生產(chǎn)醇的好氧方法
【專利摘要】反應(yīng)混合物，其用于在好氧條件下從碳源生產(chǎn)乙醇和/或乙酸，其中所述混合物包含-處于指數(shù)生長期的第一產(chǎn)乙酸微生物；-游離氧；和-處于穩(wěn)定期的第二產(chǎn)乙酸微生物其中所述第一和第二產(chǎn)乙酸微生物能夠轉(zhuǎn)化碳源為乙酸和/或乙醇。
【專利說明】生產(chǎn)醇的好氧方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及在好氧條件下從碳源生產(chǎn)醇包括高級醇的反應(yīng)混合物和生物技術(shù)方 法。具體而言，所述混合物和方法涉及在氧氣和年輕細(xì)胞存在的情況下生物技術(shù)生產(chǎn)至少 一種醇。
[0002] 發(fā)明背景 生產(chǎn)醇特別是乙醇的生物技術(shù)方法是本領(lǐng)域眾所周知的。特別地，使用產(chǎn)乙酸菌在各 種碳源上來生產(chǎn)乙醇和/或乙酸是眾所周知的。然而，在大部分情況下，生產(chǎn)乙醇僅能在不 存在氧氣的情況下成功進(jìn)行。這一現(xiàn)象至少被Brioukhanov, 2006，Imlay, 2006，Lan, 2013等所證實(shí)，其中顯示產(chǎn)乙酸菌在好氧條件下無法成功生產(chǎn)乙醇。因此，在本領(lǐng)域已知的 目前方法中，包含氧氣的碳底物諸如來自鋼廠的廢氣首先處理以去除氧氣，隨后將其引入 產(chǎn)乙酸細(xì)胞以進(jìn)行乙醇和/或乙酸生產(chǎn)。氧氣分離步驟使得方法花費(fèi)更高且耗時(shí)。此外，在 該分離步驟過程中可能存在原材料的一些損失。
[0003] 因此，本領(lǐng)域存在對在存在氧氣的情況下生產(chǎn)乙醇和/或乙酸的方法的需要。乙醇 可隨后用作用于生產(chǎn)高級碳化合物諸如醇、酸等的原材料。
[0004] 例如，丁醇和高級醇具有若干用途，包括用作燃料。例如，未來丁醇可代替汽油，因 為兩種燃料的能量含量幾乎相同。此外，當(dāng)與乙醇比較時(shí)，丁醇作為替代染料具有若干其他 優(yōu)秀的性質(zhì)。這些包括丁醇具有更高的能量含量，丁醇比乙醇或汽油"揮發(fā)"更低，以及丁醇 相比于乙醇更易運(yùn)輸。由于這些原因及更多原因，已存在對丁醇和/或相關(guān)高級醇的現(xiàn)存有 潛力的市場。丁醇和其他高級醇還可用作工業(yè)溶劑。
[0005] 目前，丁醇和其他高級醇主要從石油制備。這些化合物通過裂解汽油或石油來獲 得，這對于環(huán)境有害。而且，由于這些起始材料的成本將與石油價(jià)格關(guān)聯(lián)，以及未來石油價(jià) 格的預(yù)期增長，因此丁醇和其他高級醇價(jià)格可能也會相對于石油價(jià)格的增長而增長。
[0006] 歷史上(20世紀(jì)初至20世紀(jì)50年代），生物丁醇(biobutanol)在通常用某些產(chǎn)丁醇 細(xì)菌諸如丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)和拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii)的發(fā)酵方法中從玉米和糖蜜制備，所述發(fā)酵方法也產(chǎn)生丙酮和乙醇并且稱 為ABE(丙酮、丁醇、乙醇)發(fā)酵。隨著對綠色能源重新關(guān)注，該方法近來再次流行。然而，"玉 米淀粉丁醇生產(chǎn)"方法需要大量耗能步驟，包括農(nóng)業(yè)玉米作物栽培，玉米粒收獲，玉米粒淀 粉加工，和淀粉至糖至丁醇發(fā)酵。"玉米淀粉丁醇生產(chǎn)"方法還可能消耗與其產(chǎn)物丁醇的能 量值幾乎一樣多的能量。
[0007] Alfol ? Alcohol Process是用于使用有機(jī)錯（organoaluminium)催化劑從乙稀 生產(chǎn)高級醇的方法。反應(yīng)產(chǎn)生直鏈長鏈伯醇(C 2-C28)。該方法使用鋁催化劑來將乙烯寡聚化 并允許產(chǎn)生的烷基被氧化。然而，該方法產(chǎn)生廣譜的醇且維持分布模式。這一不變的模式限 制了生產(chǎn)者僅制備特定醇范圍（其具有最高需求或具有最好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值）的能力。而且，反 應(yīng)中所需的氣體必須非常清潔且對于反應(yīng)成功進(jìn)行需要不同的氣體組成。
[0008] W02009100434還描述了從碳水化合物生產(chǎn)丁醇和己醇的間接方法。該方法包括同 型乙酸發(fā)酵來生產(chǎn)乙酸中間體，其隨后化學(xué)轉(zhuǎn)化為乙醇。乙醇和剩余部分的乙酸中間體隨 后用作產(chǎn)酸發(fā)酵中的底物來產(chǎn)生丁酸和己酸中間體，其隨后化學(xué)轉(zhuǎn)化為丁醇或己醇。然而， 該方法使用昂貴的原材料碳水化合物并具有兩個額外的處理步驟，酯類的形成和酯類的化 學(xué)氫化，其使得方法不僅更長而且還導(dǎo)致沿途有用材料的損失。
[0009] Perez，J.M.，2012公開在合成氣存在的情況下使用揚(yáng)氏梭菌（Clostridium 1 jungdahl i i )將短鏈羧酸轉(zhuǎn)化為其對應(yīng)醇的方法。然而，短鏈羧酸需要作為用于轉(zhuǎn)化為對 應(yīng)高級醇的底物被添加。
[0010] 因此，目前高級醇生產(chǎn)的可用方法具有在氣體底物質(zhì)量轉(zhuǎn)移至發(fā)酵液中的限制、 較低的生產(chǎn)率和較低的終產(chǎn)物濃度，導(dǎo)致產(chǎn)物純化更高的能源成本。
[0011]因此，除了完全基于石油或基于玉米的來源之外，還需要發(fā)現(xiàn)更多可持續(xù)的原材 料作為經(jīng)生物技術(shù)方法生產(chǎn)丁醇和其他高級醇的起始材料，這也導(dǎo)致對環(huán)境更低破壞。具 體而言，存在對于簡單且高效的從可持續(xù)原材料一罐(one-pot)生物技術(shù)生產(chǎn)丁醇和其他 高級醇的需求。
[0012]發(fā)明描述 本發(fā)明通過以下解決了上文提及的問題:提供通過引入處于指數(shù)/對數(shù)生長期的產(chǎn)乙 酸細(xì)胞至包含碳源和氧氣的含水培養(yǎng)基在好氧條件下生產(chǎn)乙醇和高級醇的方法。處于指 數(shù)/對數(shù)生長期的這些產(chǎn)乙酸細(xì)胞的濃度通過本領(lǐng)域已知的任何方法來維持，條件是在含 水培養(yǎng)基中始終存在氧氣。氧氣可以以至少5ppm的濃度存在于含水培養(yǎng)基中。
[0013] 在本發(fā)明的一個方面，提供在好氧條件下從碳源生產(chǎn)乙醇和/或乙酸的反應(yīng)混合 物，其中所述混合物包含 -處于指數(shù)生長期的第一產(chǎn)乙酸微生物； -游離氧;和 -處于指數(shù)期后的第二產(chǎn)乙酸微生物 其中所述第一和第二產(chǎn)乙酸微生物能夠轉(zhuǎn)化碳源為乙酸和/或乙醇。
[0014] 具體而言，處于指數(shù)期后的第二產(chǎn)乙酸微生物可處于細(xì)胞的穩(wěn)定期。處于對數(shù)期 的產(chǎn)乙酸細(xì)胞允許含水培養(yǎng)基中的任何其他產(chǎn)乙酸細(xì)胞在氧氣存在的情況下產(chǎn)生乙酸和/ 或乙醇。處于對數(shù)期的產(chǎn)乙酸細(xì)胞的濃度可以在反應(yīng)混合物中維持。因此，在反應(yīng)中的任何 時(shí)間點(diǎn)，反應(yīng)混合物包含處于對數(shù)期的產(chǎn)乙酸細(xì)胞和處于另一生長期(例如處于穩(wěn)定期）的 產(chǎn)乙酸細(xì)胞。
[0015] 技術(shù)人員將理解微生物的不同生長期和測量它們并鑒定它們的方法。具體而言， 批量培養(yǎng)物中的大多數(shù)微生物可發(fā)現(xiàn)于至少四個不同的生長期；即它們是:延滯期(A)、對 數(shù)期或指數(shù)期（B)、穩(wěn)定期(C)和死亡期(D)。對數(shù)期可以進(jìn)一步分為早對數(shù)期和中至晚對 數(shù)/指數(shù)期。穩(wěn)定期還可以進(jìn)一步區(qū)分為早穩(wěn)定期和穩(wěn)定期。例如，Cotter，J.L.，2009， Najafpour.G.，2006，Younesi, H.，2005，and K6pke, M.，2009公開了產(chǎn)乙酸菌的不 同生長期。具體而言，細(xì)胞的生長期可以使用至少Shuler ML, 1992 and Fuchs G.，2007 中教導(dǎo)的方法來測量。
[0016] 延滯期是接種細(xì)胞入新鮮培養(yǎng)基后緊接著的時(shí)期，種群暫時(shí)維持不變。盡管不存 在明顯的細(xì)胞分裂，但細(xì)胞可以在體積或質(zhì)量上增長，合成酶、蛋白、RNA等，并增加代謝活 性。延滯期的長度可取決于廣泛的因素，包括接種物多少;從轉(zhuǎn)移中的物理損傷或應(yīng)激中恢 復(fù)所需的時(shí)間；合成必需的輔酶或分裂因子所需的時(shí)間；和合成新的（可誘導(dǎo)的）酶所需的 時(shí)間，所述酶對于代謝培養(yǎng)基中存在的底物是必需的。
[0017] 生長的指數(shù)(對數(shù))期是平衡生長的模式，其中所有細(xì)胞通過二分裂規(guī)則分裂，并 以幾何級數(shù)生長。取決于生長培養(yǎng)基的組成和孵育條件，細(xì)胞以恒定速率分裂。細(xì)菌培養(yǎng)物 的指數(shù)生長速率表示為世代時(shí)間，也稱為細(xì)菌群體的倍增時(shí)間。世代時(shí)間(G)定義為每代(n =代數(shù)）的時(shí)間（t)。因此，G=t/n為從其推導(dǎo)世代時(shí)間計(jì)算的公式。指數(shù)期可以進(jìn)一步分為 (i)早對數(shù)期和(ii)中至晚對數(shù)/指數(shù)期。技術(shù)人員可以容易地鑒定何時(shí)微生物特別是產(chǎn)乙 酸菌進(jìn)入對數(shù)期。例如，計(jì)算產(chǎn)乙酸菌的生長速率以確定它們是否處于對數(shù)期的方法可以 使用至少Henstra A.M.，2007中教導(dǎo)的方法來完成。具體而言，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的 處于指數(shù)生長期的微生物可包括處于早對數(shù)期以及中至晚對數(shù)/指數(shù)期的細(xì)胞。
[0018] 穩(wěn)定期是這樣的時(shí)期，其中指數(shù)生長結(jié)束，因?yàn)橹笖?shù)生長無法在批量培養(yǎng)物（例 如，封閉系統(tǒng)諸如試管或燒瓶）中永遠(yuǎn)持續(xù)。種群生長受限于三個因素之一 ：1.可用營養(yǎng)物 的耗盡;2.抑制性代謝物或終產(chǎn)物的積累;3.空間耗盡，在這種情況下稱為"生物空間"的缺 乏。在穩(wěn)定期過程中，如果計(jì)數(shù)活細(xì)胞，無法確定是否一些細(xì)胞死亡且相等數(shù)目的細(xì)胞正在 分裂，或者細(xì)胞群體只是已停止生長和分裂。穩(wěn)定期，如同延滯期，不必須是靜止階段。生產(chǎn) 次級代謝物諸如抗生素的細(xì)菌在生長周期的穩(wěn)定期過程中這樣做(次級代謝物定義為生長 活躍期后產(chǎn)生的代謝物）。
[0019]穩(wěn)定期后是死亡期。在死亡期，活細(xì)胞的數(shù)目呈幾何(指數(shù))降低，基本上是對數(shù)期 過程中生長的逆轉(zhuǎn)。
[0020] 在一個實(shí)例中，其中〇2存在于根據(jù)本發(fā)明的任何方面的反應(yīng)混合物中，第一產(chǎn)乙 酸菌可以處于指數(shù)生長期且其他產(chǎn)乙酸菌可處于產(chǎn)乙酸菌的生命周期的任何其他生長期。 具體而言，根據(jù)本發(fā)明的任何方面，反應(yīng)混合物中的產(chǎn)乙酸菌可以包含處于指數(shù)生長期的 一種產(chǎn)乙酸菌和處于穩(wěn)定期的另一種產(chǎn)乙酸菌。在存在氧氣且不存在處于指數(shù)生長的產(chǎn)乙 酸菌的情況下，處于穩(wěn)定期的產(chǎn)乙酸菌可能不能產(chǎn)生乙酸和/或乙醇。這一現(xiàn)象至少被 Brioukhanov, 2006，Imlay, 2006，Lan, 2013等所證實(shí)。因此，本發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn) 在存在處于指數(shù)生長的產(chǎn)乙酸菌的情況下，處于任何生長期的產(chǎn)乙酸菌可以好氧呼吸并以 多于或等于當(dāng)不存在氧氣時(shí)反應(yīng)混合物產(chǎn)生的量來產(chǎn)生乙酸和/或乙醇。在一個實(shí)例中，處 于指數(shù)生長期的產(chǎn)乙酸菌可以能夠從反應(yīng)混合物去除游離氧，為處于任何生長期的產(chǎn)乙酸 菌提供合適的環(huán)境(無游離氧）以代謝碳底物以產(chǎn)生乙酸和/或乙醇。
[0021] 在另一實(shí)例中，含水培養(yǎng)基在存在碳源的情況下可以已經(jīng)包含處于任何生長期的 產(chǎn)乙酸菌，特別是處于穩(wěn)定期的產(chǎn)乙酸菌。在該實(shí)例中，在供應(yīng)至含水培養(yǎng)基的碳源中或含 水培養(yǎng)基自身中可以存在氧氣。在存在氧氣的情況下，產(chǎn)乙酸菌可以是無活性的并且在添 加處于指數(shù)生長期的產(chǎn)乙酸菌之前不產(chǎn)生乙酸和/或乙醇。在這一實(shí)例中，處于指數(shù)生長期 的產(chǎn)乙酸菌可以添加至含水培養(yǎng)基中。在含水培養(yǎng)基中已發(fā)現(xiàn)的無活性的產(chǎn)乙酸菌可以隨 后被活化并可以開始生產(chǎn)乙酸和/或乙醇。
[0022] 在進(jìn)一步的實(shí)例中，處于任何生長期的產(chǎn)乙酸菌可以首先與處于指數(shù)生長期的產(chǎn) 乙酸菌并隨后與添加的碳源和/或氧氣混合。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的任何方面，在存在氧氣的情況下生長的處于指數(shù)生長期的微生物可 以導(dǎo)致微生物在氧氣存在的情況下獲得適應(yīng)以生長和代謝。具體而言，微生物可以能夠從 微生物周圍的環(huán)境中去除氧氣。這種新獲得的適應(yīng)允許處于指數(shù)生長期的產(chǎn)乙酸菌清除氧 環(huán)境并因此從碳源產(chǎn)生乙酸和乙醇。具體而言，具有新獲得的適應(yīng)的產(chǎn)乙酸菌允許細(xì)菌轉(zhuǎn) 化碳源為乙酸和/或乙醇。
[0024] 在一個實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的反應(yīng)混合物中的產(chǎn)乙酸菌可以包含細(xì)胞 的組合:處于對數(shù)期的細(xì)胞和處于穩(wěn)定期的細(xì)胞。在根據(jù)本發(fā)明的任何方面的方法中，處于 對數(shù)期的產(chǎn)乙酸菌細(xì)胞可以包含選自0.01-2 h-^0.01-1 h-^0.05-1 h-^0.05-2 h-1、 0.05-0.5 IT1等的生長速率。在一個實(shí)例中，反應(yīng)混合物中對數(shù)期產(chǎn)乙酸細(xì)胞的細(xì)胞的OD600 可以選自范圍0.001-2、0.01-2、0.1-1、0.1-0.5等。技術(shù)人員將能夠使用本領(lǐng)域已知的任 何方法來測量0D6QQ并測定反應(yīng)混合物中的和/或待添加至反應(yīng)混合物中的細(xì)胞的生長速 率。例如，可以使用Koch (1994)。具體而言，細(xì)菌生長可以使用不同方法來測定和監(jiān)測。最 常用的之一是濁度測量，其依賴于懸浮液中細(xì)菌的光密度(0D)并使用分光光度計(jì)。0D可以 使用UV分光計(jì)在600 nm處測量。
[0025] 為了維持反應(yīng)混合物中第一和第二產(chǎn)乙酸菌的濃度，技術(shù)人員可以能夠在固定時(shí) 間點(diǎn)提取樣品來測量〇D6Q()、pH、氧濃度和形成的乙醇和/或高級醇的濃度。技術(shù)人員將能夠 添加一種或多種必需組分以維持反應(yīng)混合物中第一和第二產(chǎn)乙酸菌的濃度并確保對于生 產(chǎn)乙醇和/或乙酸維持最佳環(huán)境。
[0026]如本文所用的術(shù)語"產(chǎn)乙酸菌"指這樣的微生物，其能夠進(jìn)行Wood-Ljungdahl途徑 并因此能夠轉(zhuǎn)化⑶、C02和/或氫氣為乙酸。這些微生物包括其野生型形式不具有Wood-Ljungdahl途徑但作為遺傳修飾的結(jié)果已獲得該性狀的微生物。此類微生物包括但不限于 大腸桿菌細(xì)胞。這些微生物還稱為一氧化碳營養(yǎng)菌。目前，本領(lǐng)域已知產(chǎn)乙酸菌的21個不同 的屬(Drake等人，2006)，且這些還可包括一些梭菌(Drake & Kusel，2005)。這些細(xì)菌能 夠使用二氧化碳或一氧化碳作為碳源和氫氣作為能源(Wood，1991)。此外，醇、醛、羧酸以 及許多己糖也可用作碳源(Drake等人，2004)。導(dǎo)致形成乙酸的還原途徑稱為乙酰輔酶A 或 Wood-Ljungdahl 途徑。
[0027] 具體而言，產(chǎn)乙酸菌可選自潮濕厭氧醋菌（Acetoanaerobium notera) (ATCC 35199)、長醋絲菌（Acetonema longum) (DSM 6540)、甲醇醋酸桿菌（Acetobacterium carbinolicum)(DSM 2925)、蘋果酸醋酸桿菌（Acetobacterium malicum (DSM 4132))、醋 酸桿菌屬第446號種（Acetobacterium species no. 446)(Morinaga 等人，1990，J. Biotechnol.，Vol. 14，p. 187-194)、威氏醋酸桿菌（Acetobacterium wieringae)(DSM 1911)、伍氏醋酸桿菌(Acetobacterium woodii) (DSM 1030)、Alkalibaculum bacchi(DSM 22112)、閃爍古生球菌（Archaeoglobus fulgidus) (DSM 4304)、（Blautia producta) (DSM 2950，之前的產(chǎn)生瘤胃球菌（Ruminococcus productus),之前的 Peptostreptococcus productus)、食甲基丁 酉愛桿菌（Butyribacterium methylotrophicum) (DSM 3468)、醋酸梭菌（Clostridium aceticum) (DSM 1496)、產(chǎn)乙醇 梭菌（Clostridium autoethanogenum) (DSM 10061、DSM 19630和DSM 23693)、 Clostridium carboxidivorans(DSM 15243)、Clostridium coskatii (ATCC編號 PTA-10522 )、Clostridium drakei(ATCC BA-623 )、蟻酸醋酸梭菌（Clostridium formicoaceticum) (DSM 92)、乙二醇梭菌（Clostridium glycolicum) (DSM 1288)、揚(yáng)氏 梭菌（Clostridium ljungdahlii) (DSM 13528)、揚(yáng)氏梭菌C-01 (ATCC 55988)、揚(yáng)氏梭菌 ERI-2(ATCC 55380)、揚(yáng)氏梭菌0-52(ATCC 55989)、馬猶姆貝梭菌（Clostridium mayombei) (DSM 6539)、Clostridium methoxybenzovorans (DSM 12182)、Clostridium ragsdalei (DSM 15248)、糞味梭菌（Clostridium scatologenes) (DSM 757)、梭菌屬種ATCC 29797 (Schmidt 等人，1986，Chem. Eng. Commun.，Vol. 45，p. 61-73)、庫氏脫硫腸狀菌 (Desulfotomaculum kuznetsovii) (DSM 6115)、熱苯脫硫腸狀菌thermosyntrophicum亞 種（Desulfotomaculum thermobezoicum subsp. thermosyntrophicum) (DSM 14055)、粘 液真桿菌（Eubacterium limosum) (DSM 20543)、乙酸甲燒八疊球菌（Methanosarcina acetivorans)C2A (DSM 2834)、穆爾氏菌屬種HUC22-l(Moorella sp. HUC22-1) (Sakai 等人，2004，Biotechnol. Let.，Vol. 29，p. 1607-1612)、熱醋穆爾氏菌（Moorella thermoacetica) (DSM 521，之前的Clostridium thermoaceticum)、熱自養(yǎng)穆爾氏菌 (Moorella thermoautotrophica) (DSM 1974)、0xobacter pfennigii (DSM 322)、 Sporomusa aerivorans (DSM I3326)、卵形鼠抱菌（Sporomusa ovata)(DSM 2662)、 Sporomusa silvacetica (DSM 10669)、球形鼠抱菌（Sporomusa sphaeroides) (DSM 2875)、白蟻鼠抱菌（Sporomusa termitida) (DSM 4440)和凱伍熱厭氧菌 (Thermoanaerobacter kivui)(DSM 2030，之前的凱伍產(chǎn)醋菌（Acetogenium kivui))。更 具體而言，可以使用Clostridium carboxidivorans的菌株ATCC BAA-624。甚至更具體而 言，可以使用例如描述于U. S. 2007/0275447和U.S. 2008/0057554的Clostridium carboxidivorans的標(biāo)記為"P7"和"PI 1"的細(xì)菌菌株。
[0028]另一特別合適的細(xì)菌可以是揚(yáng)氏梭菌。具體而言，可以使用選自揚(yáng)氏梭菌PETC、揚(yáng) 氏梭菌ERI2、揚(yáng)氏梭菌C0L和揚(yáng)氏梭菌0-52的菌株來轉(zhuǎn)化合成氣為己酸。這些菌株例如描述 于TO 98/00558、W0 00/68407、ATCC 49587、ATCC 55988 和ATCC 55989。根據(jù)本發(fā)明的任何 方面使用的第一和第二產(chǎn)乙酸菌可以是相同或不同的細(xì)菌。例如，在一種反應(yīng)混合物中，第 一產(chǎn)乙酸菌可以是處于對數(shù)期的揚(yáng)氏梭菌且第二產(chǎn)乙酸菌可以是處于穩(wěn)定期的揚(yáng)氏梭菌。 在另一實(shí)例中，在反應(yīng)混合物中，第一產(chǎn)乙酸菌可以是處于對數(shù)期的揚(yáng)氏梭菌且第二產(chǎn)乙 酸菌可以是處于穩(wěn)定期的Clostridium carboxidivorans。在另一實(shí)例中，第一生物所選的 產(chǎn)乙酸菌可以是產(chǎn)乙醇梭菌。
[0029] 在根據(jù)本發(fā)明的任何方面的反應(yīng)混合物中，可以存在氧氣。有利的是將02摻入反 應(yīng)混合物中和/或作為包括合成氣的最多廢氣供應(yīng)于反應(yīng)混合物的氣流包含少量或大量的 氧氣。在使用合成氣作為碳源用于生產(chǎn)高級醇之前去除該氧氣是困難且昂貴的。根據(jù)本發(fā) 明的任何方面的方法允許生產(chǎn)至少一種高級醇而無需首先從碳源中去除任何痕量的氧氣。 這允許節(jié)約時(shí)間和金錢。
[0030] 更具體而言，氣流中的〇2濃度可以以小于氣流中的氣體總量的1體積％存在。具體 而言，氧氣可以以0.000005-2體積％的濃度范圍存在，以以下范圍存在:0.00005-2體積％、 0.0005-2體積％、0.005-2體積％、0.05-2體積％、0.00005-1.5體積％、0.0005-1.5體積％、 0 ? 005-1 ? 5體積％、0 ? 05-1 ? 5體積％、0 ? 5-1 ? 5體積％、0 ? 00005-1體積％、0 ? 0005-1 體積％、 0.005-1體積％、0.05-1體積％、0.5-1體積％、0.55-1體積％、0.60-1體積％、特別是以 0.60-1.5體積％、0.65-1體積％、和0.70-1體積％的范圍存在。具體而言，當(dāng)氣相/氣流中0 2 的比例相對于氣流中氣體的體積為約0.00005、0.0005、0.005、0.05、0.15、0.5、0.6、0.7、 0.8、0.9、1、1.5、2體積％時(shí)，產(chǎn)乙酸微生物是特別合適的。技術(shù)人員將能夠使用本領(lǐng)域已知 的任一種方法來測量氣流中氧氣的體積濃度。具體而言，氧氣的體積可以使用本領(lǐng)域已知 的任何方法來測量。在一個實(shí)例中，氧氣的氣相濃度可以通過來自PreSens Precision Sensing GmbH的痕量氧氣浸入探頭(dipping probe)來測量。氧氣濃度可以通過焚光猝滅 來測量，其中猝滅程度與氣相中氧分壓相關(guān)。甚至更具體而言，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的第 一和第二微生物當(dāng)氧氣通過氣流以低于供應(yīng)于反應(yīng)混合物的氣流中的總氣體的1體積％的 氧氣濃度、以供應(yīng)于反應(yīng)混合物的氣流中的氣體總體積的約0.015體積％供應(yīng)時(shí)，能夠在含 水培養(yǎng)基中最佳工作。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的任何方面，在反應(yīng)混合物中將碳源轉(zhuǎn)化為乙醇和/或乙酸的好氧條 件指反應(yīng)混合物周圍的氣體。氣體可以包含至少1體積％總氣體的氧氣和包括碳源諸如C0、 C〇2等的其他氣體。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的任何方面的含水培養(yǎng)基可以包含氧氣。氧氣可以通過本領(lǐng)域已知的 任何方式溶解于培養(yǎng)基中。具體而言，氧氣可以在不存在細(xì)胞的情況下以〇.5mg/L存在。具 體而言，含水培養(yǎng)基中游離氧的溶解濃度可以為至少0.01 mg/L。在另一實(shí)例中，溶解氧可以 為約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.511^/1。具體而言，溶解氧濃度可以 為0.01-0.5mg/L、0.01-0.4mg/L、0.01-0.3mg/L、0.01-0 .lmg/L。具體而言，氧氣可以以持續(xù) 氣流提供于含水培養(yǎng)基。更具體而言，含水培養(yǎng)基可以包含氧氣和含有C0和/或C〇2的碳源。 更具體而言，氧氣和含有C0和/或C0 2的碳源以連續(xù)氣流提供于含水培養(yǎng)基。甚至更具體而 言，連續(xù)氣流包含合成氣和氧氣。在一個實(shí)例中，兩種氣體為相同的流(flow/stream)的部 分。在另一實(shí)例中，每一氣體為提供于含水培養(yǎng)基的分開的流(flow/stream)。這些氣體可 以分開，例如使用單獨(dú)的開口在含水培養(yǎng)基內(nèi)的噴嘴、熔料(fri t )、在供應(yīng)氣體至含水培養(yǎng) 基的管內(nèi)的膜等。氧氣可以為游離氧。根據(jù)本發(fā)明的任何方面，'包含游離氧的反應(yīng)混合物' 指包含以〇 2形式的元素氧的反應(yīng)混合物。〇2可以為反應(yīng)混合物中的溶解氧。具體而言，溶解 氧可以為2 5ppm (0.000005體積％; 5xl(T6)的濃度。技術(shù)人員能夠使用本領(lǐng)域已知的任何 方法來測量溶解氧的濃度。在一個實(shí)例中，溶解氧可以通過氧氣浸入探頭(Type PSt6,來自 PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Germany)來測量。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的任何方面，反應(yīng)混合物進(jìn)一步包含 _能夠進(jìn)行乙醇羧酸發(fā)酵途徑并轉(zhuǎn)化乙酸和/或乙醇形成酸的第三微生物;和 其中所述第一和/或第二產(chǎn)乙酸微生物能夠轉(zhuǎn)化酸為相應(yīng)的高級醇。
[0034]在一個實(shí)例中，產(chǎn)乙酸菌可以與第二微生物聯(lián)合使用，所述第二微生物可以能夠 進(jìn)行乙醇-羧酸發(fā)酵途徑。在一個實(shí)例中，可以使用第一和第二產(chǎn)乙酸菌兩者以及可以能夠 進(jìn)行乙醇-羧酸發(fā)酵途徑的第三微生物來從碳源產(chǎn)生高級酸。酸可以隨后轉(zhuǎn)化為選自以下 相應(yīng)的高級醇:丁醇、戊醇、己醇、辛醇、壬醇、癸醇等。在一個實(shí)例中，高級醇可以選自1-丁 醇、2-甲基-1-丁醇、異丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、1-辛醇、1-戊醇、1-庚醇、3-甲基-1-戊 醇、4-甲基-1-己醇、5-甲基-1-庚醇、4-甲基-1-戊醇、5-甲基-1-己醇、6-甲基-1-庚醇及其 組合。
[0035]在一個實(shí)例中，乙醇和/或乙酸可以在存在能夠進(jìn)行乙醇-羧酸發(fā)酵途徑的第三微 生物的情況下轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的高級酸。乙醇-羧酸發(fā)酵途徑詳細(xì)描述于至少Seedorf，H.，等 人，2008。具體而言，第三生物可以選自克氏梭菌（Clostridium kluyveri)、 C.Carboxidivorans等。這些第三微生物包括其野生型形式不具有乙醇-羧酸發(fā)酵途徑但作 為遺傳修飾的結(jié)果已獲得該性狀的微生物。具體而言，第三微生物可以是克氏梭菌。
[0036] 在另一實(shí)例中，第三微生物可以是野生型生物，其表達(dá)選自￡1至￡11的至少一種酶， 其中為Ei醇脫氫酶(adh)，E 2為乙醛脫氫酶(ald)，E3為乙酰乙酰-CoA硫解酶(thl)，E4為3-羥基丁?；?CoA脫氫酶(hbd) 45為3_羥基丁酰基-CoA脫水酶(crt)，E6為丁?；?CoA脫氫酶 (bed)，E7為電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白亞基(etf )，E8為輔酶A轉(zhuǎn)移酶(cat)，Eg為乙酸激酶(ack)，Eio 為磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(pta)且En為轉(zhuǎn)氫酶。具體而言，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的野生型第三微生 物可以表達(dá)至少E 2、E3和E4。甚至更具體而言，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的野生型第三微生物 可以表達(dá)至少E 4。
[0037] 在另一實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的第三微生物可以是遺傳修飾生物，其相 對于野生型微生物具有選自￡1至￡ 11的至少一種酶的增加的表達(dá)，其中為Ei醇脫氫酶 (adh)，E2為乙醛脫氫酶(ald)，E 3為乙酰乙酰-CoA硫解酶（thl)，E4為3-羥基丁?；?CoA脫 氫酶(hbd) 45為3_羥基丁?；?CoA脫水酶(ert)，E6為丁?；?CoA脫氫酶(bed)，E7為電子轉(zhuǎn) 移黃素蛋白亞基（etf)，E 8為輔酶A轉(zhuǎn)移酶(cat)，E9為乙酸激酶(ack)，E1Q為磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶 (pta)且En為轉(zhuǎn)氫酶。具體而言，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的遺傳修飾的第三微生物可以表達(dá) 至少酶E 2、E3和E4。甚至更具體而言，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的遺傳修飾的第三微生物可以 表達(dá)至少E 4。酶￡1至￡11可以分離自克氏梭菌。技術(shù)人員可以能夠使用本領(lǐng)域已知的方法來 測量這些酶的每一種的活性。具體而言，酶活性可以使用至少在Hillmer P.， 1972，Lurz R.，1979中教導(dǎo)的測定法來測量;E2酶的活性也可以使用Smith L.T.，1980 中教導(dǎo)的測定法來測量，酶E3和E4的活性可以使用至少Sliwkowski M.X.，1984中教導(dǎo)的 測定法來測量;E4的活性還可以使用Madan，V.K.，1972中教導(dǎo)的測定法來測量;E5的活性 也可以使用Bartsch，R.G.，1961中教導(dǎo)的測定法來測量;酶E6和E7的活性可以使用Li， F.，2008中教導(dǎo)的測定法來測量;E7的活性還可以使用Chowdhury，2013中教導(dǎo)的測定法 來測量;E8的活性可以使用Stadman，1953中教導(dǎo)的測定法來測量;E9的活性可以使用 Winzer，K.，1997中教導(dǎo)的測定法來測量;E10的活性可以使用Smith L.T.，1976中教導(dǎo) 的測定法來測量;且E11的活性可以使用Wang S，2010中教導(dǎo)的測定法來測量。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明的任何方面，第二和/或第三微生物可以是遺傳修飾的微生物。遺傳修 飾的細(xì)胞或微生物可以在基因上與野生型細(xì)胞或微生物不同。根據(jù)本發(fā)明的任何方面的遺 傳修飾的微生物與野生型微生物之間的遺傳差異可以在于遺傳修飾的微生物中存在完整 基因、氨基酸、核苷酸等，其在野生型微生物中可能不存在。在一個實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的任 何方面的遺傳修飾的微生物可以包含能夠使微生物產(chǎn)生至少一種羧酸的酶。相對于根據(jù)本 發(fā)明的任何方面的遺傳修飾的微生物，野生型微生物可以不具有或者無可檢測的能夠使遺 傳修飾的微生物產(chǎn)生至少一種羧酸的酶的活性。如本文所用，術(shù)語'遺傳修飾的微生物'可 以與術(shù)語'遺傳修飾的細(xì)胞'互換使用。根據(jù)本發(fā)明的任何方面的遺傳修飾可以對微生物的 細(xì)胞進(jìn)行。
[0039] 如本文中與細(xì)胞或微生物聯(lián)合使用的短語"野生型"可指具有處于自然環(huán)境中天 然可見的形式的基因組構(gòu)成的細(xì)胞。該術(shù)語可以適用于完整細(xì)胞或單個基因。因此，術(shù)語 "野生型"不包括這樣的細(xì)胞或這樣的基因，其中基因序列已由人使用重組方法至少部分改 變。
[0040] 技術(shù)人員將能夠使用本領(lǐng)域已知的任何方法來遺傳修飾細(xì)胞或微生物。根據(jù)本發(fā) 明的任何方面，遺傳修飾的細(xì)胞可以被遺傳修飾，使得在定義的時(shí)間間隔中，在2小時(shí)內(nèi)，特 別是在8小時(shí)或24小時(shí)內(nèi)，其相比野生型細(xì)胞產(chǎn)生至少2倍、尤其是至少10倍、至少100倍、至 少1000倍或至少10000倍的羧酸和/或各羧酸酯。產(chǎn)物形成中的增加可以例如通過在合適的 營養(yǎng)培養(yǎng)基中在相同條件下（相同的細(xì)胞密度、相同的營養(yǎng)培養(yǎng)基、相同的培養(yǎng)條件)分別 各自培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞和野生型細(xì)胞持續(xù)特定的時(shí)間間隔并隨后測定營 養(yǎng)培養(yǎng)基中目標(biāo)產(chǎn)物(羧酸)的量來確定。
[0041] 在另一實(shí)例中，酸可以從碳源產(chǎn)生，其通過公開于Steinbusch, 2011，Zhang, 2013, Van Eerten-Jansen, M. C. A. A, 2013, Ding H. et al, 2010, Barker H.A., 1949, Stadtman E.R., 1950, Bornstein B. T.,等人，1948等的任何方法。甚至更具體 而言，酸可以在克氏梭菌存在的情況下從碳源產(chǎn)生。
[0042]甚至更具體而言，根據(jù)本發(fā)明的任何方面，酸在處于兩種不同生長期的至少一種 產(chǎn)乙酸微生物以及克氏梭菌的存在的情況下產(chǎn)生。在一個實(shí)例中，產(chǎn)乙酸微生物可以是揚(yáng) 氏梭菌或拉格斯代爾梭菌(Clostridium ragsdahlei)。新形成的酸在醇存在的情況下可以 轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的高級醇。選自克氏梭菌和C.Carboxidivorans的第三微生物可以轉(zhuǎn)化乙酸和/ 或乙醇以形成新形成的酸。如之前所提及，對于該方法有利的是在〇 2存在的情況下進(jìn)行 (即，在反應(yīng)混合物中包括〇2)，因?yàn)榇蟛糠职ê铣蓺獾膹U氣包含少量或大量的氧氣。該反 應(yīng)混合物允許從廢氣生產(chǎn)高級醇的方法，而不需要經(jīng)歷首先抽取氧氣的額外昂貴步驟。 [0043]反應(yīng)混合物可以包含以均質(zhì)混合物的兩種/三種微生物。如本文所用的術(shù)語"均質(zhì) 混合物"指微生物空間上均勻地分布于培養(yǎng)基中的混合物。具體而言，混合物可以包含至少 兩種微生物，均勻分布于含水培養(yǎng)基中的處于不同生長期的兩種產(chǎn)乙酸微生物。在一個實(shí) 例中，混合物中可以存在大約相同數(shù)目的兩種微生物。在另一個實(shí)例中，混合物中可以存在 相比于處于對數(shù)期的產(chǎn)乙酸微生物更多的處于穩(wěn)定期的產(chǎn)乙酸微生物。在仍另一個實(shí)例 中，混合物中可以存在相比于處于穩(wěn)定期的產(chǎn)乙酸微生物更多的處于對數(shù)期的產(chǎn)乙酸微生 物。在所有可能的實(shí)例中，微生物處于單一的均質(zhì)混合物中，其中它們均勻地分布于混合物 中。如本文所用的"含水培養(yǎng)基"可與術(shù)語"反應(yīng)混合物"互換使用。
[0044]如本文所用的術(shù)語"乙酸(acetate)"指乙酸及其鹽兩者，這是不可避免的結(jié)果，因 為如本領(lǐng)域已知，由于微生物在含水環(huán)境中活動，因此始終存在所存在的鹽和酸之間的平 衡。
[0045]術(shù)語"第二微生物"或"第三微生物"指與根據(jù)本發(fā)明的任何方面的"第一微生物" 不同的微生物。
[0046]在一個實(shí)例中，第一和第二微生物可以存在于第一發(fā)酵罐中而第三微生物可存在 于第二發(fā)酵罐中。在發(fā)酵罐1中，第一和第二微生物與碳源接觸以產(chǎn)生乙酸和/或乙醇。乙醇 和/或乙酸可以隨后與發(fā)酵罐2中的第三微生物接觸以產(chǎn)生至少一種酸。該酸可隨后給料回 發(fā)酵罐1以產(chǎn)生至少一種醇?？梢援a(chǎn)生這樣的循環(huán)，其中發(fā)酵罐1中產(chǎn)生的乙酸和/或乙醇可 以定期給料至發(fā)酵罐2,發(fā)酵罐2中的乙酸和/或乙醇可以轉(zhuǎn)化為至少一種酸且發(fā)酵罐2中的 酸給料回發(fā)酵罐1。
[0047]類似地，在發(fā)酵罐1中，第一和第二微生物可以與包含⑶的碳源接觸以產(chǎn)生乙酸 和/或乙醇。乙醇和/或乙酸可以隨后與發(fā)酵罐2中的第三微生物接觸以產(chǎn)生至少一種酸。酸 隨后任選地提取并給料回發(fā)酵罐1以轉(zhuǎn)化酸為期望的高級醇?？梢援a(chǎn)生這樣的循環(huán)，其中發(fā) 酵罐1中產(chǎn)生的乙酸和/或乙醇可以定期給料至發(fā)酵罐2,發(fā)酵罐2中的乙酸和/或乙醇可以 轉(zhuǎn)化為至少一種酸且發(fā)酵罐2中的酸給料回發(fā)酵罐1。給料至發(fā)酵罐1的CO可以與乙酸和/或 乙醇一同轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐2?？梢圆恍枰囟ǖ奶崛》椒ǎ?yàn)橐蚜钊梭@訝地發(fā)現(xiàn)第三微生物 在C0存在的情況下轉(zhuǎn)化乙酸和/或乙醇為至少一種酸。
[0048]在另一實(shí)例中，培養(yǎng)基在發(fā)酵罐1和2之間循環(huán)。因此，發(fā)酵罐1中產(chǎn)生的乙醇和/或 乙酸可以給料至發(fā)酵罐2且發(fā)酵罐2中產(chǎn)生的酸可以給料回發(fā)酵罐1。在循環(huán)培養(yǎng)基的方法 中，來自發(fā)酵罐1的C0可以引入發(fā)酵罐2中。而且，發(fā)酵罐2中產(chǎn)生的酸可以隨后重新引入發(fā) 酵罐1中。發(fā)酵罐2中的第三微生物可以能夠持續(xù)在從發(fā)酵罐1循環(huán)至發(fā)酵罐2的C0存在的情 況下從乙酸和乙醇產(chǎn)生酸。發(fā)酵罐1和2中積累的醇可隨后通過本領(lǐng)域已知的方法提取。 [0049]在進(jìn)一步的實(shí)例中，可以存在三個容器來進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的任何方面的方法。第 一和第二微生物可以存在于第一發(fā)酵罐中，第三微生物在第二發(fā)酵罐中，且第三發(fā)酵罐中 為第一和第二微生物。在發(fā)酵罐1中，第一和第二微生物與碳源接觸以產(chǎn)生乙酸和/或乙醇。 乙醇和/或乙酸可以隨后與發(fā)酵罐2中的第三微生物接觸以產(chǎn)生至少一種酸。該酸可隨后給 料至發(fā)酵罐3以產(chǎn)生至少一種醇。
[0050] 在從碳源產(chǎn)生酸和/或高級醇中，可以使用細(xì)菌的組合。可以存在多于一種產(chǎn)乙酸 菌與一種或多種第三微生物的組合。在另一實(shí)例中，可以存在多于一種類型的產(chǎn)乙酸菌和 僅一種類型的第三微生物。在仍另一實(shí)例中，可以存在多于一種第三微生物與僅一種產(chǎn)乙 酸菌的組合。
[0051] 如本文所有的術(shù)語"約"指20%內(nèi)的變化。具體而言，如本文所用的術(shù)語"約"指給 定測量值或值的+/- 20%，更具體而言為+/- 10%，甚至更具體而言為+/- 5%。
[0052] 除非另有說明，所有百分比（％)均為體積百分比。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明的任何方面所用的碳源包括二氧化碳和/或一氧化碳。技術(shù)人員將理 解存在許多可能的提供C0和/或C02的來源作為碳源?？梢?，實(shí)際上，作為根據(jù)本發(fā)明的任何 方面的碳源，可以使用能夠?yàn)槲⑸锕?yīng)足量的碳的任何氣體或任何氣體混合物，使得乙 酸和/或乙醇可以從C0和/或C0 2的來源的形成。
[0054] 通常，對于根據(jù)本發(fā)明的任何方面的混合的培養(yǎng)物，碳源包含至少50體積％、至少 70體積％、尤其是至少90體積％的0)和/或C0 2,其中體積百分比-%涉及混合的培養(yǎng)物中第 一微生物可用的所有碳源。
[0055] 在根據(jù)本發(fā)明的任何方面的混合的培養(yǎng)物中，可以提供碳材料來源。氣體形式的 碳源的實(shí)例包括廢氣諸如合成氣、煙道氣和酵母發(fā)酵或梭菌發(fā)酵產(chǎn)生的石油煉廠氣 (petroleum refinery gas)。這些廢氣從含纖維素的材料的氣化或煤氣化形成。在一個實(shí) 例中，這些廢氣可以不一定作為其他方法的副產(chǎn)物產(chǎn)生但可以特別產(chǎn)生以與根據(jù)本發(fā)明的 任何方面的混合的培養(yǎng)物一起使用。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明的任何方面，碳源可以是合成氣。合成氣可以例如作為煤氣化的副產(chǎn) 物產(chǎn)生。因此，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的混合的培養(yǎng)物的微生物可以能夠轉(zhuǎn)化作為廢產(chǎn)物 的物質(zhì)為有價(jià)值的資源。在另一實(shí)例中，合成氣可以是廣泛可得的、低成本的農(nóng)業(yè)原材料氣 化的副產(chǎn)物，以與本發(fā)明的混合的培養(yǎng)物一起使用來產(chǎn)生至少乙醇和/或一種高級醇。
[0057] 存在可以轉(zhuǎn)化為合成氣的很多原材料的實(shí)例，因?yàn)閹缀跛行问降闹脖欢伎梢杂?于該目的。具體而言，原材料選自多年生牧草諸如芒草、玉米殘?jiān)⒓庸U料諸如鋸肩等。
[0058] 通常，合成氣可以在干燥的生物質(zhì)的氣化裝置中獲得，主要經(jīng)熱解、部分氧化和蒸 氣重整，其中合成氣的主要產(chǎn)物為CO、H2和0)2。合成氣（Syngas)也可以是C0 2電解的產(chǎn)物。 技術(shù)人員將理解進(jìn)行C02電解以產(chǎn)生包含期望量的C0的合成氣的合適條件。
[0059]通常，獲自氣化方法的一部分合成氣首先處理以優(yōu)化產(chǎn)品產(chǎn)率并避免形成焦油。 合成氣中不希望的焦油和C0的裂解可以使用石灰和/或白云石來進(jìn)行。這些方法詳細(xì)描述 于例如 Reed, 1981。
[0060] 來源的混合物可以用作碳源。
[0061] 根據(jù)本發(fā)明的任何方面，還原劑例如氫氣可以與碳源一起供應(yīng)。具體而言，當(dāng)供應(yīng) 和/或使用C和/或C02時(shí)，可以供應(yīng)該氫氣。在一個實(shí)例中，氫氣是根據(jù)本發(fā)明的任何方面存 在的合成氣的部分。在另一實(shí)例中，當(dāng)合成氣中的氫氣對于本發(fā)明的方法不足時(shí)，可以供應(yīng) 額外的氫氣。
[0062] 技術(shù)人員將理解進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的任何方面的方法所需的其他條件。具體而言， 容器(發(fā)酵罐）中的條件可以根據(jù)所用的第一和第二微生物而不同。適合于微生物行使最佳 功能的條件的改變在技術(shù)人員的知識內(nèi)。
[0063]在一個實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的方法可以在pH為5_8、5.5-7的含水培養(yǎng) 基中進(jìn)行。壓力可以為1至10巴(bar)。
[0064]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)可以是可以使用多得多的原材料的有利的C02/C0混合物。這些各種 來源包括天然氣、生物氣、煤、油、植物殘?jiān)取７椒ǖ牧硪粌?yōu)點(diǎn)可以是高碳產(chǎn)率。這通過返 回形成的C02而變得可能。即，C0 2可以在第一階段中反應(yīng)回到乙酸。
[0065]另一優(yōu)點(diǎn)可在于關(guān)于所用的發(fā)酵條件更大的靈活性，因?yàn)槿魏萎a(chǎn)乙酸微生物和能 夠進(jìn)行乙醇-羧酸發(fā)酵途徑的任何微生物可以組合使用用于實(shí)際生產(chǎn)高級醇。本發(fā)明的另 一優(yōu)點(diǎn)可以是第三微生物在C0存在的情況下可以行使功能和/或從乙酸和/或乙醇生產(chǎn)酸， 第一、第二和第三微生物均可以存在于均質(zhì)混合物中用于從包含C0的碳源生產(chǎn)高級醇。第 三微生物的該特點(diǎn)使得從碳源如C0生產(chǎn)高級醇成為一步方法，使得方法更有效且產(chǎn)率更 高。令人驚奇地，由于第三微生物的這一優(yōu)點(diǎn)，制備高級醇的一步程序可以在單一發(fā)酵罐中 進(jìn)行而無中間分離步驟。使用該一步程序還可以增加終產(chǎn)物的濃度。這是令人驚訝的，因?yàn)?Baffert C.，2011 and Thauer, R.K., 1973均教導(dǎo)氫化酶在C0存在的情況下被抑制。對 于這一原因和更多原因，W02013/167663包括了在(a)在產(chǎn)乙酸生物存在的情況下從⑶和/ 或C0 2形成乙酸和/或乙醇的步驟與(b)在第二微生物存在的情況下形成包含至少一個氧原 子的烴(例如，己酸)步驟之間的分離步驟。在根據(jù)本發(fā)明的任何方面從C0在一罐合成中產(chǎn) 生醇尤其是包含至少6個碳原子的醇的能力因此是令人驚訝的結(jié)果。在任何情況下，即使步 驟(a)和(b)在兩個分開的步驟(即兩個不同容器）中進(jìn)行，可能不存在對于去除所有痕量的 C0以使第一和第三微生物行使功能的任何特定提取步驟的需要。
[0066] 如實(shí)例中可見，存在C0允許在根據(jù)本發(fā)明的任何方面的方法(其中碳源至少包含 C0)中產(chǎn)生至少丁醇和己醇。
[0067] 根據(jù)本發(fā)明的任何方面，碳源包含⑶。包含⑶的碳源在存在至少第一和第二產(chǎn)乙 酸微生物和能夠在好氧條件下進(jìn)行乙醇-羧酸發(fā)酵途徑的第三微生物的情況下可以轉(zhuǎn)化為 至少一種酸。具體而言，酸可包含4個或更多個碳原子。更具體而言，形成的酸可以選自丁 酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸等。具體而言，包含C0的碳源在第一和第二產(chǎn)乙酸菌 存在的情況下可以導(dǎo)致產(chǎn)生乙醇和/或乙酸。
[0068] 具體而言，C0可以在持續(xù)氣流中提供于含水培養(yǎng)基。氣流中的C0濃度可以以氣流 中氣體總量體積的至少2體積％存在。具體而言，C0可以以2-99體積％的濃度范圍存在，以 2-95體積％、5-95體積％、10-90體積％、15-85體積％的范圍，特別是20-80體積％的范圍存 在。更具體而言，C0的濃度可以為約24體積％。碳源中一氧化碳的氣相濃度可以使用具有熱 電導(dǎo)檢測器的Agilent Technologies Inc.的至少氣相色譜GC 6890N來測量。
[0069] 具體而言，含水培養(yǎng)基可以包含含有C0和/或C02的碳源。更具體而言，含有C0和/ 或C02的碳源在連續(xù)氣流中提供于含水培養(yǎng)基。甚至更具體而言，連續(xù)氣流包含合成氣。在 一個實(shí)例中，氣體為相同的流(flow/stream)的部分。在另一實(shí)例中，每一氣體為提供于含 水培養(yǎng)基的分開的流(f 1 ow/strearn)。這些氣體可以例如使用單獨(dú)的開口在含水培養(yǎng)基內(nèi) 的噴嘴、熔料(frit)、在供應(yīng)氣體至含水培養(yǎng)基的管內(nèi)的膜。
[0070] 在根據(jù)本發(fā)明的任何方面的一個實(shí)例中，碳源為合成氣且碳源可以與氧氣摻合， 隨后供應(yīng)至含水培養(yǎng)基。該摻合步驟可以改善效率和反應(yīng)中高級醇的產(chǎn)生。本發(fā)明的方法 的總體效率、醇生產(chǎn)率和/或總體碳捕獲可以取決于連續(xù)氣流中〇) 2、〇)、出和02的化學(xué)計(jì)量。 施加的連續(xù)氣流可以組成為〇2、C〇2和H2。具體而言，在連續(xù)氣流中，0 2的濃度范圍可以在 0.000005體積%至1體積％，⑶/C02為約10-50體積％，尤其是33體積％，且H 2將在44體積％至 84體積％，尤其64-66.04體積％。更具體而言，連續(xù)氣流中氣體濃度可以為0.15體積％的 〇 2，32體積％的0)/0)2和64體積％的出。在另一實(shí)例中，連續(xù)氣流還可以包含惰性氣體如N2， 高至50體積％的他濃度。
[0071] 技術(shù)人員將理解可能必須以相關(guān)間隔檢測流的組成和流速?？刂屏鞯慕M成可以通 過改變組分流的比例以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)或期望的組成。摻合的流的組成和流速可以通過本領(lǐng)域已 知的任何方法來監(jiān)測。在一個實(shí)例中，系統(tǒng)適合于持續(xù)監(jiān)測至少兩種流的流速和組成并將 它們組合以產(chǎn)生最佳組成的持續(xù)氣流中的單一摻合底物流，和將最佳底物流傳送至根據(jù)本 發(fā)明的任何方面的混合培養(yǎng)物的方法。
[0072] 具體而言，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的反應(yīng)混合物（即第一微生物一處于對數(shù)期的 產(chǎn)乙酸生物、第二微生物一處于穩(wěn)定期的產(chǎn)乙酸生物、在存在氧氣的情況下的碳源)可以在 任何已知的生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐中利用來進(jìn)行本發(fā)明的任何方面。反應(yīng)混合物可以進(jìn)一步 包含第三微生物以導(dǎo)致發(fā)酵罐中產(chǎn)生高級醇。
[0073] 如本文所用的'高級醇'指含有4-10個碳原子的醇并可以是稍微粘性的或油狀的， 并具有較重的水果香味。高級醇可以包括但不限于丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇 等。更具體而言，高級醇可以選自1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、異丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、 1-辛醇、1-戊醇、1-庚醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇、5-甲基-1-庚醇、4-甲基-1-戊醇、 5-甲基-1-己醇、6-甲基-1-庚醇及其組合。
[0074] 根據(jù)本發(fā)明的任何方面，'相應(yīng)的高級醇'指具有與相應(yīng)高級醇從中形成的酸相同 數(shù)目的碳原子的醇。例如，丁酸可以轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇一丁醇；己酸可以轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇一己 醇;庚酸可以轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇一庚醇;辛酸可以轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇一辛醇;壬酸可以轉(zhuǎn)化為相 應(yīng)的醇一壬醇;癸酸可以轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇一癸醇等等。
[0075] 根據(jù)本發(fā)明的任何方面的方法可以進(jìn)一步包括提取產(chǎn)生的高級醇的步驟?；诒?領(lǐng)域已知的方法，技術(shù)人員將知曉這樣做的手段。
[0076]根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，在好氧條件下從碳源生產(chǎn)乙醇和/或乙酸的方法，所述 方法包括 (a)接觸反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含 一處于指數(shù)生長期的第一產(chǎn)乙酸微生物； 一游離氧;和 一處于穩(wěn)定期的第二產(chǎn)乙酸微生物 其中所述第一和第二產(chǎn)乙酸微生物能夠轉(zhuǎn)化碳源為乙酸和/或乙醇。
[0077]根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，在好氧條件下從碳源生產(chǎn)至少一種高級醇的方法，所 述方法包括 (a)在好氧條件下使根據(jù)本發(fā)明的任何方面的反應(yīng)混合物與碳源接觸。
[0078] 附圖簡述 無附圖。 實(shí)施例
[0079] 上文描述了優(yōu)選的實(shí)施方案，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，其可以進(jìn)行設(shè)計(jì)、構(gòu)建 或操作上的改變和變化，而不偏離權(quán)利要求書的范圍。這些改變例如旨在被權(quán)利要求書的 范圍所覆蓋。
[0080] 實(shí)施例1 用揚(yáng)氏梭菌從無氧氣的合成氣生產(chǎn)乙酸和乙醇 在該實(shí)施例中，將揚(yáng)氏梭菌在復(fù)合培養(yǎng)基中與合成氣（由出和〇)2組成)在不存在氧氣 的情況下厭氧培養(yǎng)以產(chǎn)生乙酸和乙醇。對于揚(yáng)氏梭菌的細(xì)胞培養(yǎng)，將2 mL的冷凍培養(yǎng)物 (Cryoculture)在具有約400 mg/L L-鹽酸半脫氛酸和400 mg/L Na〗S x 9 H2O的200 ml培 養(yǎng)基(ATCC1754培養(yǎng)基：pH 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L酵母提取物，0.8 g/L NaCl，1 g/L NH4CI，0.1 g/L KC1, 0.1 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgS〇4 x 7 H20; 0.02 g/L CaCl2 X 2H20; 20 mg/L次氮基三乙酸 10 mg/L MnS〇4 x H2O; 8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H2O; 2 mg/L C0CI2 x 6 H2O; 2 mg/L ZnS〇4 x 7 H2O; 0.2 mg/L C11CI2 x 2 H2O; 0.2 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O; 0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O; 0.2 mg/L Na2Se〇4; 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H20; 20 yg/L d-生物素，20 yg/L葉酸，100 g/L鹽酸吡哆醇；50 yg/L鹽酸硫胺素x H20; 50 yg/L 核黃素；50 yg/L煙酸，50 yg/L 泛酸鈣；1 yg/L 維生素B12 ; 50 yg/L 對氨基苯甲酸；50 yg/L硫辛酸，約67.5 mg/L NaOH)中厭氧培養(yǎng)。培養(yǎng)在防火1L玻璃瓶 中用由6 7 % H 2， 3 3 % C 0 2構(gòu)成的預(yù)混合氣體混合物化能自養(yǎng) (chemolithoautotrophically)進(jìn)行，其處于37°C，150 rpm的開放水浴搖床中且具有1-3 L/h的熏蒸持續(xù)161小時(shí)。氣體進(jìn)入培養(yǎng)基通過具有10微米孔徑的濾器進(jìn)行，且所述濾器固 定在反應(yīng)器中央于通氣管處。將細(xì)胞離心，用10 ml ATCC培養(yǎng)基洗滌并再次離心。
[0081] 對于預(yù)培養(yǎng)，將來自揚(yáng)氏梭菌的生長培養(yǎng)物的許多經(jīng)洗滌的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至具有約 400 mg/L L-鹽酸半胱氨酸的200 mL ATCC培養(yǎng)基中并生長至0.12的0D6QQ。培養(yǎng)在耐壓 500ml玻璃瓶中用由67% H2，33% C02構(gòu)成的預(yù)混合氣體混合物進(jìn)行，其處于37°C，150 rpm的開放水浴搖床中且具有3 L/h的通氣持續(xù)65小時(shí)。氣體進(jìn)入培養(yǎng)基通過具有10微米孔 徑的濾器進(jìn)行，其放置于反應(yīng)器中央。將細(xì)胞離心，用10 ml生產(chǎn)緩沖液(pH 6.2; 0.5 g/L 的K0H，用67% H2、33% C02的預(yù)混氣體混合物以1 L/hr通氣1小時(shí))洗滌并再次離心。
[0082]對于生產(chǎn)培養(yǎng)，將來自揚(yáng)氏梭菌的預(yù)培養(yǎng)物的許多經(jīng)洗滌的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至具有約 400 mg/L L-鹽酸半胱氨酸的200 mL ATCC培養(yǎng)基中并生長至0.2的0D6Q()。培養(yǎng)在耐壓500ml 玻璃瓶中用由67% H2、33% C02構(gòu)成的預(yù)混合氣體混合物進(jìn)行，其處于37 °C，150 rpm的開 放水浴搖床中且具有3 L/h的通氣持續(xù)118小時(shí)。氣體進(jìn)入培養(yǎng)基通過具有10微米孔徑的濾 器進(jìn)行，其放置于反應(yīng)器中央。當(dāng)pH降至低于5.0,加入1 ml 140 g/1 K0H溶液。當(dāng)取樣時(shí)， 移取各5 ml樣品用于測定0D_、pH和產(chǎn)物范圍。產(chǎn)物濃度的測定通過半定量1 H-NMR光譜學(xué) 進(jìn)行。三甲基甲硅烷基丙酸鈉(T (M) SP)用作內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)品。
[0083]隨118小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)期，生產(chǎn)培養(yǎng)物中的細(xì)胞密度保持恒定，其可通過停滯的OD600 為0.2來識別，對應(yīng)于y = 0 hf1的生長速率。乙酸濃度同時(shí)從4 mg / L至3194 mg / L且乙 醇濃度從17 mg / L至108 mg / L顯著增加。
[0084] 實(shí)施例2 用揚(yáng)氏梭菌從包含C02和出與氧氣的合成氣中不產(chǎn)生乙酸和乙醇 將揚(yáng)氏梭菌在復(fù)合培養(yǎng)基中用合成氣和氧氣培養(yǎng)。將揚(yáng)氏梭菌在存在合成氣（由H2和 C02組成)且不存在氧氣的情況下首先培養(yǎng)以產(chǎn)生乙酸和乙醇。對于培養(yǎng)，細(xì)胞生長在耐壓 玻璃瓶中，所述玻璃瓶可以用丁基橡膠塞氣密密封。揚(yáng)氏梭菌細(xì)胞涉及的所有步驟均在厭 氧條件下進(jìn)行。
[0085] 對于揚(yáng)氏梭菌的細(xì)胞培養(yǎng)，將2 mL的冷凍培養(yǎng)物(Cryoculture)在具有約400 mg/ L L-鹽酸半胱氨酸和400 mg/L Na2S x 9 H20的200 ml培養(yǎng)基(ATCC1754培養(yǎng)基：pH 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L酵母提取物，0.8 g/L NaCl，1 g/L NH4CI，0.1 g/L KC1，0.1 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgS〇4 x 7 H2O; 0.02 g/L CaCl2 X 2H20; 20 mg/L次氮基三乙酸 10 mg/L MnS〇4 x H20; 8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H20; 2 mg/L CoCl2 x 6 H20; 2 mg/L ZnS〇4 x 7 H2O; 0.2 mg/L CuCh x 2 H2O; 0.2 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O; 0.2 mg/L NiCh x 6 H2O; 0.2 mg/L Na2Se〇4; 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H2O; 20 yg/L d-生物素，20 yg/L 葉酸，100 g/L鹽酸吡咳醇；50 yg/L鹽酸硫胺素x H2O; 50 yg/L核黃素；50 yg/L煙 酸，50 yg/L泛酸|丐；1 yg/L維生素B12 ; 50 yg/L對氨基苯甲酸；50 yg/L硫辛酸， 約67.5 11^/1似01〇中厭氧培養(yǎng)。培養(yǎng)在防火11玻璃瓶中用由67%112、33%(：02構(gòu)成的預(yù)混合 氣體混合物化能自養(yǎng)(chemolithoautotrophically)進(jìn)行，其處于37°C、150 rpm的開放水 浴搖床中且具有1-3 L/h的熏蒸持續(xù)161小時(shí)。氣體進(jìn)入培養(yǎng)基通過具有10微米孔徑的濾器 進(jìn)行，且所述濾器固定在反應(yīng)器中央于通氣管處。將細(xì)胞離心，用10 ml ATCC培養(yǎng)基洗滌并 再次離心。
[0086] 對于預(yù)培養(yǎng)，將來自揚(yáng)氏梭菌的生長培養(yǎng)物的許多經(jīng)洗滌的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至具有約 400 mg/L L-鹽酸半胱氨酸的200 mL ATCC培養(yǎng)基中并生長至0.12的0D6QQ。培養(yǎng)在耐壓 500ml玻璃瓶中用由67% H2，33% C02構(gòu)成的預(yù)混合氣體混合物進(jìn)行，其處于37 °C，150 rpm的開放水浴搖床中且具有3 L/h的通氣持續(xù)24小時(shí)。隨后，氣體混合物改變?yōu)榫哂?66.85% H2、33% C02和0.15% 02的組成的氣體混合物且細(xì)胞以3 L/h進(jìn)一步通氣67小時(shí)。氣 體進(jìn)入培養(yǎng)基通過具有10微米孔徑的Begasungsfritte進(jìn)行，其放置于反應(yīng)器中央于分布 器(sparger)處。將細(xì)胞離心，用10 ml ATCC培養(yǎng)基洗滌并再次離心。氣體進(jìn)入培養(yǎng)基通過 具有10微米孔徑的濾器進(jìn)行，其放置于反應(yīng)器中央。將細(xì)胞離心，用10 ml ATCC培養(yǎng)基洗滌 并再次離心。
[0087]對于生產(chǎn)培養(yǎng)，將來自揚(yáng)氏梭菌的預(yù)培養(yǎng)物的許多經(jīng)洗滌的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至具有約 400 mg/L L-鹽酸半胱氨酸的200 mL ATCC培養(yǎng)基中并生長至0.1的0D6Q()。培養(yǎng)在耐壓500ml 玻璃瓶中用由66.85% H2、33% C02和0.15% 02構(gòu)成的預(yù)混合氣體混合物進(jìn)行，其處于37 °C、 150 rpm的開放水浴搖床中且具有3 L/h的通氣持續(xù)113小時(shí)。氣體進(jìn)入培養(yǎng)基通過具有10 微米孔徑的濾器進(jìn)行，其放置于反應(yīng)器中央。當(dāng)取樣時(shí)，移取各5 ml樣品用于測定0D6QQ、pH 和產(chǎn)物范圍。產(chǎn)物濃度的測定通過半定量1 H-NMR光譜學(xué)進(jìn)行。三甲基甲硅烷基丙酸鈉(T (M) SP)用作內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)品。
[0088] 在89小時(shí)至113小時(shí)的時(shí)期中，未顯示出可識別的細(xì)胞生長。0D6Q()穩(wěn)定在0.29，對 應(yīng)于生長速率y = 0 1T1。在該時(shí)間過程中乙酸濃度從89.4 mg/L略微增加至86.9 mg/L且乙 醇濃度從16.2 mg/L降至11.9 mg / L。
[0089] 實(shí)施例3 在存在包含C02和0.15%氧氣的合成氣的情況下處于對數(shù)期的揚(yáng)氏梭菌的培養(yǎng) 揚(yáng)氏梭菌從進(jìn)料的氣相外給料出和0)2,并形成乙酸和乙醇。對于培養(yǎng)，可以使用耐壓 玻璃瓶，所述玻璃瓶可以用丁基橡膠塞氣密密封。其中揚(yáng)氏梭菌細(xì)胞涉及的所有培養(yǎng)步驟 均在厭氧條件下進(jìn)行。
[0090] 對于揚(yáng)氏梭菌的細(xì)胞培養(yǎng)，將5 mL的冷凍培養(yǎng)物在具有約400 mg/L L-鹽酸半胱 氨酸和400 mg/L Na2S x 9 H20的500 ml培養(yǎng)基（ATCC1754培養(yǎng)基：pH 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L酵母提取物，0.8 g/L NaCl，1 g/L NH4CI，0.1 g/L KC1，0.1 g/L KH2P〇4，0.2 g/L MgS〇4 x 7 H2O; 0.02 g/L CaCl2 X 2H20; 20 mg/L次氮基三乙酸 10 mg/L MnS〇4 x H2O; 8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H2O; 2 mg/L C0CI2 x 6 H2O; 2 mg/L ZnS〇4 x 7 H2O; 0.2 mg/L C11CI2 x 2 H2O; 0.2 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O; 0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O; 0.2 mg/L Na2Se〇4; 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H2O; 20 yg/L d-生物素，20 yg/L 葉酸，100 g/L 鹽酸吡咳醇；50 yg/L鹽酸硫胺素x H2O; 50 yg/L核黃素；50 yg/L煙酸，50 yg/L泛 酸1丐；11^凡維生素1312;5〇1^/1對氨基苯甲酸；5〇1^/1硫辛酸，約67.5 11^/1 NaOH)中厭氧培養(yǎng)。培養(yǎng)在防火1L玻璃瓶中用由67% H2、33% C02構(gòu)成的預(yù)混合氣體混合物化 能自養(yǎng)(chemolithoautotrophically)進(jìn)行，其處于37°C、100 rpm的開放水浴搖床中且具 有3 L/h的熏蒸持續(xù)72小時(shí)。氣體進(jìn)入培養(yǎng)基通過具有10微米孔徑的濾器進(jìn)行，且所述濾器 固定在反應(yīng)器中央于通氣管處。將細(xì)胞離心，用10 ml ATCC培養(yǎng)基洗滌并再次離心。
[0091] 對于主要培養(yǎng)，將來自揚(yáng)氏梭菌的生長培養(yǎng)物的許多經(jīng)洗滌的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至具有約 400 mg/L L-鹽酸半胱氨酸的500 mL ATCC培養(yǎng)基中并生長至0.1的0D6Q()。培養(yǎng)在耐壓1 L玻 璃瓶中用由66.85% H2、33% C02、0.15% 02構(gòu)成的預(yù)混合氣體混合物進(jìn)行，其處于37 °C、150 rpm的開放水浴搖床中且具有1 L/h的通氣持續(xù)45小時(shí)。氣體進(jìn)入培養(yǎng)基通過具有10微米孔 徑的濾器進(jìn)行，其放置于反應(yīng)器中央。當(dāng)取樣時(shí)，移取各5 ml樣品用于測定OD600 nm、pH和產(chǎn) 物范圍。產(chǎn)物濃度的測定通過半定量1 H-匪R光譜學(xué)進(jìn)行。三甲基甲硅烷基丙酸鈉(T (M) SP)用作內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)品。
[0092] 在培養(yǎng)期過程中，顯示顯著的細(xì)胞生長，其通過OD600 nm從0.10至0.54的增加所證 實(shí)，對應(yīng)于生長速率y = 0.037 h -、乙酸濃度同時(shí)從9.6 mg / L增加至3,304 mg / L且乙 醇濃度從2.2 mg / L增加至399 mg / L。
[0093] 實(shí)施例4 在存在包含CO和0.1%氧氣的合成氣的情況下處于對數(shù)期的揚(yáng)氏梭菌的培養(yǎng) 將揚(yáng)氏梭菌在復(fù)合培養(yǎng)基中用合成氣（由C0、H2和C〇2組成)在存在氧氣的情況下自養(yǎng) 培養(yǎng)以產(chǎn)生乙酸和乙醇。
[0094]使用由以下組成的復(fù)合培養(yǎng)基：1 g/L NH4C1，0.1 g/L KC1，0.2 g/L MgS〇4 x 7 H2O，0.8 g/L NaCl，0.1 g/L KH2PO4，20 mg/L CaCl2 x 2 H2O，20 g/L MES, 1 g/L酵母 提取物，0.4 g/L L-鹽酸半胱氨酸，0.4 g/L Na2S x 9 H20, 20 mg/L次氮基三乙酸，10 mg/L MnS〇4 x H20，8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H20，2 mg/L CoCl2 x 6 H20，2 mg/L ZnS04 x 7 H2O, 0.2 mg/L CuCl2 x 2 H20, 0.2 mg/L Na2Mo04 x 2 H20, 0.2 mg/L NiCl2 x 6 H20, 0.2 mg/L Na2Se〇4, 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H20, 20 yg/L生物素，20 yg/L葉酸， 100 yg/L鹽酸吡哆醇，50 yg/L鹽酸硫胺素x H20，50 yg/L核黃素，50 yg/L煙酸，50 yg/L泛酸媽，1 yg/L維生素 B12, 50 yg/L對氨基苯甲酸，50 yg/L硫辛酸。
[0095]自養(yǎng)培養(yǎng)在500 mL培養(yǎng)基中于1 L血清瓶中進(jìn)行，所述血清瓶持續(xù)用由67.7% C0、 3.5% H2和15.6% C02組成的合成氣以3.6 L/h的速率通氣。通過具有10 ym的孔徑的微氣泡 分散器（microbubble disperser)將氣體引入液相中。血清瓶在來自New Brunswick Scientific的開放式水浴Innova 3100中在37 °C和120 mirf1的搖動速率下持續(xù)搖動。 [0096] 不控制pH。
[0097]在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，將揚(yáng)氏梭菌以0.1的Oof?用在H2/C02上自養(yǎng)生長的細(xì)胞接種。因此， 揚(yáng)氏梭菌在具有500 mL復(fù)合培養(yǎng)基的1L血清瓶中在用由67%出和33% C02組成的合成氣以3 L/h的速率持續(xù)通氣下生長于復(fù)合培養(yǎng)基中。上述培養(yǎng)基也用于該培養(yǎng)。通過具有10 ym的 孔徑的微氣泡分散器(microbubble disperser)將氣體引入液相中。血清瓶在來自New Brunswick Scientific的開放式水浴Innova 3100中在37 °C和150 mirf1的搖動速率下持 續(xù)搖動。在OD.為0.49的對數(shù)期且pH為5.03時(shí)通過厭氧離心（4500 min-\ 4300 g，20°C， 10 min)收獲細(xì)胞。棄去上清液并將沉淀重懸于上述10 mL培養(yǎng)基中。該細(xì)胞懸浮液隨后用 于接種培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。一氧化碳的氣相濃度如下測量:對氣相取樣并通過具有熱電導(dǎo)檢測器的 Agilent Technologies Inc.的氣相色譜GC 6890N離線分析。氧氣的氣相濃度可以通過來 自PreSens Precision Sensing GmbH的痕量氧氣浸入探頭(dipping probe)來測量。氧氣 濃度通過熒光猝滅來測量，而猝滅程度與氣相中氧分壓相關(guān)。氧氣測量指示所用的合成氣 中0.1體積％的〇2濃度。
[0098] 在實(shí)驗(yàn)過程中，取5 mL樣品用于測定0D6Q()、pH和產(chǎn)物濃度。后者通過定量1H-NMR-光譜學(xué)來測定。
[0099]接種揚(yáng)氏梭菌后，細(xì)胞開始以0,062 1T1的生長速率y生長，且持續(xù)生產(chǎn)乙酸直至 94.5小時(shí)后6.2 g/L的濃度。伴隨生產(chǎn)乙酸，乙醇以相比于乙酸生產(chǎn)較低的速率生產(chǎn)直至 94.5小時(shí)后1 g/L的濃度。
表1.實(shí)施例4的結(jié)果(n.d.=未檢測到）。
[0100] 實(shí)施例5 通過揚(yáng)氏梭菌在具有2 %氧氣的合成氣上生長和乙酸產(chǎn)生 對于生物轉(zhuǎn)化氫氣和二氧化碳為乙酸，在具有氧氣的合成氣上培養(yǎng)同型產(chǎn)乙酸菌揚(yáng)氏 梭菌。所有培養(yǎng)步驟在厭氧條件下在可以用丁基橡膠塞氣密封閉的耐壓玻璃瓶中進(jìn)行。
[0101] 對于預(yù)培養(yǎng)，用5 mL揚(yáng)氏梭菌的冰凍的冷凍原種接種具有額外400 mg/L L-鹽酸 半胱氨酸和400 mg/L Na2S x 9 H20的500 ml培養(yǎng)基(ATCC1754培養(yǎng)基：pH 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L酵母提取物，0.8 g/L NaCl，1 g/L NH4CI，0.1 g/L KC1，0.1 g/L KH2P〇4， 0.2 g/L MgS〇4 x 7 H2O; 0.02 g/L CaCl2 X 2H20; 20 mg/L次氮基三乙酸 10 mg/L MnS〇4 x H2O; 8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H2O; 2 mg/L C0CI2 x 6 H2O; 2 mg/L ZnS〇4 x 7 H2O; 0.2 mg/L CuCh x 2 H2O; 0.2 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O; 0.2 mg/L NiCh x 6 H2O; 0.2 mg/L Na2Se〇4; 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H2O; 20 yg/L d-生物素，20 yg/L 葉酸，100 yg/L鹽酸吡咳醇；50 yg/L鹽酸硫胺素X H2〇; 50 yg/L核黃素；50 yg/L煙酸，50 yg/ !^泛酸|丐；1此凡維生素1312;50此凡對氨基苯甲酸；50狀凡硫辛酸，約67.5 11^/ L NaOH)?；茏责B(yǎng)培養(yǎng)在1L耐壓玻璃瓶中在37°C、100 rpm下和3 L/h的通氣速率用具有 67% H2、33% C02的預(yù)混氣體在開放水浴搖床中進(jìn)行72小時(shí)。將氣體經(jīng)具有10 ym的孔徑的 分布器排放至培養(yǎng)基中，所述分布器固定在反應(yīng)器的中央。培養(yǎng)在無pH控制下進(jìn)行。
[0102] 預(yù)培養(yǎng)后，將細(xì)胞懸浮液離心（10 min，4200 rpm)并將沉淀用10 ml培養(yǎng)基洗滌 并再次離心。對于主要培養(yǎng)物，將必需數(shù)量的來自預(yù)培養(yǎng)物的經(jīng)洗滌的細(xì)胞以0.1的〇D600nm 轉(zhuǎn)移至具有額外400 mg/L L-鹽酸半胱氨酸的200 mL培養(yǎng)基?；茏责B(yǎng)培養(yǎng)在250 mL耐壓 玻璃瓶中在37°C、150 rpm下和1 L/h的通氣速率用具有65% H2、33% C〇2、2%〇2的預(yù)混氣體在 開放水浴搖床中進(jìn)行47小時(shí)。將氣體經(jīng)具有10 ym的孔徑的分布器排放至培養(yǎng)基中，所述分 布器固定在反應(yīng)器的中央。培養(yǎng)在無pH控制下進(jìn)行。培養(yǎng)過程中，取若干5 mL樣品來測定 0D6QQnm、pH和產(chǎn)物形成。產(chǎn)物濃度的測定通過半定量1H-WR光譜學(xué)進(jìn)行。三甲基甲硅烷基丙 酸鈉（T(M)SP)用作內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)品。還通過氧氣浸入探頭（具有0xy4Trace的PSt6， Presens，Germany)在線測量培養(yǎng)基中的溶解氧。
[0103] 在培養(yǎng)期過程中，通過OD6QQnmW〇.ll增加至0.32觀察到細(xì)胞生長，其與y = 0.022 h 4的生長速率相關(guān)。乙酸濃度從8 mg/L增加至91 mg/L、沒有觀察到乙醇濃度的增加。在培 養(yǎng)期過程中，溶解氧濃度在0.06-0.15 mg/L之間變化。
[0104]在具有相同參數(shù)(培養(yǎng)基組成、體積、瓶、氣體、通氣速率、溫度、搖動頻率）的相似 技術(shù)設(shè)定(但培養(yǎng)基中無細(xì)胞)中，測量到0.50 mg/L的溶解氧濃度。
[0105] 實(shí)施例6 通過揚(yáng)氏梭菌在具有0.15%氧氣的合成氣上生長和乙酸產(chǎn)生 對于生物轉(zhuǎn)化氫氣和二氧化碳為乙酸，在具有氧氣的合成氣上培養(yǎng)同型產(chǎn)乙酸菌揚(yáng)氏 梭菌。所有培養(yǎng)步驟在厭氧條件下在可以用丁基橡膠塞氣密封閉的耐壓玻璃瓶中進(jìn)行。
[0106] 對于預(yù)培養(yǎng)，用5 mL揚(yáng)氏梭菌的冰凍的冷凍原種接種具有額外400 mg/L L-鹽酸 半胱氨酸和400 mg/L Na2S x 9 H20的500 ml培養(yǎng)基(ATCC1754培養(yǎng)基：pH 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L酵母提取物，0.8 g/L NaCl，1 g/L NH4CI，0.1 g/L KC1，0.1 g/L KH2P〇4， 0.2 g/L MgS〇4 x 7 H2O; 0.02 g/L CaCl2 X 2H20; 20 mg/L次氮基三乙酸 10 mg/L MnS〇4 x H2O; 8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H2O; 2 mg/L C0CI2 x 6 H2O; 2 mg/L ZnS〇4 x 7 H2O; 0.2 mg/L CuCh x 2 H2O; 0.2 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O; 0.2 mg/L NiCh x 6 H2O; 0.2 mg/L Na2Se〇4; 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H2O; 20 yg/L d-生物素，20 yg/L 葉酸，100 yg/L鹽酸吡咳醇；50 yg/L鹽酸硫胺素X H2〇; 50 yg/L核黃素；50 yg/L煙酸，50 yg/ !^泛酸|丐；1此凡維生素1312;50此凡對氨基苯甲酸；50狀凡硫辛酸，約67.5 11^/ L NaOH)?；茏责B(yǎng)培養(yǎng)在1L耐壓玻璃瓶中在37°C、100 rpm下和3 L/h的通氣速率用具有 67% H2、33% C02的預(yù)混氣體在開放水浴搖床中進(jìn)行72小時(shí)。將氣體經(jīng)具有10 ym的孔徑的分 布器排放至培養(yǎng)基中，所述分布器固定在反應(yīng)器的中央。培養(yǎng)在無pH控制下進(jìn)行。
[0107] 預(yù)培養(yǎng)后，將細(xì)胞懸浮液離心（10 min，4200 rpm)并將沉淀用10 ml培養(yǎng)基洗滌 并再次離心。對于主要培養(yǎng)物，將必需數(shù)量的來自預(yù)培養(yǎng)物的經(jīng)洗滌的細(xì)胞以0.1的〇D600nm 轉(zhuǎn)移至具有額外400 mg/L L-鹽酸半胱氨酸的200 mL培養(yǎng)基?；茏责B(yǎng)培養(yǎng)在250 mL耐壓 玻璃瓶中在37°C、150 rpm下和1 L/h的通氣速率用具有66.85% H2、33% C〇2、0.15%〇2的預(yù)混 氣體在開放水浴搖床中進(jìn)行47小時(shí)。將氣體經(jīng)具有10 ym的孔徑的分布器排放至培養(yǎng)基中， 所述分布器固定在反應(yīng)器的中央。培養(yǎng)在無pH控制下進(jìn)行。培養(yǎng)過程中，取若干5 mL樣品來 測定0D6QQnm、pH和產(chǎn)物形成。產(chǎn)物濃度的測定通過半定量1H-NMR光譜學(xué)進(jìn)行。三甲基甲硅烷 基丙酸鈉（T(M)SP)用作內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)品。還通過氧氣浸入探頭（具有0xy4Trace的PSt6， Presens，Germany)在線測量培養(yǎng)基中的溶解氧。
[0108] 在培養(yǎng)期過程中，通過0D6QQnJA0.10增加至0.45觀察到細(xì)胞生長，其與y = 0.032 h 的生長速率相關(guān)。乙酸濃度從7 mg/L增加至2347 mg/L且乙醇濃度從2 mg/L增加至319 mg/L。在整個培養(yǎng)期，溶解氧濃度為0.00 mg/L。
[0109] 在具有相同參數(shù)(培養(yǎng)基組成、體積、瓶、氣體、通氣速率、溫度、搖動頻率）的相似 技術(shù)設(shè)定(但培養(yǎng)基中無細(xì)胞)中，測量到0.03 mg/L的溶解氧濃度。
[0110] 實(shí)施例7 揚(yáng)氏梭菌和克氏梭菌在確定成分培養(yǎng)基中在氫氣和二氧化碳上的共培養(yǎng) 揚(yáng)氏梭菌作為第一微生物在確定成分培養(yǎng)基中自養(yǎng)培養(yǎng)以產(chǎn)生乙酸和乙醇。給定時(shí)間 后，克氏梭菌作為第二生物隨后接種在相同反應(yīng)器中用于轉(zhuǎn)化乙酸和乙醇為丁酸和己酸。 隨后，揚(yáng)氏梭菌然后轉(zhuǎn)化丁酸為丁醇。
[0111] 使用確定成分培養(yǎng)基用于兩種微生物的共培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基由以下組成：2 g/L (NH4)2HP〇4, 0.2 g/L NaCl, 0.15 g/1 KC1, 1 g/1 KOH, 0.5 g/L MgCl2 x 6 H20, 0.2 g/L CaCl2 x 2 H20, 15 mg/L FeCl2 x 4 H20, 0.4 g/L L-鹽酸半胱氨酸，0.4 g/L Na2S x 9 H2O, 3 mg/L硼酸，2 mg/L C0CI2 x 6 H2O，1 mg/L ZnS〇4 x 7 H2O，0.3 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O, 0.3 mg/L MnS04 x H2O, 0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O, 0.1 mg/L CuCl2 x 2 H2O, 0.1 mg/L Na2Se〇3, 106 yg/L生物素，5 yg/L葉酸，2.5 yg/L鹽酸吡咳醇，266 yg/L鹽酸硫胺素x H20, 12.5 yg/L葉黃素，12.5yg/L鹽酸，413 yg/L泛酸?丐， 12.5 yg/L維生素B12，12.5 yg/L對氨基苯甲酸，15 yg/L硫辛酸。
[0112] 自養(yǎng)培養(yǎng)在250 mL確定成分培養(yǎng)基中于500 L血清瓶中進(jìn)行，所述血清瓶持續(xù)用 由67% H2和33% C02組成的合成氣以1 L/h的速率通氣。通過具有10 ym的孔徑的微氣泡分散 器（microbubble disperser)將氣體引入液相中。血清瓶在來自New Brunswick Scientific的開放式水浴Innova 3100中在37 °C和150 mirf1的搖動速率下持續(xù)搖動。通過 持續(xù)加入K0H的厭氧儲備溶液(40 g/L)將pH保持在pH 5.0 - 6.5的范圍。
[0113] 在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，將揚(yáng)氏梭菌以0.1的0D6QQ用自養(yǎng)生長的細(xì)胞接種。因此，揚(yáng)氏梭菌 在具有500 mL復(fù)合培養(yǎng)基的1L血清瓶中在用由67%出和33% C02組成的合成氣以3 L/h的速 率持續(xù)通氣下生長于復(fù)合培養(yǎng)基中。使用由以下組成的復(fù)合培養(yǎng)基g/L NH4C1，0.1 g/ L KC1，0.2 g/L MgS〇4 x 7 H2O，0.8 g/L NaCl，0.1 g/L KH2PO4，20 mg/L CaCl2 x 2 H20，20 g/L MES，1 g/L酵母提取物，0.4 g/L L-鹽酸半胱氨酸，0.4 g/L Na2S x 9 H2O，20 mg/L次氮基三乙酸，10 mg/L MnS〇4 x H2O，8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H2O，2 mg/L C0CI2 x 6 H2O，2 mg/L ZnS〇4 x 7 H2O，0.2 mg/L C11CI2 x 2 H2O，0.2 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O，0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O，0.2 mg/L Na2Se〇4, 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H20, 20 yg/L生物素，20 yg/L葉酸，100 yg/L鹽酸吡哆醇，50 yg/L鹽酸硫胺素x H20， 50 yg/L核黃素，50 yg/L煙酸，50 yg/L泛酸媽，1 yg/L維生素B12, 50 yg/L對氨基苯 甲酸，50 yg/L硫辛酸。通過具有10 ym的孔徑的微氣泡分散器將氣體引入液相中。血清瓶 在來自New Brunswick Scientific的開放式水浴Innova 3100中在37 °C和150 min-1 的搖 動速率下持續(xù)搖動。在〇D6QQ為0.67的晚對數(shù)期且pH為4.69時(shí)通過厭氧離心（4500 min-1， 4300 g，20°C，10 min)收獲細(xì)胞。棄去上清液并將沉淀重懸于上述10 mL確定成分培養(yǎng)基 中。該細(xì)胞懸浮液隨后用于接種共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
[0114] 與此平行，將克氏梭菌異養(yǎng)生長于500 mL血清瓶中的200 mL復(fù)合培養(yǎng)基中乙酸和 乙醇上。使用由以下組成的復(fù)合培養(yǎng)基:0.25 g/L NH4C1，0.2 g/L MgSCk x 7 H20, 0.31 g/L K2HPO4, 0.23 g/L KH2PO4, 2.5 g/L NaHCOs, 1 g/L酵母提取物，10 g/L乙酸鉀，20 g/1乙醇，0.25 g/L L-鹽酸半胱氨酸，1.5 mg/L FeCb x 4 H2O，70 yg/L ZnCl2 x 7 H2O，100 yg/L MnCl2 x 4 H2O，6 yg/L硼酸，190 yg/L C0CI2 x 6 H2O，2 yg/L C11CI2 x 6 H2O，24 yg/L NiCl2 x 6 H2O，36 yg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O，3 yg/L Na2Se003 x 5 H2O，4 yg/L Na2W〇4 x 2 H2O，100 yg/L 維生素B12, 80 yg/ L對氨基苯甲酸，20 yg/L生物素，200 yg/L煙酸，100 yg/L泛酸鈣，300 yg/L鹽酸吡哆 醇，200 yg/L鹽酸硫胺素x H2O。血清瓶在來自New Brunswick Scientific的開放式水浴 Innova 3100中在37 °C和100 mirT1的搖動速率下持續(xù)搖動。在OD6(x)為0.81的晚對數(shù)期且pH 為5.96時(shí)通過厭氧離心（4500 min-\ 4300 g，20°C，10 min)收獲細(xì)胞。棄去上清液并將 沉淀重懸于上述10 mL確定成分培養(yǎng)基中。運(yùn)行實(shí)驗(yàn)96小時(shí)后，隨后將該細(xì)胞懸浮液用于以 0.2的OD600接種共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
[0115] 在實(shí)驗(yàn)過程中，取5 mL樣品用于測定0D6Q()、pH和產(chǎn)物濃度。后者通過定量1H-NMR-光譜學(xué)來測定。
[0116]接種揚(yáng)氏梭菌后，細(xì)胞開始生長并持續(xù)產(chǎn)生乙酸。伴隨生產(chǎn)乙酸，乙醇以相比于乙 酸生產(chǎn)較低的速率生產(chǎn)。96小時(shí)后，然后將克氏梭菌接種入反應(yīng)器中，在以下實(shí)驗(yàn)中測量乙 醇濃度的降低。然后在實(shí)驗(yàn)隨后的113小時(shí)中測量丁酸（最大1163 mg/L)和己酸(最大136 mg/L)的同時(shí)生產(chǎn)。與通過克氏梭菌生產(chǎn)丁酸平行，揚(yáng)氏梭菌轉(zhuǎn)化丁酸為丁醇至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí) 20 mg/L丁醇的最大濃度。
表2.實(shí)施例7的結(jié)果(n.d.=未檢測到）。
[0117] 實(shí)施例8 揚(yáng)氏梭菌和克氏梭菌在復(fù)合培養(yǎng)基中用含C0的氣體的共培養(yǎng) 揚(yáng)氏梭菌作為第一生物在復(fù)合培養(yǎng)基中自養(yǎng)培養(yǎng)以產(chǎn)生乙酸和乙醇。給定時(shí)間后，克 氏梭菌作為第二生物隨后接種在相同反應(yīng)器中用于轉(zhuǎn)化乙酸和乙醇為丁酸和己酸。隨后， 揚(yáng)氏梭菌然后轉(zhuǎn)化丁酸為丁醇并轉(zhuǎn)化己酸為己醇。
[0118] 使用由以下組成的復(fù)合培養(yǎng)基用于共培養(yǎng)兩種微生物：1 g/L NH4C1，0.1 g/L KC1, 0.2 g/L MgSCk x 7 H2O，0.8 g/L NaCl，0.1 g/L KH2PO4，20 mg/L CaCl2 x 2 H2O，20 g/L MES，1 g/L酵母提取物，0.4 g/L L-鹽酸半胱氨酸，0.4 g/L Na2S x 9 H2O，20 mg/L次氮基三乙酸，10 mg/L MnSCk x H2O，8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H2O，2 mg/L C0CI2 x 6 H2O, 2 mg/L ZnS04 x 7 H2O, 0.2 mg/L CuCl2 x 2 H2O, 0.2 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O，0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O，0.2 mg/L Na2Se〇4, 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H20, 20 yg/L生物素，20 yg/L葉酸，100 yg/L鹽酸吡哆醇，50 yg/L鹽酸硫胺素x H20， 50 yg/L核黃素，50 yg/L煙酸，50 yg/L泛酸媽，1 yg/L維生素B12, 50 yg/L對氨基苯 甲酸，50 yg/L硫辛酸。
[0119] 自養(yǎng)培養(yǎng)在500 mL復(fù)合培養(yǎng)基中于1 L血清瓶中進(jìn)行，所述血清瓶持續(xù)用由5 % H2、25 % C02、25 % C0和45% N2組成的合成氣以~12 L/h U〇.5ppm)的速率通氣。通過具有 10 ym的孔徑的微氣泡分散器將氣體引入液相中。血清瓶在來自New Brunswick Scientific的開放式水浴Innova 3100中在37 °C和120 mirf1的搖動速率下持續(xù)搖動。在該 實(shí)驗(yàn)過程中不控制pH。
[0120] 在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，將揚(yáng)氏梭菌以0.1的0D6QQ用自養(yǎng)生長的細(xì)胞接種。因此，揚(yáng)氏梭菌 在具有500 mL復(fù)合培養(yǎng)基的1L血清瓶中在用由67%出和33% C02組成的合成氣以3 L/h的速 率持續(xù)通氣下生長于上述復(fù)合培養(yǎng)基中。通過具有10 ym的孔徑的微氣泡分散器將氣體引 入液相中。血清瓶在來自New Brunswick Scientific的開放式水浴Innova 3100中在37 °C 和150 mirT1的搖動速率下持續(xù)搖動。在0D6(x)為0.51的晚對數(shù)期且pH為5.04時(shí)通過厭氧離心 (4500 min-\ 4300 g，20°C，10 min)收獲細(xì)胞。棄去上清液并將沉淀重懸于10 mL上述確 定成分培養(yǎng)基中。該細(xì)胞懸浮液隨后用于接種共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
[0121] 與此平行，將克氏梭菌異養(yǎng)生長于500 mL血清瓶中的200 mL復(fù)合培養(yǎng)基中乙酸和 乙醇上。使用由以下組成的復(fù)合培養(yǎng)基:0.25 g/L NH4C1，0.2 g/L MgSCk x 7 H20, 0.31 g/L K2HPO4, 0.23 g/L KH2PO4, 2.5 g/L NaHCOs, 1 g/L酵母提取物，10 g/L乙酸鉀，20 g/1乙醇，0.25 g/L L-鹽酸半胱氨酸，1.5 mg/L FeCb x 4 H2O，70 yg/L ZnCl2 x 7 H2O，100 yg/L MnCl2 x 4 H2O，6 yg/L硼酸，190 yg/L C0CI2 x 6 H2O，2 yg/L C11CI2 x 6 H2O，24 yg/L NiCl2 x 6 H2O，36 yg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O，3 yg/L Na2Se003 x 5 H2O，4 yg/L Na2W〇4 x 2 H2O，100 yg/L 維生素B12, 80 yg/ L對氨基苯甲酸，20 yg/L生物素，200 yg/L煙酸，100 yg/L泛酸鈣，300 yg/L鹽酸吡哆 醇，200 yg/L鹽酸硫胺素x H2O。血清瓶在來自New Brunswick Scientific的開放式水浴 Innova 3100中在37 °C和100 mirT1的搖動速率下持續(xù)搖動。在0D6(x)為0.54的晚對數(shù)期且pH 為6.60時(shí)通過厭氧離心（4500 min-\ 4300 g，20°C，10 min)收獲細(xì)胞。棄去上清液并將 沉淀重懸于10 mL上述確定成分培養(yǎng)基中。運(yùn)行實(shí)驗(yàn)240小時(shí)后，隨后將該細(xì)胞懸浮液用于 接種共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
[0122] 在實(shí)驗(yàn)過程中，取5 mL樣品用于測定0D6Q()、pH和產(chǎn)物濃度。后者通過定量1H-NMR-光譜學(xué)來測定。
[0123] 接種揚(yáng)氏梭菌后，細(xì)胞開始生長并持續(xù)產(chǎn)生乙酸至71小時(shí)后~3 g/L的濃度并產(chǎn) 生乙醇至71小時(shí)后~0.5 g/L的濃度。在實(shí)驗(yàn)的隨后時(shí)間過程中，乙酸在240小時(shí)后完全轉(zhuǎn)化 為乙醇直至4.8 g/L的濃度。在240小時(shí)的處理時(shí)間時(shí)，將克氏梭菌隨后接種入反應(yīng)器。由于 該生物除乙醇外還需要乙酸作為底物，因此接種克氏梭菌的同時(shí)，將大約3 g/L的乙酸（以 乙酸鈉的形式)厭氧加入反應(yīng)器。在實(shí)驗(yàn)的隨后時(shí)間過程中，測量丁酸和己酸的產(chǎn)生直至各 自1.6 g/L的濃度。與通過克氏梭菌生產(chǎn)丁酸和己酸平行，揚(yáng)氏梭菌轉(zhuǎn)化丁酸為丁醇至690 mg/L丁醇的最大濃度并轉(zhuǎn)化己酸至己醇至1478 mg/L己醇的最大濃度。
表3.實(shí)施例8的結(jié)果(n.d.=未檢測到）。
[0124] 實(shí)施例9 通過Clostridium carboxidivorans在具有0.05%氧氣的合成氣上生長和生產(chǎn)乙酸及 其他化合物 對于生物轉(zhuǎn)化氫氣和二氧化碳為乙酸和其他化合物，在具有氧氣的合成氣上培養(yǎng)同型 產(chǎn)乙酸菌Clostridium carboxidivorans。所有培養(yǎng)步驟在厭氧條件下在可以用丁基橡膠 塞氣密封閉的耐壓玻璃瓶中進(jìn)行。
[0125] 對于預(yù)培養(yǎng)，用5 mL揚(yáng)氏梭菌的冰凍的冷凍原種接種具有額外400 mg/L L-鹽酸 半胱氨酸和400 mg/L Na2S x 9 出0的500 ml培養(yǎng)基(ATCC1754培養(yǎng)基：pH 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L酵母提取物，0.8 g/L NaCl，1 g/L NH4CI，0.1 g/L KC1，0.1 g/L KH2PO4， 0.2 g/L MgS〇4 x 7 H2O; 0.02 g/L CaCl2 X 2H2O; 20 mg/L次氮基三乙酸 10 mg/L MnSCk x H2O; 8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H2O; 2 mg/L C0CI2 x 6 H2O; 2 mg/L ZnS〇4 x 7 H20; 0.2 mg/L CuCl2 x 2 H20; 0.2 mg/L Na2Mo04 x 2 H20; 0.2 mg/L NiCl2 x 6 H20; 0.2 mg/L Na2Se〇4; 0.2 mg/L Na2W04 x 2 H2O; 20 yg/L d-生物素，20 yg/L 葉酸，100 yg/L鹽酸吡咳醇；50 yg/L鹽酸硫胺素X H2〇; 50 yg/L核黃素；50 yg/L煙酸，50 yg/ !^泛酸|丐；1此凡維生素1312;50此凡對氨基苯甲酸；50狀凡硫辛酸，約67.5 11^/ L NaOH)?；茏责B(yǎng)培養(yǎng)在1L耐壓玻璃瓶中在37°C、100 rpm下和3 L/h的通氣速率用具有 60%出、20% C〇2和20% C0的預(yù)混氣體在開放水浴搖床中進(jìn)行71小時(shí)。將氣體經(jīng)具有10 ym的 孔徑的分布器排放至培養(yǎng)基中，所述分布器固定在反應(yīng)器的中央。培養(yǎng)在無pH控制下進(jìn)行。
[0126] 預(yù)培養(yǎng)后，將細(xì)胞懸浮液離心（10 min，4200 rpm)并將沉淀用新鮮培養(yǎng)基重懸。 對于主要培養(yǎng)物，將必需數(shù)量的來自預(yù)培養(yǎng)物的細(xì)胞以0.2的0D_nm轉(zhuǎn)移至200 mL復(fù)合培養(yǎng) 基(ATCC1754)和平行轉(zhuǎn)移至200 mL礦物培養(yǎng)基(DM4-培養(yǎng)基：pH = 6.00，0.5 g/L MgCl2 X 6 H20，0.2 g/L CaCl2 X 2 H20，15 mg/L FeCh X 4 H20，2 g/L (NH4)H2P〇4，0.2 g/L NaCl, 0.15 g/L KC1, 3 mg/L H3BO3, 2 mg/L C0CI2 x 6 H2O, 1 mg/L ZnS04 x 7 H2O, 300 yg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O, 300 yg/L MnS04 x H2O, 200 yg/L NiCl2 x 6 H2O, 100 yg/ L CuCl2 x 2 H20, 100 yg/L Na2Se03, 106 yg/L d-生物素，5 yg/L 葉酸，2.5 yg/L鹽 酸P比咳醇，266 yg/L鹽酸硫胺素，12.5 yg/L核黃素，12.5 yg/L煙酸，413 yg/L泛酸 鈣，12.5 yg/L維生素B12，12.5 yg/L對氨基苯甲酸，15.0 yg/L硫辛酸，約1.3 g/L KOH)，所述培養(yǎng)基各自具有額外400 mg/L L-鹽酸半胱氨酸?；茏责B(yǎng)培養(yǎng)在1 L耐壓玻璃 瓶中在37°C、150 rpm下和1 L/h的通氣速率用具有66.95% H2、33% C02、和0.05% 02的預(yù)混 氣體在開放水浴搖床中進(jìn)行40小時(shí)。將氣體經(jīng)具有10 ym的孔徑的分布器排放至頂空，所述 分布器固定在反應(yīng)器的中央。培養(yǎng)在無pH控制下進(jìn)行。培養(yǎng)過程中，取若干5 mL樣品來測定 OD6QQnm、pH和產(chǎn)物形成。產(chǎn)物濃度的測定通過半定量1H-WR光譜學(xué)進(jìn)行。三甲基甲硅烷基丙 酸鈉（T(M)SP)用作內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)品。還通過氧氣浸入探頭（具有0xy4Trace的PSt6， Presens，Germany)在線測量培養(yǎng)基中的溶解氧。
[0127] 在培養(yǎng)期過程中，通過OD6Q()nJA〇.20增加至0.36觀察到復(fù)合培養(yǎng)基中細(xì)胞生長，其 與y = 0.015 h <的生長速率相關(guān)。在礦物培養(yǎng)基中，0D6Q()nmW0.20降低至0.19。在復(fù)合培 養(yǎng)基中，乙酸濃度從29 mg/L增加至280 mg/L，乙醇濃度從3 mg/L增加至82 mg/L，丁酸濃度 從0 mg/L增加至29 mg/L且丁醇濃度從0 mg/L增加至10 mg/L。在礦物培養(yǎng)基中，乙酸濃度 從25 mg/L增加至110 mg/L，乙醇濃度從3 mg/L增加至5 mg/L，且丁酸濃度從0 mg/L增加至 2 mg/L。在整個培養(yǎng)期，兩種培養(yǎng)物中溶解氧濃度均為0.00 mg/L。在具有相同參數(shù)(培養(yǎng)基 組成、體積、瓶、氣體、通氣速率、溫度、搖動頻率）的相似技術(shù)設(shè)定(但培養(yǎng)基中無細(xì)胞）中， 在兩種培養(yǎng)基中測量到〇. 01 mg/L的溶解氧濃度。
[0128] 實(shí)施例10 通過產(chǎn)乙醇梭菌在具有0.05%氧氣的合成氣上生長和生產(chǎn)乙酸及乙醇 對于生物轉(zhuǎn)化氫氣和二氧化碳為乙酸和乙醇，在具有氧氣的合成氣上培養(yǎng)同型產(chǎn)乙酸 菌產(chǎn)乙醇梭菌。所有培養(yǎng)步驟在厭氧條件下在可以用丁基橡膠塞氣密封閉的耐壓玻璃瓶中 進(jìn)行。
[0129] 對于預(yù)培養(yǎng)，用5 mL產(chǎn)乙醇梭菌的冰凍的冷凍原種接種具有額外400 mg/L L-鹽 酸半胱氨酸和400 mg/L Na2S x 9 H20的500 ml培養(yǎng)基(ATCC1754培養(yǎng)基：pH 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L酵母提取物，0.8 g/L NaCl, 1 g/L NH4CI，0.1 g/L KC1，0.1 g/L KH2P〇4， 0.2 g/L MgS〇4 x 7 H2O; 0.02 g/L CaCl2 X 2H20; 20 mg/L次氮基三乙酸 10 mg/L MnS〇4 x H2O; 8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H2O; 2 mg/L C0CI2 x 6 H2O; 2 mg/L ZnS〇4 x 7 H2O; 0.2 mg/L CuCh x 2 H2O; 0.2 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O; 0.2 mg/L NiCh x 6 H2O; 0.2 mg/L Na2Se〇4; 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H2O; 20 yg/L d-生物素，20 yg/L 葉酸，100 yg/L鹽酸吡咳醇；50 yg/L鹽酸硫胺素X H2〇; 50 yg/L核黃素；50 yg/L煙酸，50 yg/ !^泛酸|丐；1此凡維生素1312;50此凡對氨基苯甲酸；50狀凡硫辛酸，約67.5 11^/ L NaOH)?；茏责B(yǎng)培養(yǎng)在1L耐壓玻璃瓶中在37°C、100 rpm下和3 L/h的通氣速率用具有 67% H2、33% C02的預(yù)混氣體在開放水浴搖床中進(jìn)行72小時(shí)。將氣體經(jīng)具有10 ym的孔徑的分 布器排放至培養(yǎng)基中，所述分布器固定在反應(yīng)器的中央。培養(yǎng)在無pH控制下進(jìn)行。
[0130] 預(yù)培養(yǎng)后，將細(xì)胞懸浮液離心（10 min, 4200 rpm)并將沉淀用新鮮培養(yǎng)基重懸。 對于主要培養(yǎng)物，將必需數(shù)量的來自預(yù)培養(yǎng)物的細(xì)胞以0.1的〇D6QQnm轉(zhuǎn)移至具有額外400 mg/L L-鹽酸半胱氨酸的500 mL培養(yǎng)基?；茏责B(yǎng)培養(yǎng)在1 L耐壓玻璃瓶中在37°C、150 rpm 下和1 L/h的通氣速率用具有66.95% H2、33% C02、和0.05% 02的預(yù)混氣體在開放水浴搖床 中進(jìn)行41小時(shí)。將氣體經(jīng)具有10 ym的孔徑的分布器排放至培養(yǎng)基中，所述分布器固定在反 應(yīng)器的中央。培養(yǎng)在無pH控制下進(jìn)行。培養(yǎng)過程中，取若干5 mL樣品來測定ODsoon^pH和產(chǎn)物 形成。產(chǎn)物濃度的測定通過半定量1H-NMR光譜學(xué)進(jìn)行。三甲基甲硅烷基丙酸鈉(T(M)SP)用 作內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)品。還通過氧氣浸入探頭（具有0xy4Trace的PSt6, Presens, Germany)在 線測量培養(yǎng)基中的溶解氧。
[0131] 在培養(yǎng)期過程中，通過小時(shí)內(nèi)從0.08增加至0.76觀察到細(xì)胞生長，其與 y = 0.054 h 4的生長速率相關(guān)。乙酸濃度同時(shí)從37 mg/L增加至6600 mg/L且乙醇濃度從4 mg/L增加至120 mg/L。在整個培養(yǎng)期，溶解氧濃度為0.00 mg/L。
[0132] 在具有相同參數(shù)(培養(yǎng)基組成、體積、瓶、氣體、通氣速率、溫度、搖動頻率）的相似 技術(shù)設(shè)定(但培養(yǎng)基中無細(xì)胞)中，測量到〇.〇1 mg/L的溶解氧濃度。
[0133] 實(shí)施例11 通過揚(yáng)氏梭菌在具有0.6%氧氣的合成氣上生長和乙酸產(chǎn)生 對于生物轉(zhuǎn)化氫氣和二氧化碳為乙酸，在具有氧氣的合成氣上培養(yǎng)同型產(chǎn)乙酸菌揚(yáng)氏 梭菌。所有培養(yǎng)步驟在厭氧條件下在可以用丁基橡膠塞氣密封閉的耐壓玻璃瓶中進(jìn)行。
[0134] 對于預(yù)培養(yǎng)，用5 mL揚(yáng)氏梭菌的冰凍的冷凍原種接種具有額外400 mg/L L-鹽酸 半胱氨酸和400 mg/L Na2S x 9 H20的500 ml培養(yǎng)基(ATCC1754培養(yǎng)基：pH 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L酵母提取物，0.8 g/L NaCl，1 g/L NH4CI，0.1 g/L KC1，0.1 g/L KH2P〇4， 0.2 g/L MgS〇4 x 7 H2O; 0.02 g/L CaCl2 X 2H20; 20 mg/L次氮基三乙酸 10 mg/L MnS〇4 x H2O; 8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H2O; 2 mg/L C0CI2 x 6 H2O; 2 mg/L ZnS〇4 x 7 H2O; 0.2 mg/L CuCh x 2 H2O; 0.2 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O; 0.2 mg/L NiCh x 6 H2O; 0.2 mg/L Na2Se〇4; 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H2O; 20 yg/L d-生物素，20 yg/L 葉酸，100 yg/L鹽酸吡咳醇；50 yg/L鹽酸硫胺素X H2〇; 50 yg/L核黃素；50 yg/L煙酸，50 yg/ !^泛酸|丐；1此凡維生素1312;50此凡對氨基苯甲酸；50狀凡硫辛酸，約67.5 11^/ L NaOH)?；茏责B(yǎng)培養(yǎng)在1L耐壓玻璃瓶中在37°C、100 rpm下和3 L/h的通氣速率用具有 67% H2、33% C02的預(yù)混氣體在開放水浴搖床中進(jìn)行72小時(shí)。將氣體經(jīng)具有10 ym的孔徑的分 布器排放至培養(yǎng)基中，所述分布器固定在反應(yīng)器的中央。培養(yǎng)在無pH控制下進(jìn)行。
[0135] 預(yù)培養(yǎng)后，將細(xì)胞懸浮液離心（10 min，4200 rpm)并將沉淀用10 ml培養(yǎng)基洗滌 并再次離心。對于主要培養(yǎng)物，將必需數(shù)量的來自預(yù)培養(yǎng)物的經(jīng)洗滌的細(xì)胞以0.1的〇D600nm 轉(zhuǎn)移至具有額外400 mg/L L-鹽酸半胱氨酸的200 mL培養(yǎng)基。化能自養(yǎng)培養(yǎng)在250 mL耐壓 玻璃瓶中在37°C、150 rpm下和1 L/h的通氣速率用具有66.85% H2、33% C〇2、0.6%〇2的預(yù)混 氣體在開放水浴搖床中進(jìn)行91小時(shí)。將氣體經(jīng)具有10 ym的孔徑的分布器排放至培養(yǎng)基中， 所述分布器固定在反應(yīng)器的中央。培養(yǎng)在無pH控制下進(jìn)行。培養(yǎng)過程中，取若干5 mL樣品來 測定0D6QQnm、pH和產(chǎn)物形成。產(chǎn)物濃度的測定通過半定量1H-NMR光譜學(xué)進(jìn)行。三甲基甲硅烷 基丙酸鈉（T(M)SP)用作內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)品。還通過氧氣浸入探頭（具有0xy4Trace的PSt6， Presens，Germany)在線測量培養(yǎng)基中的溶解氧。
[0136] 在培養(yǎng)期過程中，通過0D6QQnm從0.10增加至0.16觀察到細(xì)胞生長，其與y = 5 x 10一3 h 4的生長速率相關(guān)。乙酸濃度從9 mg/L增加至476 mg/L且乙醇濃度從6 mg/L增加至 61 mg/L。在培養(yǎng)期過程中，溶解氧濃度為0.01-0.10 mg/L。
[0137] 在具有相同參數(shù)(培養(yǎng)基組成、體積、瓶、氣體、通氣速率、溫度、搖動頻率）的相似 技術(shù)設(shè)定(但培養(yǎng)基中無細(xì)胞)中，測量到〇. 15 mg/L的溶解氧濃度。
[0138] 實(shí)施例12 通過伍氏醋酸桿菌在具有氧氣的合成氣上生長和生產(chǎn)乙酸 對于生物轉(zhuǎn)化氫氣和二氧化碳為乙酸，在具有氧氣的合成氣上培養(yǎng)同型產(chǎn)乙酸菌伍氏 醋酸桿菌。所有培養(yǎng)步驟在厭氧條件下在可以用丁基橡膠塞氣密封閉的耐壓玻璃瓶中進(jìn) 行。對于預(yù)培養(yǎng)，用5 mL伍氏醋酸桿菌的冰凍的冷凍原種接種具有額外400 mg/L L-鹽酸半 胱氨酸和400 mg/L Na2S x 9 H20的500 ml培養(yǎng)基(ATCC1754培養(yǎng)基：pH 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L酵母提取物，0.8 g/L NaCl，1 g/L NH4CI，0.1 g/L KC1，0.1 g/L KH2P〇4， 0.2 g/L MgS〇4 x 7 H2O; 0.02 g/L CaCl2 X 2H20; 20 mg/L次氮基三乙酸 10 mg/L MnS〇4 x H2O; 8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H2O; 2 mg/L C0CI2 x 6 H2O; 2 mg/L ZnS〇4 x 7 H2O; 0.2 mg/L CuCh x 2 H2O; 0.2 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O; 0.2 mg/L NiCh x 6 H2O; 0.2 mg/L Na2Se〇4; 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H2O; 20 yg/L d-生物素，20 yg/L 葉酸，100 yg/L鹽酸吡咳醇；50 yg/L鹽酸硫胺素X H2〇; 50 yg/L核黃素；50 yg/L煙酸，50 yg/ !^泛酸|丐；1此凡維生素1312;50此凡對氨基苯甲酸；50狀凡硫辛酸，約67.5 11^/ L NaOH)?；茏责B(yǎng)培養(yǎng)在1L耐壓玻璃瓶中在37°C、100 rpm下和3 L/h的通氣速率用具有 67% H2、33% C02的預(yù)混氣體在開放水浴搖床中進(jìn)行72小時(shí)。將氣體經(jīng)具有10 ym的孔徑的分 布器排放至培養(yǎng)基中，所述分布器固定在反應(yīng)器的中央。培養(yǎng)在無pH控制下進(jìn)行。
[0139] 預(yù)培養(yǎng)后，將細(xì)胞懸浮液離心（10 min, 4200 rpm)并將沉淀用新鮮培養(yǎng)基重懸。 對于主要培養(yǎng)物，將必需數(shù)量的來自預(yù)培養(yǎng)物的細(xì)胞以0.1的〇D6QQnm轉(zhuǎn)移至具有額外400 mg/L L-鹽酸半胱氨酸的500 mL培養(yǎng)基?；茏责B(yǎng)培養(yǎng)在1 L耐壓玻璃瓶中在37 °C、150 rpm 下和1 L/h的通氣速率用具有66.95% H2、33% C02、0.05% 02的預(yù)混氣體在開放水浴搖床中 進(jìn)行41小時(shí)。將氣體經(jīng)具有10 ym的孔徑的分布器排放至培養(yǎng)基中，所述分布器固定在反應(yīng) 器的中央。培養(yǎng)在無pH控制下進(jìn)行。培養(yǎng)過程中，取若干5 mL樣品來測定ODsoo?、pH和產(chǎn)物形 成。產(chǎn)物濃度的測定通過半定量1H-匪R光譜學(xué)進(jìn)行。三甲基甲硅烷基丙酸鈉(T(M)SP)用作 內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)品。還通過氧氣浸入探頭(具有0xy4Trace的PSt6, Presens，Germany)在線 測量培養(yǎng)基中的溶解氧。
[0140] 在培養(yǎng)期過程中，通過ODsoo?的增加觀察到細(xì)胞生長。乙酸濃度也增加。
[0141 ]在具有相同參數(shù)(培養(yǎng)基組成、體積、瓶、氣體、通氣速率、溫度、搖動頻率）的相似 技術(shù)設(shè)定(但培養(yǎng)基中無細(xì)胞)中，測量到〇.〇1 mg/L的溶解氧濃度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 反應(yīng)混合物，其用于在好氧條件下從碳源生產(chǎn)乙醇和/或乙酸，其中所述混合物包含 -處于指數(shù)生長期的第一產(chǎn)乙酸微生物； -游離氧;和 -處于穩(wěn)定期的第二產(chǎn)乙酸微生物 其中所述第一和第二產(chǎn)乙酸微生物能夠轉(zhuǎn)化碳源為乙酸和/或乙醇。2. 權(quán)利要求1的混合物，其中所述第一和第二微生物選自潮濕厭氧醋菌 (Acetoanaerobium notera)(ATCC 35199)、長醋絲菌（Acetonema longum) (DSM 6540)、甲 醇醋酸桿菌（Acetobacterium carbinolicum)(DSM 2925)、蘋果酸醋酸桿菌 (Acetobacterium malicum) (DSM 4132)、醋酸桿菌屬第446號種（Acetobacterium species no. 446)、威氏醋酸桿菌(Acetobacterium wieringae )(DSM 1911)、伍氏醋酸桿 菌(Acetobacterium woodii) (DSM 1030)、Alkalibaculum bacchi(DSM 22112)、閃爍古生 球菌（Archaeoglobus fulgidus) (DSM 4304)、Blautia producta (DSM 2950)、食甲基丁 酸桿菌（Butyribacterium methylotrophicum) (DSM 3468)、醋酸梭菌（Clostridium aceticum) (DSM 1496)、產(chǎn)乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum) (DSM 10061、DSM 19630和DSM 23693)、Clostridium carboxidivorans (DSM 15243)、Clostridium coskatii (ATCC編號 PTA-10522)、Clostridium drakei (ATCC BA-623)、蟻酸醋酸梭菌 (Clostridium formicoaceticum) (DSM 92)、乙二酉享梭菌（Clostridium glycolicum) (DSM 1288)、揚(yáng)氏梭菌（Clostridium ljungdahlii) (DSM 13528)、揚(yáng)氏梭菌C-01 (ATCC 55988)、揚(yáng)氏梭菌ERI-2 (ATCC 55380)、揚(yáng)氏梭菌0-52(ATCC 55989)、馬猶姆貝梭菌 (Clostridium mayombei) (DSM 6539)^Clostridium methoxybenzovorans (DSM 12182)、 Clostridium ragsdalei (DSM 15248)、類味梭菌（Clostridium scatologenes) (DSM 757)、梭菌屬種ATCC 29797、庫氏脫硫腸狀菌（Desulfotomaculum kuznetsovii) (DSM 6115)、熱苯脫硫腸狀菌thermosyntrophicum亞種（Desulfotomaculum thermobezoicum subsp · thermosyntrophicum) (DSM 14055)、粘液真桿菌（Eubacterium limosum) (DSM 20543)、·乙酸甲焼八疊球菌(Methanosarcina acetivorans)C2A (DSM 2834)、穆爾氏菌 屬種HUC22_l(Moorella sp. HUC22-1)、熱醋穆爾氏菌（Moorella thermoacetica) (DSM 521)、熱自養(yǎng)穆爾氏菌（Moorella thermoautotrophica) (DSM 1974)、Oxobacter pfennigii (DSM 322)、Sporomusa aerivorans (DSM I3326)、卵形鼠抱菌（Sporomusa ovata)(DSM 2662)、Sporomusa silvacetica (DSM 10669)、球形鼠抱菌（Sporomusa sphaeroides) (DSM 2875)、白蟻鼠抱菌（Sporomusa termitida) (DSM 4440)和凱伍熱厭 氧菌（Thermoanaerobacter kivui)(DSM 2030)〇3. 權(quán)利要求1或2的混合物，其中所述處于指數(shù)生長期的第一產(chǎn)乙酸微生物具有0.01-2 1Γ1的生長速率。4. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的混合物，其中所述處于指數(shù)生長期的第一產(chǎn)乙酸微生物具 有0.01-2的 OD6〇〇d5. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的混合物，其中所述好氧條件為氧氣處于0.000005體積%-1 體積%的濃度的結(jié)果。6. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的混合物，其中所述反應(yīng)混合物進(jìn)一步包含 -能夠進(jìn)行乙醇羧酸發(fā)酵途徑并轉(zhuǎn)化乙酸和/或乙醇形成酸的第三微生物，且 其中所述第一和/或第二產(chǎn)乙酸微生物能夠轉(zhuǎn)化酸為相應(yīng)的高級醇。7. 權(quán)利要求6的混合物，其中所述第三微生物表達(dá)選自E1至E11的至少一種酶，其中EiS 醇脫氫酶(adh)，E2為乙醛脫氫酶(ald)，E3為乙酰乙酰-CoA硫解酶(thl)，E4為3-羥基丁酰 基-CoA脫氫酶(hbd) 45為3_羥基丁?；?CoA脫水酶(crt)，E6為丁?；?CoA脫氫酶(bed)，E7 為電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白亞基(etf )，E8為輔酶A轉(zhuǎn)移酶(cat)，E9為乙酸激酶(ack)，Eiq為磷酸轉(zhuǎn) 乙酰酶(pta)且Ειι為轉(zhuǎn)氫酶。8. 權(quán)利要求6或7的混合物，其中所述第三微生物選自克氏梭菌（Clostridium kluyveri)和C·Carboxidivorans 〇9. 權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的混合物，其中所述第一和/或第二微生物為揚(yáng)氏梭菌且所述 第三微生物為克氏梭菌。10. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的混合物，其中所述碳源包含C0。11. 權(quán)利要求6-11中任一項(xiàng)的混合物，其中所述高級醇可以選自1-丁醇、2-甲基-1-丁 醇、異丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、1-辛醇、1-戊醇、1-庚醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己 醇、5-甲基-1-庚醇、4-甲基-1-戊醇、5-甲基-1-己醇、6-甲基-1-庚醇及其組合。12. 在好氧條件下從碳源生產(chǎn)乙醇和/或乙酸的方法，其中所述方法包括 (a)接觸反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含 一處于指數(shù)生長期的第一產(chǎn)乙酸微生物； 一游離氧;和 一處于穩(wěn)定期的第二產(chǎn)乙酸微生物 其中所述第一和第二產(chǎn)乙酸微生物能夠轉(zhuǎn)化碳源為乙酸和/或乙醇。13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述反應(yīng)混合物為權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的混合物。14. 在好氧條件下從碳源生產(chǎn)至少一種高級醇的方法，所述方法包括 (a)在好氧條件下使權(quán)利要求6-11中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物與碳源接觸。
【文檔編號】C12P7/54GK105821084SQ201610054186
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年1月27日
【發(fā)明人】T.哈斯, T.比爾特, M.德姆勒, S.貝克
【申請人】贏創(chuàng)德固賽有限公司