水稻溫敏雄性不育基因tms10的應(yīng)用及育性恢復(fù)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種水稻溫敏雄性不育基因TMS10的應(yīng)用及育性恢復(fù)方法。所述的TMS10的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的應(yīng)用是:采用常規(guī)方法，基因敲除、改變或抑制TMS10基因，使得常規(guī)水稻品種中的TMS10基因表達(dá)水平降低，進(jìn)而獲得水稻雄性不育株系。本發(fā)明制備的水稻雄性不育株系在水稻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期無異常表型出現(xiàn)，但在生殖生長(zhǎng)時(shí)期的花藥發(fā)育過程中出現(xiàn)異常，這一表型在秈稻和粳稻突變體中表現(xiàn)一致，平均生長(zhǎng)溫度28℃條件下不育，平均溫度22℃生長(zhǎng)條件下可育。這一溫敏特性在兩系雜交制種過程中可以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有廣泛應(yīng)用。
【專利說明】
水稻溫敏雄性不育基因 TMS10的應(yīng)用及育性恢復(fù)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于水稻育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水稻溫敏雄性不育基因TMS10的應(yīng) 用及及育性恢復(fù)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是世界上主要的糧食作物之一，養(yǎng)活了世界上以大米為主食的人口。因此提 高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)成為國(guó)計(jì)民生問題。從第一次綠色革命以來伴隨著矮桿品種的應(yīng)用，三 系雜交制種和兩系雜交制種也依次成為增產(chǎn)的重要因素。目前生產(chǎn)上常用的雜交水稻育種 的方法有三系法雜交水稻和兩系法雜交水稻。三系包括不育系、保持系和恢復(fù)系。三系制種 確實(shí)已經(jīng)提供了大量?jī)?yōu)秀的品種，但是在實(shí)際操作上各系的繁殖保存都需要耗費(fèi)大量的人 力財(cái)力。因此兩系法雜交育種的出現(xiàn)可以節(jié)約相當(dāng)一部分資源。兩系包括不育系和恢復(fù)系； 相比于三系，兩系中的不育系在一定的環(huán)境條件下可以轉(zhuǎn)換育性，因此不需要保持系來配 套生產(chǎn)不育系的種子。目前常用的兩系雜交制種中的不育系依育性轉(zhuǎn)換條件的不同分為光 敏不育系，溫敏不育系和光溫敏不育系。目前生產(chǎn)上常用的光溫敏不育系有農(nóng)墾58S、培矮 64S、安農(nóng)810S、株1S等一大批實(shí)用光/溫敏不育材料。但是目前已經(jīng)報(bào)道的控制光溫敏雄性 不育基因的數(shù)目還屈指可數(shù)，因此發(fā)現(xiàn)和研究新的光溫敏不育材料為育種工作提供了更多 的線索和增產(chǎn)的可能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)上兩系生產(chǎn)中報(bào)道的不育系種質(zhì)資源較少的不足，提供一種 溫敏雄性不育基因TMS10的應(yīng)用及恢復(fù)水稻雄性不育的方法，利用TMS10基因及其蛋白參與 調(diào)控水稻雄性生殖的特點(diǎn)，及其利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)控制水稻雄性生殖發(fā)育，通過突變?cè)摰鞍?序列或抑制該蛋白的表達(dá)產(chǎn)生新的水稻雄性不育株系，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分重要的應(yīng) 用。
[0004] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0005] 第一方面，本發(fā)明提供一種水稻雄性不育基因TMS10的應(yīng)用，所述雄性不育基因 TMS10編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的應(yīng)用具體是，采用常規(guī)方法，敲除、改 變或抑制TMS 10基因，使得常規(guī)水稻品種中的TMS 10基因表達(dá)水平降低，進(jìn)而獲得水稻雄性 不育株系。
[0006] 第二方面，本發(fā)明提供一種水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法，包括如下步驟:選擇常 規(guī)水稻品種，處理，培育，即得所述水稻雄性不育株系，所述處理為，采用常規(guī)方法，使得水 稻中編碼如SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸序列發(fā)生缺失，變異或抑制，進(jìn)而使得所述氨 基酸序列對(duì)應(yīng)多肽的表達(dá)水平降低或活性喪失。
[0007] 優(yōu)選地，所述水稻品種為粳稻品種9522,或秈稻品種黃花占。
[0008] 優(yōu)選地，所述核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]本發(fā)明采用常規(guī)方法，使常規(guī)水稻品種中如SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列突變?yōu)?SEQ ID從).3，進(jìn)而獲得水稻雄性不育株系，即加810突變體。
[0010] 本發(fā)明采用常規(guī)方法，使常規(guī)水稻品種中如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列突變?yōu)?SEQ ID從).4，進(jìn)而獲得水稻雄性不育株系，即加810突變體。
[0011] 優(yōu)選地，包括如下步驟:采用RNAi干擾技術(shù)，抑制或者降低編碼如SEQ ID NO. 1所 示氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO.2的表達(dá)，降低所述氨基酸序列對(duì)應(yīng)多肽的表達(dá)水 平。
[0012] 優(yōu)選地，所述RNAi干擾技術(shù)中RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建方法包括如下步驟：
[0013] 從水稻全長(zhǎng)cDNA中用兩對(duì)引物分別擴(kuò)增出TMS10基因編碼區(qū)序列的第1762位至3' UTR第355位共418bp的特異性片段；
[0014] 將這兩個(gè)片段分別通過BamHI/Xbal，HindIII/EcoRI正反向插入連入加入含有水 稻Intron序列的pBluescript SK載體；
[0015] 測(cè)序驗(yàn)證正確，再用Xbal和Hindlll酶切切下含有tmslO正反向特異性片段和 Intron的片段，連入經(jīng)同樣酶切的PHB載體中；
[0016]再次測(cè)序檢驗(yàn)核苷酸序列是否正確，成功構(gòu)建PHB-TMS10-RNAi質(zhì)粒；
[0017] 所述兩對(duì)引物的堿基序列如5￡〇10如.12和5￡〇10如.13、5￡〇10如.14和5￡〇 ID No. 15所示。
[0018]第三方面，本發(fā)明提供一種水稻雄性不育基因TMS10在粳稻和秈稻中保守性的應(yīng) 用，其特征在于，所述應(yīng)用包括如下步驟:通過雜交和回交，篩選出秈稻中具有tmslO突變位 點(diǎn)的不育株系。核苷酸序列突變?yōu)镾EQ ID N0.3,導(dǎo)致氨基酸序列突變?yōu)镾EQ ID N0.4的突 變位點(diǎn)轉(zhuǎn)入秈稻后，在秈稻替換系中得到同樣溫敏不育的突變株。
[0019] 第四方面，本發(fā)明提供一種水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法獲得的水稻雄性不育株 系在水稻制種中的用途，所述用途包括:將所述水稻雄性不育株系經(jīng)處理后自交結(jié)實(shí)制種； 或者將所述水稻雄性不育株系經(jīng)處理后作為母本，配合具有雜種優(yōu)勢(shì)的父本，生產(chǎn)雜種F1 代，進(jìn)行雜交育種。
[0020] 優(yōu)選地，將所述水稻雄性不育株系經(jīng)處理后自交結(jié)實(shí)制種中，所述處理具體為:在 水稻雄性不育株系的幼穗發(fā)育期至花藥減數(shù)分裂時(shí)期，保持平均溫度為22~24°C，每天光 照12-14.5小時(shí);將所述水稻雄性不育株系經(jīng)處理后作為母本中，所述處理具體為:在水稻 雄性不育株系的幼穗發(fā)育期至花藥減數(shù)分裂時(shí)期，在平均生長(zhǎng)溫度大于28°C條件下，每天 光照12-14.5小時(shí)。
[0021] 第五方面，本發(fā)明提供一種恢復(fù)水稻雄性不育株系的雄性不育性狀的方法，包括 如下步驟:采用常規(guī)遺傳手段將所述TMS10基因，轉(zhuǎn)入獲得的水稻雄性不育株系中，進(jìn)而使 得突變體恢復(fù)野生型表型。
[0022] 優(yōu)選地，所述方法具體包括如下步驟：
[0023] (a)從水稻日本晴BAC克隆中用堿基序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No. 10所示的引物擴(kuò)增出TMS10基因的如SEQ ID NO. 11所示序列片段；
[0024] (b)提供攜帶表達(dá)TMS10互補(bǔ)構(gòu)建載體的根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)EHA105；
[0025] (c)將含 TMS10互補(bǔ)構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens)EHA105 轉(zhuǎn)入 所述水稻雄性不育株系，培育，即得;其中TMS10互補(bǔ)構(gòu)建含有序列如SEQ ID NO. 11所示的 核苷酸。
[0026]優(yōu)選地，所述步驟(c)具體為：
[0027]將水稻細(xì)胞或組織或器官與步驟(b)中的根癌農(nóng)桿菌接觸，從而使編碼如SEQ ID NO. 11所示氨基酸的核苷酸序列轉(zhuǎn)入水稻細(xì)胞，并且整合到水稻細(xì)胞的染色體上；
[0028]選擇轉(zhuǎn)入所述核苷酸的水稻細(xì)胞或組織，進(jìn)行再生，獲得水稻植株。
[0029]本發(fā)明通過基因工程的方法使得TMS10編碼的一個(gè)亮氨酸富集重復(fù)序列受體激酶 (LRR-RLK)失活，突變體花藥在高溫條件下敗育;基因表達(dá)模式分析表明該基因在花藥發(fā)育 早期表達(dá)。
[0030]本發(fā)明中所述基因純合突變體在水稻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期無異常表型出現(xiàn)，但在生殖生 長(zhǎng)時(shí)期的花藥發(fā)育過程中出現(xiàn)異常，這一表型在秈稻和粳稻突變體中表現(xiàn)一致，平均生長(zhǎng) 溫度28°C條件下不育，平均溫度22°C生長(zhǎng)條件下可育。
[0031]本發(fā)明具有如下的有益效果:本發(fā)明通過控制水稻TMS10基因及其編碼蛋白獲得 水稻雄性生殖發(fā)育的變異株，實(shí)現(xiàn)控制水稻生殖過程;本發(fā)明獲得的水稻突變體在營(yíng)養(yǎng)期 與來源親本無明顯差異，進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段后雄性生殖發(fā)育異常，花粉敗育，得到完全不育 的植株，在雜交水稻構(gòu)建和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分重要的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0032]通過閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：
[0033] 圖1為溫敏雄性不育tmslO突變體的溫敏不育表型，RNAi及基因組互補(bǔ)表型示意 圖；其中：圖1A為28°C生長(zhǎng)條件下粳稻9522去內(nèi)外稃花表型圖；圖1B為22°C生長(zhǎng)條件下粳稻 9522去內(nèi)外稃花表型圖；圖1C為28°C生長(zhǎng)條件下tmslO不育株去內(nèi)外稃花表型圖；圖1D為28 °C生長(zhǎng)條件下tmslO可育株去內(nèi)外稃花表型圖；圖1E為TMS10-RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)化粳稻9522 植株去內(nèi)外稃花表型圖；圖1F為TMS10基因組DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化tmslO不育株去內(nèi)外稃花表 型圖；圖1G為28°C生長(zhǎng)條件下粳稻9522花粉粒I2-KI染色圖；圖1H為28°C生長(zhǎng)條件下粳稻 9522花粉粒I2-KI染色圖；圖II為28°C生長(zhǎng)條件下tmslO花粉粒I 2-KI染色圖；圖1J為22°C生 長(zhǎng)條件下tmslO花粉粒I2-KI染色圖；圖1K為TMS10-RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)化粳稻9522植株花粉粒 I2-KI染色圖；圖1L為TMS10基因組DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化tmslO不育株花粉粒I2-KI染色圖；圖1A 到圖1F的圖標(biāo)等于1暈米;圖1G到圖1L的圖標(biāo)等于200微米；
[0034]圖2為tmslO在秈稻中發(fā)明效果示意圖；其中圖2A為28°C平均生長(zhǎng)條件下秈稻黃花 占野生型去內(nèi)外稃花表型圖；圖2B為28°C平均生長(zhǎng)條件下tmslO在秈稻黃花占背景下去內(nèi) 外稃花表型圖；圖2C為22°C平均生長(zhǎng)條件下tmslO在秈稻黃花占背景下去內(nèi)外稃花表型圖； 圖2D為28°C生長(zhǎng)條件下秈稻黃花占野生型花粉粒I 2-KI染色圖；圖2E為28°C生長(zhǎng)條件下 tmslO在秈稻黃花占背景下花粉粒I2-KI染色圖；圖2F為22°C生長(zhǎng)條件下tmslO在秈稻黃花 占背景下花粉粒I2-KI染色圖；圖2A到圖2C的圖標(biāo)等于2毫米；圖2D到圖2F的圖標(biāo)等于200微 米；
[0035] 圖3為粳稻9522和tmslO表型示意圖；其中，圖3A粳稻9522和tmslO背景下抽穗期 整株表型示意圖；圖3B粳稻9522開花期小穗表型示意圖；圖3C粳稻tmslO開花期小穗表型示 意圖；圖3D粳稻9522開花期小花表型示意圖；圖3E粳稻tmslO開花期小花表型示意圖；圖3F 粳稻9522開花期小花去除一半內(nèi)外稃表型示意圖；圖3G粳稻tmslO開花期小花去除一半內(nèi) 外稃表型示意圖；圖3H粳稻9522開花期花藥表型示意圖；圖31粳稻tmslO開花期花藥表型示 意圖；圖3J粳稻9522開花期花藥I 2-KI示意圖；圖3K粳稻tmslO開花期花藥I2-KI示意圖；圖3A 的圖標(biāo)等于15厘米；圖3B和圖3C的圖標(biāo)等于1厘米；圖3D到圖3G的圖標(biāo)等于2暈米；圖3H和圖 31的圖標(biāo)等于1暈米;圖3J和圖3K的圖標(biāo)等于100微米；
[0036]圖4為TMS10基因定位、結(jié)構(gòu)和突變位點(diǎn)示意圖；其中，圖4A為TMS10基因定位示意 圖，豎線上標(biāo)記的數(shù)字為所用的引物的名稱，重組子和群體的數(shù)目；以"AP"開頭的數(shù)字為 BAC克隆名稱;Chr.2表示基因位于2號(hào)染色體上;BAC克隆下面的數(shù)字BAC上的堿基數(shù)目；圖 4B為TMS10基因結(jié)構(gòu)示意圖，灰色框表示UTR區(qū)域;黑色框表示外顯子;黑色細(xì)線表示內(nèi)含子 區(qū)域;圖4C為野生型WT和tmslO突變體中突變位點(diǎn)詳細(xì)情況示意圖；
[0037] 圖5為TMS10基因的表達(dá)情況示意圖；其中，橫坐標(biāo)所述的S5-6、S7-8a、S8b、S9、 S10、S11、S12、S13表示水稻雄性生殖發(fā)育的各個(gè)時(shí)期野生型花藥材料；
[0038]圖6為TMS10基因組DNA融合GUS報(bào)告基因的載體轉(zhuǎn)化tmslO突變體，轉(zhuǎn)基因陽性植 株中能互補(bǔ)表型的株系的小花的⑶S染色結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù) 人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。
[0040]下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述 的條件，或按照制造廠商所建議的條件。所述TMS10基因?yàn)榫幋a如SEQ ID NO. 1所示氨基酸 序列的核苷酸序列。
[0041 ] 實(shí)施例1、水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法
[0042] 1.1通過基因工程或其他手段創(chuàng)制tmslO水稻雄性不育株系
[0043] 本實(shí)施例中TMS10基因的編碼區(qū)序列如SEQ ID N0.2所示。本實(shí)施例的粳稻品種 tmslO突變材料是由常規(guī)粳稻品種武育粳7號(hào)（又名9522)經(jīng)過對(duì)TMS10基因的序列變異獲 得，秈稻材料黃花占品種中tms 10突變體是由粳稻品種中溫敏不育突變體經(jīng)過反復(fù)與秈稻 黃花占雜交回交分離得到的。
[0044] 1.2水稻育性控制蛋白基因的克隆
[0045]利用發(fā)明人構(gòu)建的包含育性控制蛋白基因TMS10及其突變基因tmslO組成的、本領(lǐng) 域內(nèi)技術(shù)人員清楚的水稻基因定位克隆(map-based cloning或position cloning)群體， 按分子標(biāo)記定位于3個(gè)BAC之間，分別是AP005694，AP005533，AP004001約240kb。在此基礎(chǔ) 上，通過RGAP(Rice Genome Annotation Project)網(wǎng)站對(duì)該區(qū)域內(nèi)基因的注釋分析，經(jīng)測(cè) 序確定其中一個(gè)水稻雄性生殖發(fā)育控制蛋白TMS10基因發(fā)生突變（圖4A)，具體突變類型為 在第七個(gè)外顯子上缺失7個(gè)堿基導(dǎo)致翻譯提前終止(圖4B，4C)。
[0046] 經(jīng)全核苷酸序列分析結(jié)果表明：水稻雄性育性TMS10基因全長(zhǎng)為6439bp(SEQ ID NO. 16,包含調(diào)控區(qū)和內(nèi)含子）。經(jīng)軟件分析和cDNA克隆，其ORF如SEQ ID NO. 2所示，編碼全 長(zhǎng)為607個(gè)氨基酸的水稻雄性生殖發(fā)育控制蛋白，其序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0047] 1.3水稻育性控制蛋白基因的點(diǎn)突變
[0048]本實(shí)施例的tmslO突變材料由常規(guī)粳稻品種武育粳7號(hào)（又名9522)經(jīng)過突變而得， 具體而言，是將野生型9522中的TMS10序列進(jìn)行突變，將變體tmslO中該基因在第七個(gè)外顯 子上有七個(gè)堿基的缺失（其序列如SEQ ID N0.3所示）（圖4B)，導(dǎo)致蛋白的移碼和提前終止 (其序列如SEQ ID N0.4所示）（圖4C)，會(huì)使得水稻雄性生殖器官花藥不能正常發(fā)育，造成植 株不育。本實(shí)施例的突變可以采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法實(shí)施。
[0049] 本領(lǐng)域人員知曉，還可以采用諸如射線照射誘變水稻常規(guī)品種進(jìn)行突變，若使得 tmslO發(fā)生突變，進(jìn)而導(dǎo)致其編碼蛋白的的移碼和提前終止，同樣會(huì)使得水稻雄性生殖器官 花藥不能正常發(fā)育（圖1，圖3F-3I)，造成植株不育（圖1，圖2)。
[0050] 1.4通過RNAi手段敲除水稻品種中的TMS10
[0051 ] 為了對(duì)TMS10蛋白進(jìn)行應(yīng)用，構(gòu)建了TMS10基因RNAi的載體，并轉(zhuǎn)化野生型9522植 株，以期降低TMS10的表達(dá)，從而達(dá)到改變水稻育性的目的。
[0052] 從水稻全長(zhǎng)cDNA中用兩對(duì)引物
[0057] 分別擴(kuò)增出tmslO基因編碼區(qū)序列的第1762位至3'UTR第355位共418bp的特異性 片段;將這兩個(gè)片段分別通過BamHI/XbaI，HindIII/EC〇RI正反向插入連入加入含有水稻 Intron序列的pBluescript SK載體；測(cè)序驗(yàn)證正確，再用Xbal和Hindlll酶切切下含有 TMS10正反向特異性片段和Intron的片段，連入經(jīng)同樣酶切的PHB載體中。再次測(cè)序檢驗(yàn)核 苷酸序列是否正確，成功構(gòu)建PHB-TMS10-RNAi質(zhì)粒。
[0058] 將含有PHB-TMS10-RNAi構(gòu)建的農(nóng)桿菌在含有Kan(50yg/yl)的YEB平板上劃線，獲 的單菌落。挑單菌落接種到3ml含(Kan和rif)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中于28°C振蕩培養(yǎng)過 夜，第2天按1 %接種量轉(zhuǎn)接入50ml含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，200rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至 0D6QQ為0.3至0.6左右時(shí)，將新鮮的農(nóng)桿菌菌液于5000rpm、離心5分鐘，收集并重懸于1/3體 積的AAM-AS液體培養(yǎng)基中，此時(shí)即可用于轉(zhuǎn)化水稻各種受體材料。
[0059]本實(shí)施例采用常規(guī)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化水稻9522的幼穗愈傷。取幼穗分化形成 后穗長(zhǎng)約3-5cm的小穗進(jìn)行誘導(dǎo)，N6D2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，在26土 TC、避光條件下培 育，15天后繼代，培養(yǎng)8天后可用于轉(zhuǎn)化。將愈傷浸泡入新鮮的AAM農(nóng)桿菌菌液中并不時(shí)搖 動(dòng)，20分鐘后將水稻材料移出，在無菌濾紙上吸去過多的菌液，隨即轉(zhuǎn)移到N6D2C培養(yǎng)基上， 于26 °C共培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)時(shí)，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮，使用濃度為100yM/L。3天 后，從共培養(yǎng)培養(yǎng)基上取出愈傷組織，切去胚芽并轉(zhuǎn)入含有50mg/L Hyg和特美汀的選擇培 養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng)。12天后將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)到含有50mg/L Hyg和特美汀的選擇培養(yǎng)基 上繼續(xù)篩選。12天后生長(zhǎng)旺盛的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩周左右（24小時(shí) 光照），代綠芽點(diǎn)長(zhǎng)出后更換新的分化培養(yǎng)基繼續(xù)分化培養(yǎng)至有芽長(zhǎng)出。再生的小苗在1/2M 培養(yǎng)基上生根壯苗，隨后移入人工氣候室營(yíng)養(yǎng)液栽培。
[0060]陽性植株提取葉片總DNA，用鑒定引物進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)化植株，用定量PCR的方法進(jìn) 行分析轉(zhuǎn)基因陽性植株中TMS10基因的表達(dá)量，挑選表達(dá)下調(diào)的株系進(jìn)行種植。
[0061 ]從表型上來看，TMSIO-RNAi突變體在成熟時(shí)期，花藥偏?。▓D1E)，進(jìn)行碘染發(fā)現(xiàn)， 不能形成正常的花粉粒（圖1K)，而野生型的花粉碘染正常（圖1G，1H)，這說明TMS10基因敲 除后使花粉的發(fā)育受到影響，能夠得到獲得新的水稻雄性不育系。
[0062] 1.5 TMS10蛋白活性喪失導(dǎo)致水稻雄性發(fā)育異常，出現(xiàn)溫敏的表型
[0063] 對(duì)tmslO突變體植株的形態(tài)學(xué)觀察。如圖3所示，tmslO突變體株高并不受影響（圖 3A)，能正常開花（圖3B-E)。如圖1所示高溫條件下，野生型和突變型tmslO的表型對(duì)比顯示 野生型9522花藥發(fā)育正常（圖1A)，而tmslO突變型花藥變白變小（圖1C);野生型9522碘染正 常（圖1G，3J)，突變型tmslO花藥碘染，幾乎沒有花粉粒（圖1I，3K)。而在低溫條件下，野生型 和突變型tmslO花藥幾乎沒有差異（圖1B，1D)，碘染都能形成正常的花粉粒(圖1H，1J)
[0064] 1.6 TMS10表達(dá)特征
[0065] 利用tmslO突變株的來源親本9522各個(gè)器官組織，提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 第一鏈，利用熒光定量PCR的方法確定TMS10基因的表達(dá)模式(如圖5 )，發(fā)現(xiàn)TMS10基因在水 稻雄性生殖發(fā)育時(shí)期stage9之前有著顯著的表達(dá);除此之外，營(yíng)養(yǎng)發(fā)育過程中的根、莖和葉 中也有表達(dá)。通過構(gòu)建啟動(dòng)子TMS10融合GUS的載體的構(gòu)建并轉(zhuǎn)化tmslO愈傷組織，得到的轉(zhuǎn) 基因陽性苗GUS染色結(jié)果表明TMS10蛋白在花藥發(fā)育早期的花藥中特異表達(dá)(圖6)。
[0066] 實(shí)施例2 tmslO突變體育性轉(zhuǎn)換條件及其在水稻制種中的用途 [0067] 2.1 tmslO突變體育性轉(zhuǎn)換條件
[0068]通過多年的試驗(yàn)檢測(cè)，在水稻生長(zhǎng)時(shí)期的幼穗分化時(shí)期到花藥減數(shù)分裂時(shí)期進(jìn)行 處理tmslO的表型出現(xiàn)分化。觀察表明野生型在12h-14.5h光照及22-28°C條件下都能形成 正常花粉粒并正常結(jié)實(shí)。tmslO突變體，從在光照12h-14.5h之間，低溫22°C條件下育性得到 完全恢復(fù)（圖1D，1J)，能夠正常結(jié)實(shí)。tmslO突變體在光照12h-14.5h之間，溫度23-26°C之 間，能夠形成少量成熟花粉粒，少量結(jié)實(shí)并且隨著溫度的升高，花粉碘染率及結(jié)實(shí)率都下 降。tms 10突變體在光照12h-14.5h之間，在平均溫度28°C條件下沒有花粉粒形成，自交不能 結(jié)實(shí)，表現(xiàn)完全不育的表型（圖1C，II)。
[0069] 2.2 TMS10基因在創(chuàng)制其他水稻品系雄性不育株系中的應(yīng)用
[0070]將tmslO突變體與秈稻黃花占進(jìn)行雜交得到的F1代，F(xiàn)1代自交F2代中篩選具有秈 稻特征的雄性不育系，進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證F2代中有tmslO突變位點(diǎn)的存在。F2代與黃花占回交 得到BC1F2，BC1F2再次自交得到BC1F3,從BC1F3再次篩選具有黃花占特征的雄性不育系并 測(cè)序確保tmslO突變位點(diǎn)的存在。BC1F3再次與黃花占回交得到BC2F3，BC2F3再次自交從其 中挑選具有黃花占背景的雄性不育株系。經(jīng)過持續(xù)的回交和自交得到秈稻中的替換系為溫 敏雄性不育表型（圖2A-F)，在平均溫度28°C條件下tmslO相比于野生型黃花占表現(xiàn)出不育 表型，花藥偏小偏白（圖2B)，碘染沒有成熟花粉粒（圖2E);在平均溫度22°C條件下tms 10相 比于野生型黃花占表現(xiàn)出類似的可育表型，花藥正常發(fā)育飽滿偏黃（圖2C)，碘染富有成熟 花粉粒（圖2F)。進(jìn)而證明TMS10基因在秈稻品種中發(fā)生核苷酸序列變化時(shí)，同樣可以產(chǎn)生溫 敏雄性不育植株。
[0071] 2.3 tmslO溫敏不育的應(yīng)用
[0072]在低溫條件下（平均溫度22_24°C之間）可以利用tmslO雄蕊的可育性生產(chǎn)不育系 的種子;在高溫條件下(平均溫度在28°C)及以上tmslO作為一個(gè)徹底的完全不育系。因此在 高溫條件下tmslO不育系作為母本可以配合具有雜種優(yōu)勢(shì)的恢復(fù)系父本例如已經(jīng)得到驗(yàn)證 的JP69生產(chǎn)雜交種子，結(jié)實(shí)率能達(dá)到80%以上。低溫條件下例如海南春季2月份或者上海10 月份，tmslO可以自交結(jié)實(shí)用以不育系的制種。此外，采用傳統(tǒng)的雜交和回交的方法可以將 tmslO突變位點(diǎn)轉(zhuǎn)入到生產(chǎn)常用的常規(guī)品種中，得到常規(guī)育種品種中的溫敏不育系。因此在 育種中tms 10溫敏雄性不育突變體可以作為生產(chǎn)上可用的兩系制種的育種材料。
[0073] 實(shí)施例3恢復(fù)tmslO突變體雄性不育性狀的方法
[0074]將編碼TMS10基因的基因組核苷酸序列轉(zhuǎn)入突變體tmslO植株，能夠使突變體恢復(fù) 到野生型表型。
[0075] 從水稻日本晴BAC克隆(0SJNbal8M09)中用引物：
[0082] 將TMS10基因的9236bp(SEQ ID NO. 11)的基因組序列片段分步插入到 PCAMBIA1301 載體中。
[0083] 將該片段分三個(gè)片段依次通過三次酶切插入，分別為:Sail和PmacI，PstI和Spel， SpeI單酶切插入到用于轉(zhuǎn)化水稻的雙元載體pCAMBIA1301載體中；測(cè)序驗(yàn)證正確，該載體 通過電擊導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，得到TMSIOgDNA互補(bǔ)根癌 農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105,使用遺傳轉(zhuǎn)化手段轉(zhuǎn)化突變體tms 10成熟胚 愈傷，從而使編碼如SEQ ID N0.3所示氨基酸的核苷酸轉(zhuǎn)入水稻細(xì)胞，并且整合到水稻細(xì)胞 的染色體上;再生，獲得水稻植株;以觀察是否會(huì)使突變體恢復(fù)到野生型表型。
[0084] To代獲得互補(bǔ)植株（圖1F)，通過觀察顯示To代互補(bǔ)植株可以產(chǎn)生黃色花藥（圖1F)， 并被I2-KI染色（圖1L)，即表現(xiàn)出的野生型表型。SEQ ID N0.11為互補(bǔ)tmslO突變體全長(zhǎng)核 苷酸序列，SEQ ID N0.2為TMS10全長(zhǎng)cDNA序列，SEQ ID N0.1為TMS10全長(zhǎng)氨基酸序列。 [0085]綜上所述，本發(fā)明通過控制一個(gè)編碼LRR受體激酶TMS10基因及其編碼蛋白獲得水 稻溫敏雄性生殖發(fā)育異常的變異株，實(shí)現(xiàn)控制水稻雄性生殖發(fā)育和育性。本發(fā)明獲得的水 稻突變體在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期與來源親本無明顯差異，進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段后，雄性生殖器官發(fā) 育異常、花粉敗育引起植株不育。本發(fā)明所述基因突變后導(dǎo)致tmslO突變體出現(xiàn)高溫平均溫 度28°C雄性不育的表型；在低溫平均溫度22-24°C之間出現(xiàn)雄性部分可育的表型，部分結(jié) 實(shí);作為雜交育種的母本可以和優(yōu)勢(shì)品種配組生產(chǎn)雜交種子。將該突變位點(diǎn)導(dǎo)入秈稻品種 中能產(chǎn)生相似的溫敏雄性不育的表型。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上為兩系雜交育種提供了寶貴的資源， 具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0086]以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述 特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影 響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種水稻雄性不育基因 TMS10的應(yīng)用，其特征在于，所述雄性不育基因 TMS10編碼的 氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的應(yīng)用具體是，采用常規(guī)方法，基因敲除、改變或抑制 TMS10基因，使得常規(guī)水稻品種中的TMS10基因表達(dá)水平降低，進(jìn)而獲得水稻雄性不育株系。2. -種水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法，其特征在于，包括如下步驟:選擇常規(guī)水稻品 種，處理，培育，即得所述水稻雄性不育株系，所述處理為，采用常規(guī)方法，使得水稻中編碼 如SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸序列發(fā)生缺失，變異或抑制，進(jìn)而使得所述氨基酸序列 對(duì)應(yīng)多肽的表達(dá)水平降低或活性喪失。3. 如權(quán)利要求2所述的水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法，其特征在于，所述水稻品種為粳 稻品種9522,或秈稻品種黃花占。4. 如權(quán)利要求2所述的水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法，其特征在于，所述核苷酸序列如 SEQIDN0.2**。5. 如權(quán)利要求2所述的水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法，其特征在于，包括如下步驟:采 用RNAi干擾技術(shù)，抑制或者降低編碼如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO. 2的表達(dá)，降低所述氨基酸序列對(duì)應(yīng)多肽的表達(dá)水平。6. -種如權(quán)利要求1所述的水稻雄性不育基因 TMS10在粳稻和秈稻中保守性的應(yīng)用，其 特征在于，所述應(yīng)用包括如下步驟:通過雜交和回交，篩選出粳稻或秈稻中具有tmslO突變 位點(diǎn)的不育株系。7. -種如權(quán)利要求2所述的水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法獲得的水稻雄性不育株系在 水稻制種中的用途，其特征在于，所述用途包括:將所述水稻雄性不育株系經(jīng)處理后自交結(jié) 實(shí)制種;或者將所述水稻雄性不育株系經(jīng)處理后作為母本，配合具有雜種優(yōu)勢(shì)的父本，生產(chǎn) 雜種F1代，進(jìn)行雜交育種。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法獲得的水稻雄性不育株系在水 稻制種中的用途，其特征在于，將所述水稻雄性不育株系經(jīng)處理后自交結(jié)實(shí)制種中，所述處 理具體為:在水稻雄性不育株系的幼穗發(fā)育期至花藥減數(shù)分裂時(shí)期，保持平均溫度為22~ 24°C，每天光照12-14.5小時(shí)；將所述水稻雄性不育株系經(jīng)處理后作為母本中，所述處理具 體為:在水稻雄性不育株系的幼穗發(fā)育期至花藥減數(shù)分裂時(shí)期，在平均生長(zhǎng)溫度大于28°C 條件下，每天光照12-14.5小時(shí)。9. 一種恢復(fù)水稻雄性不育株系的雄性不育性狀的方法，其特征在于，包括如下步驟:采 用常規(guī)遺傳手段將所述TMS10基因，轉(zhuǎn)入如權(quán)利要求2所述方法獲得的水稻雄性不育株系 中，進(jìn)而使得突變體恢復(fù)野生型表型。10. -種恢復(fù)水稻雄性不育株系的雄性不育性狀的方法，其特征在于，具體包括如下步 驟： (a) 從水稻日本晴BAC克隆中用堿基序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6、SEQ ID No.7 和SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No. 10所示的引物擴(kuò)增出TMS10基因的如SEQ ID NO. 11所示序列片段； (b) 提供攜帶表達(dá)TMS10互補(bǔ)構(gòu)建載體的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105； (c) 將含TMS10互補(bǔ)構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105轉(zhuǎn)入所述 水稻雄性不育株系，培育，即得;其中TMS10互補(bǔ)構(gòu)建含有序列如SEQ ID NO.11所示的核苷 酸。
【文檔編號(hào)】A01H1/02GK105821074SQ201610143681
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年3月14日
【發(fā)明人】張大兵, 梁婉琪, 余君萍, 袁政, 陳明姣, 羅治靖
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)