe 320 325 330 lie Asp Leu Lys Lys Asp Leu Tyr Asp Thr lie Ser lie Leu 3:3:5 340 345 Glu Ala Glu Lys Asn Ser Asn 350
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種羰基還原酶，其特征在于，為由SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的至少第90位氨基 酸殘基經(jīng)過氨基酸替換后所形成的新氨基酸序列構(gòu)成的N-叔丁氧羰基-羰基哌啶還原活性 提高的羰基還原酶突變體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羰基還原酶，其特征在于，為由SEQ ID No.2所示氨基酸 序列的第90位絲氨酸替換為半胱氨酸、第92位苯丙氨酸替換為亮氨酸、第94位苯丙氨酸替 換為纈氨酸、第99位異亮氨酸替換為酪氨酸、第174位甘氨酸替換為丙氨酸后所形成的新氨 基酸序列構(gòu)成的羰基還原酶。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羰基還原酶，其特征在于，為由SEQ ID No.2所示氨基酸 序列的第90位絲氨酸替換為苯丙氨酸、第92位苯丙氨酸替換為亮氨酸、第99位異亮氨酸替 換為酪氨酸、第138位天冬氨酸替換為天冬酰胺、第174位甘氨酸替換為丙氨酸后所形成的 新氨基酸序列構(gòu)成的羰基還原酶。4. 一種分離的核酸，其特征在于，所述核酸是編碼如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述羰基還 原酶的核酸分子。5. -種包含如權(quán)利要求4所述核酸的重組表達(dá)質(zhì)粒。6. -種包含如權(quán)利要求5所述重組表達(dá)質(zhì)粒的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。7. -種如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述羰基還原酶的制備方法，其特征在于，所述制備 方法包括如下步驟:培養(yǎng)如權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得羰基還原 酶。8. -種如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述羰基還原酶在催化N-叔丁氧羰基-羰基氮雜環(huán)化 合物的不對稱還原，生成高光學(xué)純度的相應(yīng)(S)-構(gòu)型的N-叔丁氧羰基-羥基氮雜環(huán)化合物 中的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的N-叔丁氧羰基-羰基氮雜環(huán)化合物 的結(jié)構(gòu)如下所示：其中，I:N-Boc-3-羰基哌啶；II:N-Boc-2-羰基哌啶；III:N-Boc-3-羰基吡咯，Boc是叔 丁氧幾基的縮與。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，直接使用表達(dá)所述羰基還原酶的重組菌 株整細(xì)胞作為催化劑，催化N-叔丁氧羰基-羰基氮雜環(huán)化合物的不對稱還原，生成高光學(xué)純 度的相應(yīng)(S)-構(gòu)型的N-叔丁氧羰基-羥基氮雜環(huán)化合物。
【文檔編號(hào)】C12P17/10GK105821013SQ201610207792
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月5日
【發(fā)明人】許建和, 鄭高偉, 劉源煬, 潘江
【申請人】華東理工大學(xué)