一種基于同源重組的乳酸片球菌dq2的無標記基因敲除方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于同源重組的乳酸片球菌DQ2的無標記基因敲除方法，步驟包括溫度敏感型穿梭質粒pSET4E和含有所要敲除靶基因上下游同源片段的敲除質粒的構建，敲除質粒電轉化進入乳酸片球菌，發(fā)生第一次同源重組單交換和發(fā)生第二次同源重組雙交換突變株的篩選和鑒定。該發(fā)明首先實現(xiàn)了乳酸片球菌的無標記基因敲除，獲得的敲除菌株不攜帶任何抗性基因，既可以作為出發(fā)菌株進行后續(xù)基因敲除和改造，還可以安全用于大規(guī)模工業(yè)生產。利用該方法分別敲除了乳酸片球菌DQ2(保藏號為CGMCC NO.7471)的L-乳酸脫氫酶基因和D-乳酸脫氫酶基因，得到的敲除菌株分別命名為乳酸片球菌ZP26、TY112，其保藏號分別為CGMCC NO.8665和CGMCC NO.8664，它們能夠分別產生光學純的D-乳酸、L-乳酸。CGMCC NO.747120130412
【專利說明】
一種基于同源重組的乳酸片球菌DQ2的無標記基因敲除方 法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于同源重組原理的基因敲除方法，尤其涉及一種基于同源重組 的乳酸片球菌DQ2的無標記基因敲除方法及敲除乳酸片球菌DQ2的ldh、ldhD基因制備的 產光學純D-乳酸、L-乳酸的菌株。
【背景技術】
[0002] 乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici，簡稱 P. acidilactici)是一類兼性厭 氧的革蘭氏陽性細菌，屬于一種乳酸菌，它進行同型乳酸發(fā)酵，可以耐受很低的pH值，在較 高溫度和滲透壓下也可以生長。該類菌有益生菌的潛能，產生的乳酸和片球菌素會抑制其 他微生物的生長，并且在目前發(fā)表的文章中未發(fā)現(xiàn)其有毒性效應。
[0003] 乳酸片球菌P. acidilactici DQ2 (保藏號為CGMCC N0. 7471)為本實驗室在纖維 素乙醇發(fā)酵過程中分離得到的一株耐高溫，同時對木質纖維素預處理過程中產生的抑制物 有較高耐受性的乳酸高產菌株。此菌能夠在48°C的高溫下進行正常的發(fā)酵，并且最高能夠 產生100g/L以上的乳酸，基本沒有其他副產物的產生，具有極大的構建纖維素乳酸工業(yè)生 產模式菌的潛力。然而該菌株所產的乳酸為D，L-混合型乳酸，限制了產品的應用。
[0004] 乳酸是一種手性分子，根據(jù)其旋光性可分為D-乳酸、L-乳酸和D，L-乳酸。目 前乳酸最重要的用途是生產可以取代聚乙烯和聚丙烯等聚合材料的可降解聚乳酸產品 (Polymeric lactic acid，PLA)，這被看作是解決目前日益嚴重的白色污染的重要途徑。合 成性能好的聚乳酸需要光學純的乳酸單體，有必要對P. acidilactici DQ2進行菌株改造， 使其產生光學純的乳酸。該菌株產生L-乳酸最主要依靠的是L-乳酸脫氫酶（由ldh基因 編碼），產D-乳酸最主要依靠的是D-乳酸脫氫酶（由ldhD基因編碼），考慮采取基因敲除 的手段改造菌株使得其產生光學純的乳酸。
[0005] 基因敲除技術是20世紀80年代發(fā)展起來的一項重要的分子生物學技術，是通過 一定的方法使細胞中特定的基因失活或缺失的技術。它具有定位性強、插入基因隨染色體 DNA穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點?；虻那贸ǔＫ玫幕驹頌橥粗亟M，即外源基因片段如果同 宿主菌的基因組上某片段具有很高的同源度的話兩者將會發(fā)生交換。
[0006] 通常采用自殺質粒為載體構建敲除系統(tǒng)，將靶基因上游以及下游片段或者不完整 的靶基因連接到自殺質粒上并轉入宿主菌中，以敲除或者破壞靶基因。目前對大腸桿菌的 研究非常多，所以其基因敲除系統(tǒng)也比較成熟，如Red重組系統(tǒng)就非常地高效。而作為革蘭 氏陽性菌的乳酸菌的基因敲除系統(tǒng)則相對不是那么地完善，大部分的敲除還是采用自殺質 粒。而近年來出現(xiàn)了比較高效的熱敏性敲除系統(tǒng)，此系統(tǒng)是基于能夠在敲除宿主中進行條 件復制的復制子，即在低于某一溫度下該質粒能夠進行復制，而在高于某一溫度條件下該 質粒的復制將會被關閉。
[0007] Maguin E 等（Maguin E，Duwat P，Hege T，Ehrl ich D，GrussA. New thermosensitive plasmid for gram-positive bacteria. Journal of bacteriology， 1992,174(17) :5633-5638.)篩選得到一種突變質粒pVE6002。對其進行在沒有抗生素條件 下的熱敏性實驗，發(fā)現(xiàn)該質粒在37°C以上的溫度下培養(yǎng)8h后將會全部丟失，而在30°C以下 培養(yǎng)時幾乎不會出現(xiàn)丟失。接著在此質粒上插入一段多克隆位點，構建便于進行克隆的載 體pVE6004〇 Biswas I 等（Biswas I，Gruss A, Ehrlich SD，Maguin E. High-efficiency gene inactivation and replacement system for gram-positive bacteria. Journal of bacteriology，1993,175 (11) :3628-3635.)對該套系統(tǒng)進行了實際驗證，并且構建了大 腸桿菌-乳酸菌穿梭敲除質粒pGhost5以便于在大腸桿菌中進行同源片段的克隆。Gory L 等（Gory L，Montel MC，Zagorec M. Use of green fluorescent protein to monitor Lactobacillus sakei in fermented meat products. FEMS microbiology letters，2001， 194(2) : 127-133.)以半乳糖苷酶基因作為靶基因通過熱敏性敲除質粒pGhost5將gfp片 段整合到染色體上進行了表達。
[0008] OKano K 等（OKano K，Zhang Q，ShinKawa S，Yoshida S，TanaKa T，F(xiàn)uKuda H， Kondo A. Efficient production of optically pure D-lactic acid from raw corn starch by using a genetically modified L-lactate dehydrogenase gene-deficient and a-amylase-secreting Lactobacillus plantarum strain.Applied and environmental microbiology，2009, 75(2) :462_467.)通過 pGhost9 敲除質粒成功地對 L.plantarum上的L-乳酸脫氫酶基因（ldhL)進行了敲除，達到產光學純D-乳酸的目的。
[0009] TaKamatsu D 等（TaKamatsu D，OsaKi M，SeKizaKi T. Thermosensitive suicide vectors for gene replacement in Streptococcus suis. Plasmid，2001，46 (2)： 140-148.)對pGhost3進行改造，構建了一系列更加實用的豬鏈球菌敲除質粒。在pGhost3 上插入來源于PUC19的復制子、多克隆位點以及壯觀霉素抗性標記從而得到敲除質粒 PSET4S。在大腸桿菌中培養(yǎng)溫度為37°C時該質粒能夠復制，而在豬鏈球菌中37°C時該質粒 不能夠復制。用此質粒對S. equi的溶血素基因sly進行了敲除（將其替換成氯霉素抗性 基因）。
[0010] 目前還沒有對乳酸片球菌進行基因敲除的報道，因此建立一種乳酸片球菌的敲除 方法很有必要。

【發(fā)明內容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于提供一種P. acidilactici DQ2的基因敲除方法。
[0012] 本發(fā)明的另一個目的在于通過敲除P. acidilactici DQ2的ldh、ldhD基因，獲得 可以生產光學純D-乳酸、L-乳酸的菌株。
[0013] 本發(fā)明實現(xiàn)P. acidilactici DQ2的基因敲除所采用的技術方案是：構建含有紅 霉素抗性基因的PSET4E質粒，將要敲除的靶基因上下游同源片段分別按一定方向連接到 PSET4E上，獲得靶基因的敲除質粒，將敲除質粒通過電轉化進入P.acidilactici DQ2中， 得到含敲除質粒的菌株，之后在質粒不能復制的較高溫度42°C下培養(yǎng)，在含紅霉素的選擇 平板上獲得發(fā)生第一次同源重組使質粒整合到受體菌染色體上的單交換子，然后將單交換 子在無紅霉素條件下質?？梢詮椭频妮^低溫度28°C培養(yǎng)，連續(xù)轉接1-10次，在同樣條件下 培養(yǎng)，直至篩選得到發(fā)生第二次同源重組的無紅霉素抗性實現(xiàn)靶基因敲除的菌株。
[0014] 上述pSET4E質粒攜帶能在大腸桿菌中復制的復制原點、在革蘭氏陽性細菌中溫 敏型復制的復制原點、多克隆位點MCS、紅霉素抗性基因。
[0015] 上述敲除質粒是通過將P. acidilactici DQ2染色體上要敲除的革E基因上游和下 游、大小約為lkb的同源序列片段分別按一定方向酶切連接至pSET4E的多克隆位點上。
[0016] 上述敲除質粒通過電轉化進入P. acidilactici DQ2得到含敲除質粒的菌株的方 法是將1 y g敲除質粒（大約10 y L)與80 y L乳酸片球菌感受態(tài)細胞混合，在2000V、200 Q、 25 y F (1mm電擊杯）條件下電擊，電擊后迅速將菌液轉移到lmL的復蘇液里冰置5min，后轉 移到28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2. 5h，5000rpm離心4min，吸取800 y L上清，剩下的混勻后涂布含 紅霉素的MRS平板，28°C培養(yǎng)3d左右長出轉化子，挑取陽性克隆進行PCR驗證。
[0017] 上述發(fā)生第一次同源重組使質粒整合到受體菌染色體上的單交換子的驗證方法 是將含敲除質粒的P. acidilactici DQ2接種至添加紅霉素的MRS培養(yǎng)基中28°C、150rpm 條件下培養(yǎng)到對數(shù)期，以獲得大量含敲除質粒的菌株，然后以1%的接種量將上述菌液接種 到MRS培養(yǎng)基中，42°C (在該溫度下，質粒不能進行復制，篩選得到的對紅霉素有抗性的菌 株即為發(fā)生單交換的菌株）、150rpm條件下培養(yǎng)到穩(wěn)定期，將上述菌液稀釋10 6倍后涂布含 有紅霉素的MRS平板42°C培養(yǎng)，獲得發(fā)生第一次同源重組使質粒整合到受體菌染色體上的 單交換子，將單交換子在含紅霉素的MRS培養(yǎng)基中42°C培養(yǎng)，提取基因組DNA，設計引物進 行PCR驗證。
[0018] 上述篩選發(fā)生第二次同源重組實現(xiàn)靶基因敲除的菌株的方法是將單交換子接種 到含紅霉素的液體MRS培養(yǎng)基中42°C、150rpm培養(yǎng)至穩(wěn)定期，以1 %的接種量將上述菌液 接種到MRS培養(yǎng)基中，28°C (在低溫下激活整合到基因組上的質粒片段進行滾環(huán)復制，通過 同源重組方式發(fā)生剪切）、150rpm條件下培養(yǎng)到穩(wěn)定期以獲得第一次培養(yǎng)液。之后同樣以 1 %的接種量接種到MRS培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，從而獲得第二次的培養(yǎng)液，最多轉接10次直至 篩選到發(fā)生第二次同源重組實現(xiàn)靶基因敲除的菌株。將每次培養(yǎng)的菌液稀釋1〇 6倍后涂布 MRS平板，42°C培養(yǎng)，用牙簽挑取長出的單菌落，分別點種在含有紅霉素和不含有紅霉素的 MRS平板上，42°C培養(yǎng)。對于在不含有紅霉素的平板上可以生長而在含紅霉素平板上不能生 長的菌株，應該是發(fā)生雙交換同源重組的菌株。將雙交換菌株在MRS培養(yǎng)基中42°C培養(yǎng)，提 取基因組DNA，設計引物進行PCR驗證，從而得到靶基因敲除的突變株。
[0019] 本發(fā)明提供了一種基于同源重組的無標記基因敲除方法，在國際上率先把無標記 基因敲除技術應用于P. acidilactici，可以實現(xiàn)P. acidilactici中任何一個基因和多基 因的敲除，且不殘留任何抗生素抗性基因。
[0020] 本發(fā)明能快速、穩(wěn)定、高效地敲除P. acidilactici的基因，不僅可用于研究 P. acidilactici基因的功能和代謝機制，實現(xiàn)P. acidilactici的遺傳性狀改造，而且所獲 得的突變株不攜帶任何抗生素抗性基因，既可以作為出發(fā)菌株進行基因改造，還可以安全 地用于大規(guī)模工業(yè)生產。
[0021] 使用該敲除方法敲除P. acidilactici DQ2的ldh基因得到了產光學純D-乳酸的 菌株ZP26,敲除P. acidilactici DQ2的ldhD基因得到了產光學純L-乳酸的菌株TY112,這 兩個菌株已于2013年12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所），保藏 登記號分別為CGMCC N0. 8665和CGMCC N0. 8664,其分類命名為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici)〇 【【附圖說明】】
[0022] 圖1.用于基因敲除的pSET4E質粒的構建；
[0023] 圖2?敲除質粒pSET4E- A ldh的構建；
[0024] 圖3?敲除質粒pSET4E- A ldhD的構建；
[0025] 圖4. P. acidilactici DQ21dh基因敲除的構建流程示意圖；
[0026] 圖5. P. acidilactici DQ21dhD基因敲除的構建流程示意圖；
[0027] 圖 6. P. acidilactici ZP26、P. acidilactici TY112 基因敲除的 PCR 驗證圖；
[0028] 附圖6中的標記為：M，DL5, 000DNA Marker ;1，利用引物ldh-F和ldh-R擴 增P. acidilactici DQ2基因組的ldh基因；2,利用引物up-F-ldh和down-R-ldh擴增 P. acidilactici DQ2基因組中l(wèi)dh基因及其上下游同源臂；3,利用引物ldhD-F和ldhD-R 擴增P. acidilactici DQ2基因組中l(wèi)dhD基因的部分區(qū)域；4,利用引物up-F-ldhD和 down-R-ldhD擴增P. acidilactici DQ2基因組中l(wèi)dhD基因及其上下游同源臂；5,利用引 物ldh-F和ldh-R擴增P. acidilactici ZP26基因組的ldh基因；6,利用引物up-F-ldh和 down-R-ldh擴增P. acidilactici ZP26基因組中l(wèi)dh基因及其上下游同源臂；7,利用引物 ldhD-F和ldhD-R擴增P. acidilactici TY112基因組中l(wèi)dhD基因的部分區(qū)域；8,利用引 物up-F-ldhD和down-R-ldhD擴增P. acidilactici TY112基因組中l(wèi)dhD基因及其上下游 同源臂；
[0029] 圖 7. P. acidilactici DQ2、P. acidilactici ZP26、P. acidilactici TY112在簡化 MRS培養(yǎng)基中的生長曲線；
[0030] 圖8. P. acidilactici DQ2、P. acidilactici ZP26、P. acidilactici TY112在添加 碳酸鈣的簡化MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗和乳酸生成曲線。 【【具體實施方式】】
[0031] 以下提供本發(fā)明"一種基于同源重組的乳酸片球菌DQ2的無標記基因敲除方法" 的【具體實施方式】。
[0032] 試驗材料：
[0033] 本發(fā)明所用乳酸片球菌P. acidilactici DQ2由本實驗室篩選獲得，已于2013 年4月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地 址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所），保藏登記號為 CGMCC N0. 7471，其分類命名為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici)。所用大腸桿 菌XLl-blue由實驗室保藏。所述pMG36e質粒的來源見M van de Guchte，J M van der Vossen, J KoK and G Venema, Construction of a Lactococcal Expression Vector ： Expression of Hen Egg White Lysozyme in Lactococcus lactis subsp. Lactis, Applied and environmental microbiology，1989,55(l) :224_228。所述 pSET4S 質粒的來 源見 TaKamatsu D，OsaKi M，SeKizaKi T, Thermosensitive suicide vectors for gene replacement in Streptococcus suis，Plasmid，2001，46(2) :140_148〇
[0034] 一、試劑及培養(yǎng)基
[0035] PrimeSTAR HS DNA聚合酶、T4DNA連接酶購自TaKara生物工程公司；Pst I、EcoR I、Hind III、BamH I、Spe I等限制性內切酶購自Fermentas公司；質粒小抽試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；細菌基因組抽提試劑盒購自Omega生物 工程公司；PCR產物純化試劑盒購自生工生物工程有限公司；Megazyme D-/L_Lactic acid Kit試劑盒購自Megazyme公司；紅霉素、壯觀霉素購自博尊生物科技有限公司；其它藥品、 試劑如無特殊說明均購自上海凌峰化學試劑公司或上海國藥化學試劑集團，并都為分析 純；引物合成在上海捷瑞生物工程有限公司完成。
[0036] MRS 培養(yǎng)基（g/L):
[0037] 液體：葡萄糖20,蛋白胨10,酵母粉4,牛肉膏8,乙酸鈉3,檸檬酸氫二銨2,磷酸氫 二鉀2,七水硫酸鎂0. 2, 一水硫酸錳0. 05,吐溫801 mL/L ;固體：在液體培養(yǎng)基中額外添加 15g/L的瓊脂，115°C高壓蒸汽滅菌20min ;
[0038] 含紅霉素的MRS培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基基礎上加入終濃度5 y g/mL的紅霉素；
[0039] 簡化MRS液體培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖20,蛋白胨10,酵母粉10,乙酸鈉5,檸檬酸氫 二銨2,磷酸氫二鉀2,七水硫酸鎂0. 58, 一水硫酸錳0. 25,115 °C高壓蒸汽滅菌20min ;
[0040] 復蘇液（g/L):蔗糖171，葡萄糖20,蛋白胨10,酵母粉4,牛肉膏8,乙酸鈉3,檸檬 酸氫二銨2,磷酸氫二鉀2,七水硫酸鎂0. 2, 一水硫酸錳0. 05,吐溫801 mL/L，115°C高壓蒸 汽滅菌20min ;
[0041] LB 培養(yǎng)基（g/L):
[0042] 液體：酵母浸粉5,蛋白胨10,氯化鈉10 ;固體：在液體培養(yǎng)基中額外添加15g/L的 瓊脂，115°C高壓蒸汽滅菌20min ;
[0043] 含紅霉素的LB培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基基礎上加入終濃度150 y g/mL的紅霉素；含壯 觀霉素的LB培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基基礎上加入終濃度200 y g/mL的壯觀霉素。
[0044] 二、所用主要儀器：
[0045] Mastercycler 型 PCR 儀（Eppendorf 公司）；Gene Pulser Xcell?型電穿孔儀 (Bio-Rad公司）；EPS-100型DNA電泳系統(tǒng)（上海天能公司）；FR-200A型全自動紫外與可 見分析裝置（復日科技公司）；DU-800型核酸蛋白質分析儀（Beckman公司）；HZ-2111KB型 落地恒溫振蕩搖床（太倉華利達有限公司）；5415R型臺式冷凍離心機（Eppendorf公司）； LC-20AD型高效液相色譜（島津公司）；SDC-6型低溫水槽（寧波新芝生物科技有限公司）； DK-8D型三孔電熱恒溫水槽（上海一恒科學儀器有限公司）；GHP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng) 箱（上海一恒科學儀器有限公司）；F 〇rma-86C型超低溫冰箱（Thermo公司）。
[0046] 實施例1 :pSET4E質粒的構建
[0047] 熱敏性自殺質粒pSET4S是一種大腸桿菌-革蘭氏陽性細菌寬宿主范圍穿梭 型質粒，該質粒的來源見 DaisuKe TaKamatsu，MaKoto 0saKi，and Tsutomu SeKizaKi， Thermosensitive Suicide Vectors for Gene Replacement in Streptococcus suis， Plasmid，2001，46(2) :140 - 148。該質粒在大腸桿菌中培養(yǎng)溫度為37°C時能夠復制，從而 便于同源片段的克隆，而在豬鏈球菌中37°C時不能夠復制。該質粒不僅可用于豬鏈球菌的 基因敲除，還可用于其他一些革蘭氏陽性細菌的基因敲除，因此考慮用該質粒作為初始質 粒構建合適的敲除質粒來進行P. acidilactici的基因敲除。
[0048] 發(fā)現(xiàn)P. acidilactici DQ2對壯觀霉素具有很高的抗性（>150 yg/mL)，而對紅霉 素敏感，所以考慮將PSET4S上的壯觀霉素抗性基因更換成紅霉素抗性基因。
[0049] 根據(jù)質粒 pMG36e 的序列（SEQ ID N0:1)設計引物 Emr-F(SEQ ID N0:2)和 Emr-R(SEQID N0:3)擴增其中的紅霉素抗性基因Emr序列（SEQ ID N0:4)，以質粒pMG36e 為模版PCR擴增得到紅霉素抗性基因片段Emr，PCR擴增體系如下：
[0050] 5xPrimeSTAR Bul'lcr ( 5 mM plus'* !0 0 jal.； 上游引物i.〇 pl; 下游引物（10(iM) l.OixLi 10 mM dNTP mixture 4 0 jil ; 模版 DNA 0 5 nL； PrimcSTAR HS DNA Polymerase 0.5 pL，加水補個:50 )iL;
[0051] PCR 反應條件：94°C預變性 3min，94°C變性 30s，55°C退火 15s，72°C延伸 lmin，30 個循環(huán)后72°C延伸lOmin。分別用Spe I限制性內切酶對純化后的Emr基因片段以及質粒 pSET4S(SEQ ID N0:5)進行單酶切，然后切膠回收目的片段。為了避免連接過程中單酶切的 質粒片段發(fā)生自連，對單酶切后的質粒進行去磷酸化處理。去磷酸化體系如下（50yL):
[0052] DNA 30 nL 10XBAP buffer 5 (.iL 堿性磷酸裂解酶 2 pL
[0053] 無菌超純水 13 pL
[0054] 在PCR儀中設定程序進行反應，65°C反應lOmin，反應結束后用PCR產物純化試劑 盒進行純化。最后進行目的基因片段與質粒片段的連接，轉化大腸桿菌XLl-blue，挑選陽性 菌落進行菌落PCR，提取質粒進行酶切鑒定，得到構建成功的pSET4E(SEQ ID N0:6)(見圖 1)〇
[0055] 將 1 y g pSET4E 質粒（大約 10 y L)與 80 y L P. acidilactici DQ2 感受態(tài)細胞混 合，在2000V、200 Q、25 y F (1mm電擊杯）條件下電擊，電擊后迅速將菌液轉移到lmL的復蘇 液里冰置5min，后轉移到28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2. 5h，然后5000rpm離心4min，吸取800 y L上 清，剩下的混勻后涂布在含5 y g/mL紅霉素的MRS培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)3d左右長出轉 化子，用引物Emr-F和Emr-R進行PCR驗證。
[0056] 實施例2 :P. acidilactici DQ21dh基因的無標記敲除
[0057] (1) ldh基因敲除質粒pSET4E- A ldh的構建
[0058] 根據(jù) Pediococcus acidilactici 的模式菌株 DSM20284 中 ldh 基因（NCBI-GI =304328039)的上下游 DNA 序列，設計相應引物 up-F-ldh、up-R-ldh、down-F-ldh、 down-R-ldh(SEQ ID N0:7-10)PCR擴增ldh基因上下游序列up-ldh(L-乳酸脫氫酶基因起 始密碼子上游的大約lkb大小的序列）（SEQ ID NO:ll)、down-ldh(L-乳酸脫氫酶基因終止 密碼子下游的大約lkb大小的序列）（SEQ ID NO: 12)。
[0059] 以 P. acidilactici DQ2 的基因組 DNA 為模板，用引物 up-F-ldh、up-R-ldh 和 down-F-ldh、down-R-ldh 分別 PCR 克隆 ldh 基因的上下游同源序列 up-ldh、down-ldh，PCR 擴增體系與之前一致。
[0060] ?〇?的擴增條件如下：94°(：預變性3111111，94°(：變性308,58°(：退火158,72°(：延伸 70s，30個循環(huán)后72°C延伸lOmin。所得的PCR產物經0. 7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到 大小約為lkb左右的電泳條帶，將PCR產物純化。利用BamH I和Pst I分別雙酶切up-ldh 和質粒PSET4E，之后將酶切產物進行連接，轉化大腸桿菌XLl-blue，經PCR及酶切鑒定獲 得陽性菌株，得到將up-ldh克隆至pSET4E多克隆位點的質粒pSET4E-up-ldh，然后再用 EcoR I和BamH I分別雙酶切down-ldh和pSET4E-up-ldh，將酶切產物連接后轉化大腸桿 菌XLl-blue，經PCR及酶切鑒定獲得陽性菌株，成功得到將ldh基因上下游同源序列克隆至 PSET4E的L-乳酸脫氫酶基因敲除質粒pSET4E-A ldh(SEQ ID N0:13)(見圖2)。
[0061] (2)發(fā)生第一次同源重組的單交換菌株的篩選
[0062] 將構建好的基因敲除質粒pSET4E_Aldh電轉化入P.acidilactici DQ2的感 受態(tài)細胞，其轉化條件與之前保持一致，將菌液涂布在含5 y g/mL紅霉素的MRS平板上 28°C培養(yǎng)約3d，挑選陽性菌落，用引物Emr-F和Emr-R進行PCR驗證。將含敲除質粒的 P. acidilactici DQ2單菌落接種至添加5 y g/mL紅霉素的MRS培養(yǎng)基中28°C、150rpm條 件下培養(yǎng)約24h至對數(shù)期，然后以1 %的接種量將上述菌液接種到MRS培養(yǎng)基中，42°C、 150rpm條件下培養(yǎng)約12h到穩(wěn)定期，將菌液稀釋106倍涂布含5 y g/mL紅霉素的MRS平板， 42°C培養(yǎng)。長出的抗性單菌落即為單交換菌株。挑取抗性單菌落接至含5 yg/mL紅霉素的 MRS培養(yǎng)基中42°C、150rpm條件下培養(yǎng)，提取基因組DNA，設計引物單交換1 (ldh)-F、單交 換l(ldh)-R(SEQ ID N0:14-15)檢測通過up-ldh重組的第一種單交換的形式，引物單交換 2 (ldh)-F、單交換2 (ldh)-R(SEQ ID N0:16-17)檢測通過down-ldh重組的第二種單交換的 形式（見圖4)。
[0063] (3)發(fā)生第二次同源重組的基因敲除菌株的篩選
[0064] 將單交換子接種到含紅霉素的液體MRS培養(yǎng)基中42°C、150rpm培養(yǎng)約12h至穩(wěn)定 期，以1 %的接種量將上述菌液接種到MRS培養(yǎng)基中，28°C、150rpm培養(yǎng)約24h至穩(wěn)定期，之 后再以1 %的接種量轉接至新鮮的MRS培養(yǎng)基中同樣條件下培養(yǎng)24h，最多轉接10次，直 至篩選到發(fā)生基因敲除的菌株。收集每次培養(yǎng)的一部分菌液，用生理鹽水稀釋1〇 6倍后涂 布在不含抗生素的MRS平板上，42°C培養(yǎng)，用牙簽挑取平板上長出的單菌落，分別點種在不 含有紅霉素和含有5 y g/mL紅霉素的MRS平板上，42°C培養(yǎng)。對于在不含抗生素的平板上 可以生長，而在含有抗生素的平板上不能生長的菌落，應該是發(fā)生第二次同源重組的菌株。 將菌株接種至MRS液體培養(yǎng)基中42°C、150rpm培養(yǎng)，提取基因組DNA，用引物up-F-ldh和 down-R-ldh進行PCR擴增，另外用擴增ldh基因的引物ldh-F、ldh-R(SEQ ID N0:18-19)進 行PCR擴增。
[0065] 在發(fā)生第二次同源重組的雙交換子中，一種是回復突變成野生型，另一種就是ldh 基因敲除突變株（原理見圖4)。
[0066] 對于用引物up-F-ldh和down-R-ldh只能擴增出約2kb大小的PCR產物（含 up-ldh和down-ldh)，ldh-F和ldh-R擴增不出相應大小產物的菌株，即為發(fā)生第二次同源 重組ldh基因敲除的菌株。
[0067] 通過該方法得到的一株ldh基因敲除的菌株命名為Pediococcus acidilactici ZP26(PCR驗證見圖6)，已于2013年12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院 微生物研究所），保藏登記號為CGMCC N0. 8665,其分類命名為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici)〇
[0068] 實施例3 :P. acidilactici DQ21dhD基因的無標記敲除
[0069] (1) ldhD基因敲除質粒pSET4E- A ldhD的構建
[0070] 根據(jù)Pediococcus acidilactici DSM20284 中 ldhD基因（NCBI-GI = 304329050) 上下游 DNA 序列，設計相應引物 up-F-ldhD、up-R-ldhD、down-F_ldhD、down-R-ldhD(SEQ ID 勵:20-23)?〇?擴增其上下游序列即-1(1110(0-乳酸脫氫酶基因起始密碼子上游的大約11* 大小的序列）（SEQ ID N0:24)、down-ldhD(D-乳酸脫氫酶基因終止密碼子下游的大約lkb 大小的序列）（SEQ ID N0:25)。
[0071] 以 P. acidilactici DQ2 的基因組 DNA 為模板，用引物 up-F-ldhD、up-R-ldhD 和down-F-ldhD、down-R-ldhD分別PCR克隆ldhD基因的上下游同源序列up-ldhD和 down-ldhD，PCR擴增體系與之前保持一致。
[0072] ?〇?的擴增條件如下：94°(：預變性3111111，94°(：變性308,58°(：退火158,72°(：延伸 60s，30個循環(huán)后72°C延伸10min。所得的PCR產物經0. 7 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到 大小約為lkb左右的電泳條帶，將PCR產物純化。利用Hind III和BamH I分別雙酶切 up-ldhD和質粒pSET4E，將酶切產物連接后轉化大腸桿菌XLl-blue，經PCR及酶切鑒定獲得 陽性菌株，得到將up-ldhD克隆至pSET4E多克隆位點的重組質粒pSET4E-up-ldhD，然后再 用BamH I和EcoR I分別雙酶切down-ldhD和pSET4E-up-ldhD，酶切產物連接后轉化大腸 桿菌XLl-blue，經PCR及酶切鑒定獲得陽性菌株，成功地獲得D-乳酸脫氫酶基因敲除質粒 pSET4E-AldhD(SEQ ID N0:26)(見圖 3)。
[0073] (2)發(fā)生第一次同源重組的單交換菌株的篩選
[0074] 與ldh基因發(fā)生第一次同源重組的單交換菌株篩選步驟一致，不過進行單交換子 驗證時所用引物不同，設計引物單交換1 (ldhD) -F、單交換1 (ldhD) -R(SEQ ID N0:27-28)檢 測通過up-ldhD重組的第一種單交換的形式，單交換2 (ldhD) -F、單交換2 (ldhD) -R (SEQ ID NO:29-30)檢測通過down-ldhD重組的第二種單交換的形式（見圖5)。
[0075] (3)發(fā)生第二次同源重組的基因敲除菌株的篩選
[0076] 與ldh基因發(fā)生第二次同源重組的基因敲除菌株的篩選過程一致，不同的是進行 PCR驗證時用引物up-F-ldhD和down-R-ldhD進行PCR擴增，另外用擴增ldhD基因部分區(qū) 域的引物 ldhD-F、ldhD-R(SEQ ID N0:31-32)進行 PCR 驗證。
[0077] 對于用up-F-ldhD和down-R-ldhD只能擴增出約2kb大小PCR產物（含up_ldhD 和down-ldhD)，ldhD-F和ldhD-R擴增不出相應大小產物的菌株，即為發(fā)生第二次同源重組 ldhD基因敲除的菌株。
[0078] 通過該方法得到一株ldhD基因敲除的菌株命名為Pediococcus acidilactici TY112 (PCR驗證見圖6)，已于2013年12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院 微生物研究所），保藏登記號為0611〇：勵.8664，其分類命名為乳酸片球菌（?6(11〇(3〇(^1^ acidilactici)〇
[0079] 實施例4 :基因敲除菌株的應用
[0080] 構建得到兩株基因敲除菌株后，需要將其與原始菌株的基本性能進行比較。
[0081] 乳酸構型的測定：將 P. acidilactici DQ2、P. acidilactici ZP26、 P. acidi 1 actici TY112-80 °C凍存的甘油管分別接種至20mL簡化MRS培養(yǎng)基中，42 °C、 150印111培養(yǎng)1211后，以10%接種量轉接至501^簡化1?3液體培養(yǎng)基（添加128/10 &〇)3) 中，42°C、150rpm培養(yǎng)，取12h樣品利用Megazyme D-/L_Lactic acid Kit試劑盒測定乳酸 的光學純度，結果如表1，P. acidilactici ZP26、P. acidilactici TY112可以產光學純度超 過99%的乳酸，說明了 D、L-乳酸脫氫酶基因的敲除發(fā)揮了應有作用。
[0082] 生長曲線的比較：將 P. acidilactici DQ2、P. acidilactici ZP26、 P. acidi 1 actici TY 112-80 °C凍存的甘油管分別接種至20mL簡化MRS培養(yǎng)基中，42 °C、 150rpm培養(yǎng)12h，之后以10 %接種量轉接至50mL簡化MRS液體培養(yǎng)基中，42°C、150rpm培 養(yǎng)，測生長曲線，如圖7。從圖中可以看出P. acidilactici DQ2、P. acidilactici ZP26生 長差別不大，P. acidilactici TY112稍差，說明這兩個基因的敲除對菌株的生長影響較小。
[0083] 生成乳酸的比較：將 P. acidilactici DQ2、P. acidilactici ZP26、 P. acidi 1 actici TY 112-80 °C凍存的甘油管分別接種于20mL簡化MRS培養(yǎng)基中，42 °C、 150rpm培養(yǎng)12h，之后以10%接種量轉接至50mL簡化MRS液體培養(yǎng)基（添加12g/L CaC03) 中，42°C、150rpm培養(yǎng)，定期取樣測定乳酸及葡萄糖濃度，如圖8。DQ2的糖耗要稍快一點，其 他兩種菌稍慢。l〇h時DQ2消耗完糖，ZP26和TY112還有殘?zhí)谴嬖?，DQ2、ZP26、TY112的乳 酸得率分別為85%、82. 3%和95. 4%。以上結果說明這兩個基因的敲除對乳酸的生產影響 也較小。
[0084] 表1突變株乳酸構型的測定
[0086] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為 本發(fā)明的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種基于同源重組的乳酸片球菌DQ2的無標記基因敲除方法，步驟包括： (1) pSET4E質粒的構建：pSET4S質粒是一種溫度敏感型大腸桿菌-革蘭氏陽性細菌 寬宿主范圍穿梭型質粒，37°C下該質?？稍诖竽c桿菌中復制，但是在一些鏈球菌如豬鏈球 菌、馬鏈球菌、停乳鏈球菌中會很快丟失；PSET4S質粒含有壯觀霉素抗性基因，而乳酸片 球菌DQ2對壯觀霉素具有很高的抗性，但對紅霉素非常敏感，因此用紅霉素抗性基因取代 PSET4S的壯觀霉素抗性基因得到pSET4E質粒； (2) 將要敲除的靶基因上下游同源片段各約lkb分別克隆至pSET4E上，獲得靶基因的 敲除質粒； (3) 將敲除質粒通過電轉化進入乳酸片球菌DQ2中，得到含敲除質粒的菌株； (4) 將含敲除質粒的菌株在質粒復制受阻的較高溫度42°C下培養(yǎng)，在含紅霉素的選擇 平板上篩選發(fā)生第一次同源重組即質粒整合到受體菌染色體上的單交換子； (5) 將單交換子在無紅霉素且較低溫度28°C下培養(yǎng)，連續(xù)轉接1-10次并在同樣條件下 培養(yǎng)，直至篩選得到發(fā)生第二次同源重組無紅霉素抗性實現(xiàn)靶基因敲除的菌株； 其特征是： 步驟（1)所述的PSET4E質粒的構建方法是：用紅霉素抗性基因取代pSET4S的壯觀霉 素抗性基因；以pMG36e質粒（SEQIDNO:l)作為模板，設計引物Emr-F(SEQIDNO :2)和 Emr-R(SEQ ID NO:3)PCR擴增紅霉素抗性基因 Emr(SEQ ID N0:4);分別用限制性內切酶Spe I對Emr基因片段以及質粒pSET4S進行單酶切，為了避免連接過程中單酶切的質粒片段發(fā) 生自連，對單酶切后的質粒進行去磷酸化處理，之后將目的基因片段與質粒進行連接，轉化 大腸桿菌XLl-blue，利用引物Emr-F和Emr-R進行PCR驗證，同時酶切驗證得到正確質粒 PSET4E ； 步驟⑵所述的獲得靶基因敲除質粒的方法是：設計引物用PCR方法分別擴增乳酸片 球菌靶基因的上游和下游、大小約為lkb的同源片段，先后按一定方向克隆至pSET4E的多 克隆位點，得到該靶基因的敲除質粒； 步驟（3)將敲除質粒通過電轉化進入乳酸片球菌DQ2得到含敲除質粒的菌株方法是： 將1 μ g質粒（大約10 μ U與80 μ L乳酸片球菌DQ2感受態(tài)細胞混合，在2000V、200 Ω、 25 μ F (1mm電擊杯）條件下電擊，電擊后迅速將菌液轉移到lmL的復蘇液里冰置5min，后轉 移到28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2. 5h，5000rpm離心4min，吸取800 yL上清，剩下的混勻后涂布于 含紅霉素的MRS平板，28°C培養(yǎng)3d左右長出轉化子，挑取陽性克隆進行PCR驗證； 步驟（4)所述發(fā)生第一次同源重組使質粒整合到受體菌染色體上的單交換子的驗證 方法是：將含敲除質粒的乳酸片球菌DQ2接種至添加紅霉素的MRS培養(yǎng)基中28°C、150rpm 條件下培養(yǎng)到對數(shù)期，以獲得大量含敲除質粒的菌株，然后以1%的接種量將上述菌液接種 到不含紅霉素的MRS培養(yǎng)基中，42°C (在該溫度下，質粒不能進行復制，篩選得到的對紅霉 素有抗性的菌株即為發(fā)生單交換的菌株）、150rpm條件下培養(yǎng)到穩(wěn)定期，上述菌液稀釋10 6 倍后涂布于含有紅霉素的MRS平板上42°C培養(yǎng)，獲得發(fā)生第一次同源重組使質粒整合到受 體菌染色體上的單交換子，設計引物進行PCR驗證； 步驟（5)所述篩選發(fā)生第二次同源重組實現(xiàn)靶基因敲除的菌株的方法是：將單交換子 接種到含紅霉素的液體MRS培養(yǎng)基中42°C、150rpm培養(yǎng)至穩(wěn)定期，以1 %的接種量將上述菌 液接種到MRS培養(yǎng)基中，28°C (在低溫下激活整合到基因組上的質粒片段進行滾環(huán)復制，通 過同源重組方式發(fā)生剪切）、150rpm條件下培養(yǎng)到穩(wěn)定期，將培養(yǎng)液以1 %的接種量接種到 MRS培養(yǎng)基中，相同條件培養(yǎng)以獲得第二次培養(yǎng)液，長到穩(wěn)定期后同樣接種到MRS培養(yǎng)基中 進行培養(yǎng)，從而獲得第三次的培養(yǎng)液，最多轉接10次直至篩選到發(fā)生第二次同源重組實現(xiàn) 靶基因敲除的菌株；將每次培養(yǎng)的菌液稀釋1〇 6倍后涂布MRS平板，42°C培養(yǎng)，用牙簽挑取 長出的單菌落，分別點種在含有紅霉素和不含有紅霉素的MRS平板上，42°C培養(yǎng)；對于在不 含有紅霉素的平板上可以生長而在含紅霉素平板上不能生長的菌株，應該是發(fā)生雙交換同 源重組的菌株；設計引物進行PCR驗證，從而得到靶基因敲除的突變株。2. 根據(jù)權利要求1所述的一種基于同源重組的乳酸片球菌DQ2的無標記基因敲除方 法，其特征是：所述PSET4E質粒為pSET4S質粒的Spc基因被Emr基因替換得到的。3. 根據(jù)權利要求1所述的一種基于同源重組的乳酸片球菌DQ2的無標記基因敲除方 法，其特征是：所述敲除質粒的構建是把要敲除基因的上游和下游大小約為lkb的同源片 段分別按一定方向克隆到PSET4E的多克隆位點。4. 通過這種基因敲除方法制備的乳酸片球菌DQ2的L、D-乳酸脫氫酶基因敲除菌株 P.acidilactici ZP26、P.acidilactici TY112,其保藏號分別為 CGMCC N0.8665、CGMCC NO. 8664。5. 根據(jù)權利要求4所述的L、D-乳酸脫氫酶基因敲除菌株P. acidilactici ZP26和 P.acidilactici TY112,其特征在于發(fā)酵生產光學純D-乳酸、L-乳酸，基因敲除對這兩株 菌的生長影響較小，對發(fā)酵性能的影響也較小。
【文檔編號】C12N15/74GK105821071SQ201510006121
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2015年1月6日
【發(fā)明人】鮑杰, 張鵬, 涂毅, 高秋強, 張建
【申請人】華東理工大學