一種凝血酶的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及酶提取領(lǐng)域，公開了一種凝血酶的提取方法，包括：a、向血液中加入抗凝劑，離心分離后取上清液得到抗凝血漿；b、將抗凝血漿經(jīng)過層析、洗脫后，制得凝血酶原溶液；c、向凝血酶溶液中添加活化劑進(jìn)行活化，制得凝血酶粗液；d、將磁性吸附微球加入到凝血酶粗液中并進(jìn)行攪拌，用磁石對(duì)磁性吸附微球進(jìn)行吸附；取出磁性吸附微球后用含氯化鈉的Tris?HCl緩沖液洗滌，再用含氯化鈉的Tris?HCl緩沖液對(duì)磁性吸附微球進(jìn)行洗脫，然后用磁石分離收集洗脫液；e、對(duì)洗脫液經(jīng)過透析脫鹽和濃縮后，最后經(jīng)過冷凍干燥制得凝血酶。本發(fā)明方法提取時(shí)間短、效率高，提取的凝血酶純度、比活高。且磁性吸附微球可重復(fù)利用，成本低。
【專利說明】
一種凝血酶的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及酶提取領(lǐng)域，尤其涉及一種凝血酶的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 凝血酶是一種專一性很強(qiáng)的絲氨酸蛋白水解酶，能水解血纖維蛋白原的四個(gè)Arg-Gly肽鍵，產(chǎn)生不溶性的血纖維蛋白，使血液變成凝膠而發(fā)生凝固。因此凝血酶作為止血?jiǎng)?廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域中。
[0003] 目前凝血酶的制備工藝，一般包括以下過程:在動(dòng)物血漿中加入抗凝劑制得抗凝 血漿，然后通過吸附洗脫、沉淀等方法制得凝血酶原，將凝血酶原激活后，制得凝血酶粗液， 將凝血酶粗液再進(jìn)一步純化，干燥后制得粉狀凝血酶。
[0004] 申請(qǐng)?zhí)枮?61036508的中國(guó)專利公開了 一種牛凝血酶的提取分離方法:把過量的 枸緣酸鈉加入牛血液中，在常規(guī)離心分離出的?？鼓獫{中加入氯化鋇溶液，用帆布過濾 出沉淀物，壓干，硫酸銨溶液洗脫、鹽析、激活，再經(jīng)CN-S印hadexC-50柱層析制得牛凝血酶。
[0005] 申請(qǐng)?zhí)枮?007101564302的中國(guó)專利公開了一種凝血酶原分離及其激活的方法， 該方法利用透析或超濾控制凝血酶原粗提液的電導(dǎo)率的方法，使凝血酶原粗提液中的雜蛋 白和凝血酶原在不同的電導(dǎo)率下發(fā)生沉淀，從而使凝血酶原和雜蛋白分離。另一方面，選用 碳酸鈣作為激活劑對(duì)凝血酶原進(jìn)行激活。
[0006] 通過上述方法雖然能夠從動(dòng)物血液中提取出凝血酶，但是提取效率較低，提取過 程中凝血酶損失較多，且制得的產(chǎn)品純度也不夠高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種凝血酶的提取方法。本發(fā)明方法提取 時(shí)間短、效率高，提取的凝血酶純度、比活高。且磁性吸附微球可重復(fù)利用，成本低。
[0008] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案為:一種凝血酶的提取方法，包括以下步驟： a、向血液中加入抗凝劑，離心分離后取上清液，制得抗凝血漿。
[0009] b、將抗凝血漿經(jīng)過陰離子層析柱層析，并用洗脫劑對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫后，制得凝 血酶原溶液。
[0010] C、向凝血酶溶液中添加活化劑進(jìn)行活化60-90min，制得凝血酶粗液。
[0011] d、將磁性吸附微球加入到凝血酶粗液中并進(jìn)行攪拌，20-40min后用磁石隔著容器 壁對(duì)磁性吸附微球進(jìn)行吸附；取出磁性吸附微球后用含0.05-0.15mol/L氯化鈉的pH值為 7.2的Tris-HCl緩沖液洗滌，再用含1.75-2.25mol/L氯化鈉的pH值為7.2的Tris-HCl緩沖液 對(duì)磁性吸附微球進(jìn)行洗脫，然后用磁石分離收集洗脫液。
[0012] e、對(duì)洗脫液經(jīng)過透析脫鹽和濃縮后，最后經(jīng)過冷凍干燥制得凝血酶。
[0013] 本發(fā)明采用磁性吸附微球?qū)δ高M(jìn)行親和吸附純化，與傳統(tǒng)層析法純化相比， 其對(duì)凝血酶的吸附量大，吸附效率高，純化度高，純化后的凝血酶比活高，且可減少洗脫液 用量，磁性吸附微球可回收利用，大大降低了成本。
[0014] 作為優(yōu)選，步驟a中所述抗凝劑為4_5wt%的檸檬酸鈉溶液，且抗凝劑的添加量為 血液體積的4-6%。
[0015] 作為優(yōu)選，步驟b中所述洗脫劑為pH值為6-8的檸檬酸鈉溶液。
[0016] 作為優(yōu)選，步驟c中所述活化劑為氯化鈣溶液，所述活化劑添加后鈣離子的濃度為 0?2-0?25mol/L。
[0017] 作為優(yōu)選，在步驟c制得凝血酶粗液后，在進(jìn)行步驟d之前，凝血酶粗液還經(jīng)過泡沫 純化處理:將凝血酶粗液轉(zhuǎn)移至泡沫分離柱中，對(duì)泡沫分離柱的底部進(jìn)行鼓氣，其中，泡沫 分離柱的內(nèi)徑為8-10mm，凝血酶粗液的裝載高度為40-60cm，鼓氣速率為1.5-2.5L/min，凝 血酶粗液溫度為30-40°C ;鼓氣后在泡沫分離柱頂部收集泡沫液，并對(duì)泡沫液加熱滅泡。
[0018] 本發(fā)明在步驟c中制得凝血酶粗液后，對(duì)其進(jìn)行泡沫純化處理，泡沫純化法方法簡(jiǎn) 單，無污染、時(shí)間短，成本低。其依據(jù)表面吸附原理，對(duì)液體進(jìn)行鼓泡后，泡沫分離柱頂部鼓 出泡沫，以泡沫為載體，凝血酶聚集在氣液界面(即泡沫表面)上，而其他物質(zhì)非蛋白物質(zhì)以 及部分雜蛋白物質(zhì)仍舊存留在液體中，分離收集泡沫液實(shí)現(xiàn)分離，滅泡后即得到純化后的 凝血酶。再經(jīng)過后續(xù)的純化后，制得的凝血酶純度更高，比活更高。
[0019] 作為優(yōu)選，凝血酶粗液在轉(zhuǎn)移至泡沫分離柱前，向凝血酶粗液中添加凝血酶粗液 質(zhì)量1-3%的環(huán)糊精并攪拌均勻。
[0020] 雖然泡沫純化法具有許多優(yōu)點(diǎn)，但是對(duì)于凝血酶粗液而言，由于其自身的乳化、氣 泡性能較差，會(huì)造成泡沫純化過程中的氣泡效率低下，純化時(shí)間長(zhǎng)，純化效果降低。如果添 加普通的乳化劑又會(huì)帶來更多雜質(zhì)，從而影響純化度。環(huán)糊精的內(nèi)部具有疏水空腔，而其 表面具有親水端基，在泡沫純化前與凝血酶粗液混合并與凝血酶復(fù)合后，能夠增加液體的 乳化活性，使得液體的起泡性能增加，從而增加回收率。并且在后續(xù)過程中，環(huán)糊精與凝 血酶容易洗脫分離，對(duì)純度的影響較小。
[0021] 作為優(yōu)選，步驟d中所述磁性吸附微球的粒徑為20-60微米，包括四氧化三鐵磁粉、 包裹于磁粉外表面的復(fù)合材料以及與復(fù)合材料偶聯(lián)的配基。
[0022]在上述磁性吸附微球，四氧化三鐵作為磁核，復(fù)合材料作為吸附載體，而配基能夠 增加與凝血酶的親和性，提高凝血酶的收率。
[0023]作為優(yōu)選，所述磁性吸附微球的制備方法為:將環(huán)糊精、殼聚糖溶解于5_7wt% 的乙酸溶液中，制得混合溶液，其中環(huán)糊精的濃度為l_2wt%，殼聚糖的濃度為2_4wt% ; 向混合溶液中添加環(huán)糊精和殼聚糖總質(zhì)量0.6-1.0倍的四氧化三鐵磁粉，在超聲波分散 條件下繼續(xù)向混合溶液中逐漸滴加混合溶液體積〇. 5-1倍的乳化液;混合溶液充分乳化后， 繼續(xù)添加乳化后混合溶液體積1-3%的6-lOwt%戊二醛溶液并攪拌均勻，然后用磁石隔著 容器壁對(duì)磁粉進(jìn)行吸附，去除上清液，取固體物質(zhì)并洗凈后制得磁性微球;將磁性微球浸沒 于水中溶脹5-10min后取出，按固液比0.75-0.1.25g/mL將磁性微球加入到活化液中，在40-50°C活化0.5-1.5h，取出磁性微球并洗凈;將肝素與磁性微球按質(zhì)量比0.4-0.5:1混合制得 懸浮液，將懸浮液pH值調(diào)節(jié)至4-5，添加懸浮液體積2-3倍的3wt %的1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亞胺，在4°C下靜置10_14h，取出磁性微球并洗凈后、干燥后，制得磁性吸附微球。
[0024]本發(fā)明方法制得的磁性吸附微球，以四氧化三鐵為磁核，以環(huán)糊精和殼聚糖的 復(fù)合材料包裹磁核，在復(fù)合材料商偶聯(lián)上對(duì)凝血酶具有親和性的肝素，制得的磁性吸附微 球，對(duì)凝血酶的特異性吸附效果好，吸附量大，吸附效果高;且純化方法簡(jiǎn)單，可重復(fù)利用， 降低成本。其中，以環(huán)糊精和殼聚糖的復(fù)合材料作為載體，不僅提高了磁性吸附微球的吸 附容量，而且在前序的泡沫純化步驟中，環(huán)糊精與凝血酶復(fù)合后，由于也含有環(huán)糊精， 因此其對(duì)凝血酶的親和性進(jìn)一步增強(qiáng)，使得吸附效率、純化效果更好。
[0025] 作為優(yōu)選，所述乳化液由等體積的吐溫-60和無水乙醇組成;所述活化液由lmol/L 的氫氧化鈉溶液、二甲基亞砜和環(huán)氧氯丙烷按體積比6-8:1:0.6-0.8組成。
[0026]作為優(yōu)選，步驟d中，所述磁性吸附微球的質(zhì)量為凝血酶粗液的0.25-1%。
[0027] 與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明方法提取時(shí)間短、效率高，提取的 凝血酶純度、比活高。且磁性吸附微球可重復(fù)利用，成本低。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0029] 實(shí)施例1 一種凝血酶的提取方法，包括以下步驟： a、取豬新鮮血液，向血液中加入4.5wt %的檸檬酸鈉溶液，檸檬酸鈉溶液的體積為血液 體積的5%，離心分離后取上清液，制得抗凝血漿。
[0030] b、將抗凝血漿經(jīng)過陰離子層析柱層析，并用pH值為7左右的檸檬酸鈉溶液對(duì)層析 柱進(jìn)行洗脫后，制得凝血酶原溶液。
[0031] c、向凝血酶溶液中添加氯化鈣溶液，進(jìn)行活化75min，添加后鈣離子的濃度為 0.225mol/L，活化后制得凝血酶粗液。
[0032]向凝血酶粗液中添加凝血酶粗液質(zhì)量2%的環(huán)糊精并攪拌均勻。將凝血酶粗液 轉(zhuǎn)移至泡沫分離柱中，對(duì)泡沫分離柱的底部進(jìn)行鼓氣，其中，泡沫分離柱的內(nèi)徑為9mm，凝血 酶粗液的裝載高度為50cm，鼓氣速率為2L/min，凝血酶粗液溫度為35°C ;鼓氣后在泡沫分離 柱頂部收集泡沫液，并對(duì)泡沫液加熱至55°C滅泡，制得純化后的凝血酶粗液。
[0033] d、磁性吸附微球的制備:將環(huán)糊精、殼聚糖溶解于6wt %的乙酸溶液中，制得混 合溶液，其中環(huán)糊精的濃度為1.5wt%，殼聚糖的濃度為3wt% ;向混合溶液中添加環(huán)糊 精和殼聚糖總質(zhì)量0.8倍的四氧化三鐵磁粉，在超聲波分散條件下繼續(xù)向混合溶液中逐漸 滴加混合溶液體積0.75倍的乳化液;所述乳化液由等體積的吐溫-60和無水乙醇組成?；旌?溶液充分乳化后，繼續(xù)添加乳化后混合溶液體積2%的8wt%戊二醛溶液并攪拌均勻，然后 用磁石隔著容器壁對(duì)磁粉進(jìn)行吸附，去除上清液，取固體物質(zhì)并洗凈后制得磁性微球;將磁 性微球浸沒于水中溶脹7.5min后取出，按固液比lg/mL將磁性微球加入到活化液中，所述活 化液由lmol/L的氫氧化鈉溶液、二甲基亞砜和環(huán)氧氯丙烷按體積比7:1:0.7組成。在45°C活 化lh，取出磁性微球并洗凈;將肝素與磁性微球按質(zhì)量比0.45:1混合制得懸浮液，將懸浮液 pH值調(diào)節(jié)至4.5左右，添加懸浮液體積2.5倍的3wt%的1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亞胺，在 4°C下靜置12h，取出磁性微球并洗凈后、干燥后，制得粒徑為20-60微米的磁性吸附微球。
[0034]將磁性吸附微球加入到純化后的凝血酶粗液中并進(jìn)行攪拌，所述磁性吸附微球的 質(zhì)量為凝血酶粗液的0.65 %。攪拌30min后用磁石隔著容器壁對(duì)磁性吸附微球進(jìn)行吸附；取 出磁性吸附微球后用含0. lmol/L氯化鈉的pH值為7.2的Tris-HCl緩沖液洗滌，再用含2mol/ L氯化鈉的pH值為7.2的Tris-HCl緩沖液對(duì)磁性吸附微球進(jìn)行洗脫，然后用磁石分離收集洗 脫液，并將此洗脫液標(biāo)記為A1。
[0035] e、對(duì)洗脫液經(jīng)過常規(guī)方法的透析脫鹽和濃縮后，最后經(jīng)過冷凍干燥制得凝血酶。
[0036] 實(shí)施例2 一種凝血酶的提取方法，包括以下步驟： a、取豬新鮮血液，向血液中加入4wt %的檸檬酸鈉溶液，檸檬酸鈉溶液的體積為血液體 積的4%，離心分離后取上清液，制得抗凝血漿。
[0037] b、將抗凝血漿經(jīng)過陰離子層析柱層析，并用pH值為6左右的檸檬酸鈉溶液對(duì)層析 柱進(jìn)行洗脫后，制得凝血酶原溶液。
[0038] c、向凝血酶溶液中添加氯化鈣溶液，進(jìn)行活化60min，添加后鈣離子的濃度為 0.2mol/L，活化后制得凝血酶粗液。
[0039] 向凝血酶粗液中添加凝血酶粗液質(zhì)量1 %的環(huán)糊精并攪拌均勻。將凝血酶粗液 轉(zhuǎn)移至泡沫分離柱中，對(duì)泡沫分離柱的底部進(jìn)行鼓氣，其中，泡沫分離柱的內(nèi)徑為8mm，凝血 酶粗液的裝載高度為60cm，鼓氣速率為1.5L/min，凝血酶粗液溫度為40 °C;鼓氣后在泡沫分 離柱頂部收集泡沫液，并對(duì)泡沫液加熱至50°C滅泡，制得純化后的凝血酶粗液。
[0040] d、磁性吸附微球的制備:將e-環(huán)糊精、殼聚糖溶解于5wt %的乙酸溶液中，制得混 合溶液，其中環(huán)糊精的濃度為lwt%，殼聚糖的濃度為向混合溶液中添加環(huán)糊精 和殼聚糖總質(zhì)量0.6倍的四氧化三鐵磁粉，在超聲波分散條件下繼續(xù)向混合溶液中逐漸滴 加混合溶液體積0.5倍的乳化液;所述乳化液由等體積的吐溫-60和無水乙醇組成?；旌先?液充分乳化后，繼續(xù)添加乳化后混合溶液體積1%的l〇wt%戊二醛溶液并攪拌均勻，然后用 磁石隔著容器壁對(duì)磁粉進(jìn)行吸附，去除上清液，取固體物質(zhì)并洗凈后制得磁性微球;將磁性 微球浸沒于水中溶脹5min后取出，按固液比0.75g/mL將磁性微球加入到活化液中，所述活 化液由lmol/L的氫氧化鈉溶液、二甲基亞砜和環(huán)氧氯丙烷按體積比6:1:0.6組成。在40°C活 化1.5h，取出磁性微球并洗凈;將肝素與磁性微球按質(zhì)量比0.4:1混合制得懸浮液，將懸浮 液pH值調(diào)節(jié)至4左右，添加懸浮液體積2倍的3wt %的1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亞胺，在4 °C下靜置10h，取出磁性微球并洗凈后、干燥后，制得粒徑為20-60微米的磁性吸附微球。
[0041] 將磁性吸附微球加入到純化后的凝血酶粗液中并進(jìn)行攪拌，所述磁性吸附微球的 質(zhì)量為凝血酶粗液的0.25 %。攪拌20min后用磁石隔著容器壁對(duì)磁性吸附微球進(jìn)行吸附；取 出磁性吸附微球后用含0.0 5 m 〇 1 / L氯化鈉的p H值為7.2的T r i s - H C1緩沖液洗滌，再用含 1.75mol/L氯化鈉的pH值為7.2的Tris-HCl緩沖液對(duì)磁性吸附微球進(jìn)行洗脫，然后用磁石分 離收集洗脫液，并將此洗脫液標(biāo)記為A2。
[0042] e、對(duì)洗脫液經(jīng)過常規(guī)方法的透析脫鹽和濃縮后，最后經(jīng)過冷凍干燥制得凝血酶。 [0043] 實(shí)施例3 一種凝血酶的提取方法，包括以下步驟： a、取豬新鮮血液，向血液中加入5wt %的檸檬酸鈉溶液，檸檬酸鈉溶液的體積為血液體 積的6%，離心分離后取上清液，制得抗凝血漿。
[0044] b、將抗凝血漿經(jīng)過陰離子層析柱層析，并用pH值為8左右的檸檬酸鈉溶液對(duì)層析 柱進(jìn)行洗脫后，制得凝血酶原溶液。
[0045] c、向凝血酶溶液中添加氯化鈣溶液，進(jìn)行活化9 0 m i n，添加后鈣離子的濃度為 0.25mol/L，活化后制得凝血酶粗液。
[0046] 向凝血酶粗液中添加凝血酶粗液質(zhì)量3%的環(huán)糊精并攪拌均勻。將凝血酶粗液 轉(zhuǎn)移至泡沫分離柱中，對(duì)泡沫分離柱的底部進(jìn)行鼓氣，其中，泡沫分離柱的內(nèi)徑為10mm，凝 血酶粗液的裝載高度為40cm，鼓氣速率為2.5L/min，凝血酶粗液溫度為30°C ;鼓氣后在泡沫 分離柱頂部收集泡沫液，并對(duì)泡沫液加熱至60°C滅泡，制得純化后的凝血酶粗液。
[0047] d、磁性吸附微球的制備:將環(huán)糊精、殼聚糖溶解于7wt %的乙酸溶液中，制得混 合溶液，其中環(huán)糊精的濃度為2wt%，殼聚糖的濃度為向混合溶液中添加環(huán)糊精 和殼聚糖總質(zhì)量1.0倍的四氧化三鐵磁粉，在超聲波分散條件下繼續(xù)向混合溶液中逐漸滴 加混合溶液體積1倍的乳化液;所述乳化液由等體積的吐溫-60和無水乙醇組成?；旌先芤?充分乳化后，繼續(xù)添加乳化后混合溶液體積3%的6wt%戊二醛溶液并攪拌均勻，然后用磁 石隔著容器壁對(duì)磁粉進(jìn)行吸附，去除上清液，取固體物質(zhì)并洗凈后制得磁性微球;將磁性微 球浸沒于水中溶脹l〇min后取出，按固液比0.1.25g/mL將磁性微球加入到活化液中，所述活 化液由lmol/L的氫氧化鈉溶液、二甲基亞砜和環(huán)氧氯丙烷按體積比8:1:0.8組成。在50°C活 化0.5h，取出磁性微球并洗凈;將肝素與磁性微球按質(zhì)量比0.5:1混合制得懸浮液，將懸浮 液pH值調(diào)節(jié)至5左右，添加懸浮液體積3倍的3wt %的1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亞胺，在4 °C下靜置14h，取出磁性微球并洗凈后、干燥后，制得粒徑為20-60微米的磁性吸附微球。 [0048]將磁性吸附微球加入到純化后的凝血酶粗液中并進(jìn)行攪拌，所述磁性吸附微球的 質(zhì)量為凝血酶粗液的1 %。攪拌40min后用磁石隔著容器壁對(duì)磁性吸附微球進(jìn)行吸附；取出 磁性吸附微球后用含〇.15mol/L氯化鈉的pH值為7.2的Tris-HCl緩沖液洗滌，再用含 2.25mol/L氯化鈉的pH值為7.2的Tris-HCl緩沖液對(duì)磁性吸附微球進(jìn)行洗脫，然后用磁石分 離收集洗脫液，并將此洗脫液標(biāo)記為A3。
[0049] e、對(duì)洗脫液經(jīng)過常規(guī)方法的透析脫鹽和濃縮后，最后經(jīng)過冷凍干燥制得凝血酶。
[0050] 實(shí)施例4 實(shí)施例4與實(shí)施例1的不同之處在于，實(shí)施例4的步驟c中，凝血酶粗液在泡沫純化前不 添加環(huán)糊精。其中，對(duì)實(shí)施例4中步驟e之前得到的洗脫液標(biāo)記為A4。
[0051 ] 實(shí)施例5 實(shí)施例5與實(shí)施例1的不同之處在于，實(shí)施例5的步驟c中，凝血酶粗液不經(jīng)過泡沫純化。 其中，對(duì)實(shí)施例5中步驟e之前得到的洗脫液標(biāo)記為A5。
[0052]按照《中國(guó)藥典》2010版二部中有關(guān)凝血酶效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)檢測(cè)方法對(duì)實(shí)施例1-5中的 A1-5進(jìn)行凝血酶效價(jià)檢測(cè);按照《中國(guó)藥典》2010版二部附錄VII M的蛋白質(zhì)含量測(cè)定法中 福林酚法對(duì)實(shí)施例1-5中國(guó)的A1-5進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。測(cè)試結(jié)果如下表所示。
[0053]本發(fā)明中所用原料、設(shè)備，若無特別說明，均為本領(lǐng)域的常用原料、設(shè)備;本發(fā)明中 所用方法，若無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0054]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明作任何限制，凡是根據(jù)本發(fā)明 技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、變更以及等效變換，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方 案的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種凝血酶的提取方法，其特征在于包括以下步驟： a、 向血液中加入抗凝劑，離心分離后取上清液，制得抗凝血漿； b、 將抗凝血漿經(jīng)過陰離子層析柱層析，并用洗脫劑對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫后，制得凝血酶 原溶液； c、 向凝血酶溶液中添加活化劑進(jìn)行活化60-90min，制得凝血酶粗液； d、 將磁性吸附微球加入到凝血酶粗液中并進(jìn)行攪拌，20-40min后用磁石隔著容器壁對(duì) 磁性吸附微球進(jìn)行吸附；取出磁性吸附微球后用含0.05-0.15mol/L氯化鈉的pH值為7.2的 Tris-HCl緩沖液洗滌，再用含1.75-2.25 mol/L氯化鈉的pH值為7.2的Tris-HCl緩沖液對(duì)磁 性吸附微球進(jìn)行洗脫，然后用磁石分離收集洗脫液； e、 對(duì)洗脫液經(jīng)過透析脫鹽和濃縮后，最后經(jīng)過冷凍干燥制得凝血酶。2. 如權(quán)利要求1所述的一種凝血酶的提取方法，其特征在于，步驟a中所述抗凝劑為4-5wt%的檸檬酸鈉溶液，且抗凝劑的添加量為血液體積的4-6%。3. 如權(quán)利要求1所述的一種凝血酶的提取方法，其特征在于，步驟b中所述洗脫劑為pH 值為6-8的檸檬酸鈉溶液。4. 如權(quán)利要求1所述的一種凝血酶的提取方法，其特征在于，步驟c中所述活化劑為氯 化鈣溶液，所述活化劑添加后鈣離子的濃度為0.2-0.25mol/L。5. 如權(quán)利要求1所述的一種凝血酶的提取方法，其特征在于，在步驟c制得凝血酶粗液 后，在進(jìn)行步驟d之前，凝血酶粗液還經(jīng)過泡沫純化處理:將凝血酶粗液轉(zhuǎn)移至泡沫分離柱 中，對(duì)泡沫分離柱的底部進(jìn)行鼓氣，其中，泡沫分離柱的內(nèi)徑為8-10mm，凝血酶粗液的裝載 高度為40-60cm，鼓氣速率為1.5-2.5L/min，凝血酶粗液溫度為30-40°C ;鼓氣后在泡沫分離 柱頂部收集泡沫液，并對(duì)泡沫液加熱滅泡。6. 如權(quán)利要求5所述的一種凝血酶的提取方法，其特征在于，凝血酶粗液在轉(zhuǎn)移至泡沫 分離柱前，向凝血酶粗液中添加凝血酶粗液質(zhì)量1-3%的β-環(huán)糊精并攪拌均勻。7. 如權(quán)利要求1所述的一種凝血酶的提取方法，其特征在于，步驟d中所述磁性吸附微 球的粒徑為20-60微米，包括四氧化三鐵磁粉、包裹于磁粉外表面的復(fù)合材料以及與復(fù)合材 料偶聯(lián)的配基。8. 如權(quán)利要求7所述的一種凝血酶的提取方法，其特征在于，所述磁性吸附微球的制備 方法為:將β-環(huán)糊精、殼聚糖溶解于5-7wt%的乙酸溶液中，制得混合溶液，其中β-環(huán)糊精的 濃度為l_2wt%，殼聚糖的濃度為2-4wt%;向混合溶液中添加 β-環(huán)糊精和殼聚糖總質(zhì)量0.6-1.0倍的四氧化三鐵磁粉，在超聲波分散條件下繼續(xù)向混合溶液中逐漸滴加混合溶液體積 〇. 5-1倍的乳化液;混合溶液充分乳化后，繼續(xù)添加乳化后混合溶液體積1-3%的6-lOwt%戊 二醛溶液并攪拌均勻，然后用磁石隔著容器壁對(duì)磁粉進(jìn)行吸附，去除上清液，取固體物質(zhì)并 洗凈后制得磁性微球；將磁性微球浸沒于水中溶脹5-10min后取出，按固液比0.75_ 0.1.25g/mL將磁性微球加入到活化液中，在40-50°C活化0.5-1.5h，取出磁性微球并洗凈； 將肝素與磁性微球按質(zhì)量比〇. 4-0.5:1混合制得懸浮液，將懸浮液pH值調(diào)節(jié)至4-5，添加懸 浮液體積2-3倍的3wt%的1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亞胺，在4°C下靜置10_14h，取出磁性 微球并洗凈后、干燥后，制得磁性吸附微球。9. 如權(quán)利要求1或8所述的一種凝血酶的提取方法，其特征在于，所述乳化液由等體積 的吐溫-60和無水乙醇組成;所述活化液由lmol/L的氫氧化鈉溶液、二甲基亞砜和環(huán)氧氯丙 烷按體積比6-8:1:0.6-0.8組成。10.如權(quán)利要求1或8所述的一種凝血酶的提取方法，其特征在于，步驟d中，所述磁性吸 附微球的質(zhì)量為凝血酶粗液的〇. 25-1%。
【文檔編號(hào)】C12N9/74GK105821025SQ201610214486
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年4月6日
【發(fā)明人】柯祖敏, 泮立珽, 吳方策
【申請(qǐng)人】浙江豐安生物制藥有限公司