一種酯酶及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及獲得的一種酯酶基因及其克隆表達(dá)與應(yīng)用，屬于生物工程領(lǐng)域。公開了其底物特性。該酯酶具有廣泛的作用，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值。
【專利說明】
一種酯酶及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明克隆表達(dá)了一種酯酶，并公開了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶學(xué)性質(zhì)和 應(yīng)用，屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿魏酸酯酶(Feruloyl esterases，F(xiàn)AEs)又稱肉桂酸酯酶，它是一種羧酸酯酶，是 能水解阿魏酸甲酯、低聚糖酯酶和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，釋放游離阿魏酸的酶。它能切斷 細(xì)胞壁中多糖-多糖、多糖-木質(zhì)素間的交聯(lián)，有利于細(xì)胞壁物質(zhì)中多糖的降解和木質(zhì)素的 釋放，因此在食品、飼料和造紙工業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。在食品工業(yè)中，利用酯酶來降解 植物細(xì)胞壁中的阿魏酸酯鍵，可以得到有藥用價值和保健功能的游離阿魏酸。而植物性原 材料通過酯酶的處理細(xì)胞壁變得疏松，作為飼料工業(yè)的原料更容易被禽畜消化利用，作為 制漿造紙工業(yè)的原料可以減少制漿工序化化學(xué)藥品的使用，減少污染，并有利于后續(xù)工序 的進(jìn)行。
[0003] 1987年，阿魏酸酯酶在Streptomyces 〇1 ivochromogenes中被第一次發(fā)現(xiàn)。研究表 明真菌、細(xì)菌、酵母都能分泌阿魏酸酯酶，目前發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)酶微生物有黑曲霉(Aaspergillus niger)，鏈霉菌（Streptomyces avermitilis)，梭菌（Clostridium thermocellum)，乳酉愛桿 菌(Lactobacilli sp.)，假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)等，但絕大多數(shù)酯酶是從真 菌中分離出來。近年來有研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳酸桿菌(Lactobacillus fermentum)有較強的阿 酉愛酯酉每活性（Detection of ferulic acid esterase production by Bacillus spp.and lactobacilli.Applied Microbiology and Biotechnology,1998,50(2):257-260.Lactobacillus fermentum NCIMB 5221has a greater ferulic acid production compared to other ferulic acid esterase producing lactobacil1i?2012，1(7)， 1555-1431)。在國內(nèi)，吳希陽等人篩選了一株產(chǎn)阿魏酸酯酶的發(fā)酵乳桿菌(產(chǎn)阿魏酸酯酶乳 酸菌的乳桿菌篩選以及基因克隆[J].食品工業(yè)科技，2013，34(20): 199-203)，但文中僅提 到采用鳥槍法克隆了一個基因，并無相關(guān)基因或相應(yīng)蛋白的序列信息。
[0004] 通過對發(fā)酵乳酸桿菌的特性研究，本專利公開了一種新型的發(fā)酵乳酸桿菌酯酶的 基因及其氨基酸序列信息。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明從發(fā)酵乳酸桿菌中克隆得到了一個新型的酯酶基因，利用大腸桿菌工程菌 異源表達(dá)，公開了其相關(guān)的酶學(xué)特性。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] 1、菌株
[0008] 本發(fā)明酯酶基因的來源菌株為：Lactobacillus fermentum ATCC 14931，購自美 國ATCC菌種庫
[0009] 2、酯酶基因的克隆
[0010] 提取Lactobacillus fermentum ATCC 14931菌體基因組總DNA。設(shè)計特異性引物， 應(yīng)用PCR方法，擴增出酯酶基因全長編碼框序列。并構(gòu)建重組質(zhì)粒。
[0011] 3、酯酶表達(dá)與純化
[0012] 將重組質(zhì)粒導(dǎo)入BL21大腸桿菌中，誘導(dǎo)表達(dá)。菌體破碎后得到粗酶液，再純化后冷 凍干燥備用。
[0013] 4、酯酶酶學(xué)性質(zhì)
[0014] 以阿魏酸甲酯為底物研究pH對本發(fā)明所述酯酶酶活的影響。
[0015] 以阿魏酸甲酯為底物研究溫度對本發(fā)明所述酯酶酶活的影響。
[0016] 以阿魏酸甲酯為底物測定了 ？63+、1(+、0&2+、〇1 2+、1^2+1112+、2112+、(1等離子對酶活的 影響。
[0017] 酯酶的底物特性分析:所用的底物有己酸乙酯、葵酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、乙 酸乙酯、乙烯葵酸酯、巴豆酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、三甲基乙酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯、甲 基丙烯酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、正丁酸乙烯酯、乙酸乙烯酯、甘油三丁酯、y-戊內(nèi)酯、乙酸丁 酯、三-0-乙?；?D葡萄烯糖、三乙酸甘油酯、a_D( + )五乙酰葡萄糖、乙酸香葉酯、乙酸正丙 酯、乙酸異丙烯酯、乳酸甲酯、二氫茉莉酮酸甲酯、辛酸甲酯、己酸甲酯、2-溴丙酸甲酯、溴乙 酸甲酯、甲基(R)-(-)-扁桃酸、溴苯乙酸甲酯、肉桂酸卞酯、乙酸-2-萘酯、丙酸萘酯、乙酸苯 酯、丁酸萘基酯、4-硝基苯基辛酸酯、乙酸-1-萘酯、2,6_二羥基-4-甲基苯甲酸甲酯、萘酚丙 酸酯、甲基扁桃酸酯、阿魏酸乙酯、阿魏酸甲酯、綠原酸、迷迭香酸、咖啡酸乙酯、咖啡酸苯乙 酯、對羥基肉桂酸甲酯。
[0018] 酶活測定方法為:4ml反應(yīng)體系，包含3ml磷酸緩沖液(0.02mol ? L-l，pH 6.0)，lml 底物溶液(4mg/ml底物），5ug冷凍干燥的酶，35°C反應(yīng)30分鐘，高溫100°C加熱3分鐘終止反 應(yīng)。用高效液相色譜檢測底物減少量，高效液相色譜檢測條件為:〇-15min 10-100%乙腈， 90-0 % 水（0 ? 1 % 甲酸）線性洗脫；15-20min 100 % 乙腈，0水；20-30min 10 % 乙腈，90 % 水 (0.1%甲酸），檢測器為Alltech 3300型蒸發(fā)光散射檢測器。溫度、pH、離子、底物的影響均 采用該體系。
[0019] 5.以去淀粉麩皮為原料，添加該酯酶后的阿魏酸釋放率分析。
[0020] 去淀粉麩皮按照文獻(xiàn)的方法制備（Xylan-hydrolysing enzymes from Streptomyces spp.Enzyme and Microbial Technology, 1988,10(7) :403_409.)。鼓皮中 阿魏酸的總量以堿法提取得到的阿魏酸計算（Preparation of ferulic acid from agricultural wastes:Its improved extraction and purification.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008,56(17):7644-7648.)cJSJ魏酸釋放率為阿魏酸 的酶解釋放量占堿提取的阿魏酸總量的百分率
【具體實施方式】
[0021] 實施例1
[0022] 本實施例為本發(fā)明所述酯酶基因的克隆與轉(zhuǎn)化。
[0023] l、Lactobacillus fermentum ATCC 14931DNA的提取
[0024] 將Lactobacillus fermentum ATCC 14931 菌株在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng) 12小時， 12000r/min離心10分鐘得到菌體，應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(TaKaRa公司）按照其操 作提取Lactobacillus fermentum ATCC 14931菌體基因組總DNA，放冰箱備用。
[0025] 2、大腸桿菌感受態(tài)制備
[0026] (1)接種E.coli DH5a和BL21(DE3)分別于含有20mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，37 °C、200rpm/min培養(yǎng)過夜。
[0027] (2)按1%接種量接種于50mL LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D600約0.6(約2~3h)。
[0028] (3)將菌液轉(zhuǎn)移到50mL預(yù)冷的離心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4°C離心 5min〇
[0029] (4)棄上清，加入5mL預(yù)冷的0.1mol/L CaC12溶液，使菌體懸浮，冰上放置20min， 8000rpm/min、4°C 離心 5min。重復(fù) 2次。
[0030] (5)棄上清，加入1 ? 5mL預(yù)冷的0 ? lmol/LCaC12溶液，含有15%的甘油，輕輕懸浮菌 體，然后1〇〇此分裝到1.5mL離心管中，-70°C冰箱保藏備用。
[0031] 3、酯酶基因的克隆 [0032] (1)引物設(shè)計
[0033]分析NCBI數(shù)據(jù)庫中相關(guān)發(fā)酵乳酸桿菌的全基因組序列和已知的發(fā)酵乳酸桿菌酯 酶基因，設(shè)計引物序列為：
[0034] 上游引物F:5，GCCGCATATGATGGAAGTTGCAATCAAGAG 3，
[0035] 下游引物R:5，GCCGTCTAGATTAGITTAAGAAATCGGCC 3，
[0036] (2)PCR 擴增
[0037] 用以上合成的兩條引物，以Lactobacillus fermentum ATCC 14931的全基因組 DNA為模板進(jìn)行PCR擴增。
[0038]本步驟中擴增體系為： PrimeSTARHS DNA Polymerase (2.55U/uL) 0.5uL l〇x Prime STAR Buffer ' 10tuL dNTP Mixture(2.5mM each) 4uL
[0039] .極板 DNA 1|^L 引物 1 (20pM) lfiL 引物 2(20|iM): l^L ddH20 補足到 50jiL
[0040] 擴增程序為：
[0041 ] 94°C，5min
[0042] 94°C，30sec; 55°C，30sec; 72°C lmin反應(yīng)30個循環(huán)
[0043] 72〇Ca〇min
[0044] (3)雙酶切和連接
[0045] 將pCold- II質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切體系為：10 X Qcut buff er5ul，DNA片 段10ul，NdeI和Xbal各0.5ul，無菌水34ul共5〇111。37°(：水浴中切l(wèi)h。將DNA片段克隆到pCold IlVector上，并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中。連接體系：l〇XT41igase buffer 2.5ul，DNA片段8ul，載體DNA 2ul，T4DNA ligase lul，無菌水 11.5ul共25111。16°(：水浴下連 接12h-16h。
[0046] (4)轉(zhuǎn)化
[0047]步驟：
[0048] 1在連接體系中加入100yl DH5a感受態(tài)細(xì)菌，輕混勻，冰浴30min。
[0049] 2放入預(yù)熱的42°C水浴中，放置90s進(jìn)行熱休克處理。
[0050] 3立即冰浴2min。
[00511 4加入lml不含抗生素的LB培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)lh使菌復(fù)蘇。
[0052] 5均勻的涂布在含抗生素的LB培養(yǎng)基上。
[0053] 6培養(yǎng)24h長勢良好。挑單菌落進(jìn)行菌落PCR，核酸電泳驗證，提取重組質(zhì)粒。將重組 質(zhì)粒導(dǎo)入BL21大腸桿菌感受態(tài)中，保存?zhèn)溆谩?br>[0054] 實施例2
[0055]本實施例為本發(fā)明所述酯酶的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化。
[0056] 1、誘導(dǎo)表達(dá)
[0057] a:加500ul重組菌(BL21大腸桿菌)液到50ml LLB搖瓶中；37°C，200rpm培養(yǎng)2-3h， 0D值達(dá)0.6時，15 °C下靜置0.5h。再加20ul IPTG，15 °C，200rpm下冷誘導(dǎo)培養(yǎng)24h。
[0058] b:將發(fā)酵得到發(fā)酵液離心(4°C，8000rpmX lOmin)收集菌體，磷酸氫二鈉-磷酸二 氫鈉緩沖溶液(20mmol/L，pH7.0)復(fù)溶菌體，超聲破碎儀破碎，4°C，lOOOOrpmX lOmin離心收 集上清，獲取粗酶液。
[0059] 2、將步驟1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白純化系統(tǒng)操作進(jìn)行鎳柱純化， 洗脫方法為:將41)2、131、132四根管路都放進(jìn)水里，設(shè)置878丨6111；^〇￥2〇1111/111；[11流速，進(jìn)行 排氣。然后設(shè)置system flow lml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre_pressure 0.5、Gradient 0、inset Al，待水滴均勾流出后裝柱子，平衡十分鐘之 后把A1放進(jìn)結(jié)合液中，B1放進(jìn)洗脫液中，再進(jìn)行排氣一次，平衡二十分鐘，然后上樣粗酶液， 用500mM的高濃度咪唑緩沖液B1梯度洗脫目的蛋白，將吸附在離子柱上的蛋白洗脫下來，收 集有酶活的洗脫液用超濾管(30-kDa)進(jìn)行濃縮，得到純化的酶。純化后的酶經(jīng)冷凍干燥備 用。
[0060] 實施例3
[0061] 本實施例為本發(fā)明所述酯酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性。如表1所示，以阿魏酸甲酯 為底物，將底物與pH為6.5的磷酸緩沖液在25-65°C不同的溫度條件下水浴2h測定酯酶的酶 活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶的最適溫度為45°C。將本發(fā)明所述的酯酶置于25°C、35°C、50°C與60°C下分 別處理2h、4h、6h、8h、12h測定相對酶活，結(jié)果表明在25°C、35°C條件下所述酯酶酶活基本沒 有損失，但當(dāng)溫度達(dá)到50°C時，2小時后剩余酶活僅為開始時的15%左右。
[0062] 表1溫度對酯酶酶活的影響
50 96 55 76
[0064] 60 39 65 37
[0065] 實施例4
[0066] 本實施例為本發(fā)明所述酯酶的最適pH值及pH穩(wěn)定性。如表2所示，以阿魏酸甲酯為 底物研究pH對本發(fā)明所述酯酶最適反應(yīng)pH為7。以阿魏酸甲酯為底物研究pH對本發(fā)明所述 酯酶穩(wěn)定性的影響，將酯酶分別置于pH值為3-9的緩沖液中處理1小時測定剩余酶活發(fā)現(xiàn)pH 值在6-9時酶活比較穩(wěn)定，pH低于5時剩余酶活不足起始的20%。
[0067] 表2為pH對酯酶酶活的影響
[0069] 實施例5
[0070] 本實施例為不同金屬離子對酯酶酶活的影響。將實施例中純化得到的酶置于濃度 為5mM的不同金屬離子的溶液中，30分鐘后測定其剩余酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fe 3+、Cu2+、Mn2+離子作 用30分鐘后，酶活損失較大，剩余酶活分別為80%，70%，45%，k+對酶活有一定的促進(jìn)作 用，其它離子影響不大。結(jié)果如表3所不。
[0071] 表3金屬離子對酶活性的影響
[0073] 實施例6
[0074] 本實施例為酯酶與不同底物的反應(yīng)特性，列于表4中。由表4可以看出，該酯酶具有 廣泛的底物，對于芳香族酯類表現(xiàn)出了很強的活力，屬于阿魏酸酯酶。
[0075]表4酯酶對不同底物的活性
乙酸乙烯酯 447: 甘油三丁酯 388 T-戊內(nèi)酯 676 乙酸丁酯 836 三-0-乙?；?D葡萄烯糖 552 三乙酸甘油酯 550 a-D(+)五乙酰葡萄糖 558 乙酸香葉酯 520 乙酸正丙酯 731 乙酸異丙烯酯 261 乳酸甲酯 344 二氫茉莉酮酸甲酯 447 辛酸甲酯 281 己酸甲酯 384 2-溴丙酸甲酯 530 溴乙酸甲酯 519 甲基（R)-(-)-扁桃酸 976
[0077] 溴苯乙酸甲酯 639 肉桂酸卞酯 663 乙酸-2-萘酯 294 丙酸萘酯 m 乙酸苯酯 425 丁酸萘基酯 746 4-硝基苯基辛酸酯 635 乙酸-1-萘酯 903 2, 6-二羥基-4-甲基苯甲酸甲酯 丨82 萘酚丙酸酯 375 甲基扁桃酸酯 826 阿魏酸乙酯 1969 阿魏酸甲酯 232:5 綠原酸 1983 迷迭香酸 1665 咖啡酸乙酯 2204 咖啡酸苯乙酯 2210 對羥基肉桂酸甲酯_ 1662_
[0078] 實施例7
[0079] 本實施例為酯酶水解去淀粉麩皮產(chǎn)阿魏酸的應(yīng)用。200g麩皮，加水1L。加入純化并 冷凍干燥后的酯酶50mg，pH自然，45°C保溫10小時，測定得阿魏酸的釋放率為68.2%。
【主權(quán)項】
1. 一種酯酶基因，其特征在于其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酯酶，其特征在于該酯酶對應(yīng)的氨基酸序列為SEQ ID NO.2所 不。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酯酶，其特征在于其最適反應(yīng)溫度為45 °C，最適反應(yīng)pH為7.0。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酯酶，其最適底物特征性質(zhì)表明該酯酶屬于阿魏酸酯酶。
【文檔編號】C12N15/55GK105821059SQ201610256499
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月22日
【發(fā)明人】蔡宇杰, 楊騰義, 陳佳君, 白亞軍, 鄭曉暉
【申請人】江南大學(xué)