一種制備左旋多巴的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物酶法合成領域，涉及一種制備左旋多巴的方法，采用重組菌大腸埃希氏菌FDop（<i>Escherichia coli </i>FDop）發(fā)酵產(chǎn)生，F(xiàn)Dop已保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2016年2月19日，保藏編號為CCTCC NO：M 2016064。具體包括如下步驟：（1）菌種活化，得到一級種子；（2）擴大培養(yǎng)，得到二級種子；（3）發(fā)酵培養(yǎng)：將所述二級種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時加入葡萄糖，轉(zhuǎn)速350?450rpm，風量3?5L/min，控制pH6.0?6.5進行發(fā)酵，溶氧控制在15?30%，得到發(fā)酵液；（4）誘導：所述發(fā)酵液的OD600達到8?10，加入IPTG至終濃度為0.03?0.06mM，同時開始流加左旋酪氨酸溶液，誘導48?72小時，純化得到左旋多巴。本發(fā)明制備左旋多巴的工藝易于控制，穩(wěn)定性好，副產(chǎn)物少，左旋多巴的產(chǎn)率高。CCTCC NO: M 201606420160219
【專利說明】
一種制備左旋多巴的方法
技術(shù)領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用微生物發(fā)酵的方法，具體是一種制備左旋多巴的方法，屬于 微生物酶法合成領域。
【背景技術(shù)】
[0002] 左旋多巴（3，4-dihydroxyphenyl-L-ananine，簡稱L-D0PA)的化學名稱為3，4_二 羥基苯基丙氨酸，其結(jié)構(gòu)式為：
作為一種重要的生物活性物質(zhì)，L-D0PA是從L-酪氨酸到兒茶酚或黑色素的生化代謝途 徑過程中的重要中間產(chǎn)物。
[0003] 上世紀60年代，國外許多學者開始致力于微生物酶法合成L-D0PA的研究。為了提 高L-D0PA產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率，研究者們對微生物酶法合成L-D0PA的工藝方法進行了大量研 究。
[0004] 酪氨酸酸裂解酶（Tyrosine phenol lyase，TPL，E.C.4.1.99.2)，又名酪氨酸 酶，以磷酸吡咳醛(pyridoxal_phosphate，PLP)為輔酶，以鉀離子和氨離子為輔助因子，TPL 可以催化L-酪氨酸發(fā)生消去反應生成苯酚、丙酮酸和氨。由于這個反應是可逆的，將鄰苯 二酚代替苯酚后，可由鄰苯二酚、丙酮酸和氨可在TPL催化下生成L-D0PA。左旋多巴的前體 在較高濃度時對酶活都有抑制作用，其中鄰苯二酚及丙酮酸除了有強抑制作用外，還會導 致酶的不可逆失活，反應條件難以控制，副產(chǎn)物多，L-D0PA的產(chǎn)率低。
[0005] 也有一些利用自然界中的細菌，如Escherichia、Proteus(變形菌屬）、 Stizolobium hassjoo和Erwinia(歐文氏菌屬）等，來合成L-D0PA，如左旋多巴酶法合成綜 述報道，TPL大腸桿菌基因工程菌轉(zhuǎn)化30h，轉(zhuǎn)化生成29.6g/L的L-D0PA。又如，Jang-Young !^6等人克隆來源于￡8(：1161'；[(31113(30111(41'(](]11105)的對羥基苯乙酸-3-羥基化酶(口-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase，PHAH)，轉(zhuǎn)化L-酪氨酸為L-D0PA，產(chǎn)物累積至 10g/ L，該技術(shù)申請了專利US5837504。研究者發(fā)現(xiàn)這些重組菌株雖然TPL的表達量高于野生菌 株，但最終的L-D0PA合成能力卻沒有明顯提高甚至低于野生菌株。這可能因為要獲得較高 的L-D0PA合成能力，菌株除了具備TPL高活性外，還要有相對完善的底物、產(chǎn)物出入細胞膜 的轉(zhuǎn)運機制以及對底物鄰苯二酚抑制酶活的耐受力等?？傮w來說，反應條件難以控制，穩(wěn)定 性差，副產(chǎn)物多，L-D0PA的產(chǎn)率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種制備左旋多巴的方法，采用一株用于發(fā) 酵生產(chǎn)左旋多巴的具備遺傳穩(wěn)定性高，產(chǎn)量高，副產(chǎn)物少的重組菌株FDop。
[0007] 采取的技術(shù)方案如下：一種制備左旋多巴的方法，采用重組菌大腸埃希氏菌FDop (Escherichia coli FDop)發(fā)酵產(chǎn)生，F(xiàn)Dop已保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為 2016年2月19日，保藏地址:武漢大學武昌珞珈山，保藏編號為CCTCC N0:M 2016064。
[0008] 重組菌FDOP是通過將來源于粗糙鏈孢菌(Neurospora crassa)的酪氨酸酶基因 (Gene ID:M32843.1)導入左旋酪氨酸生產(chǎn)菌構(gòu)建而成。
[0009] 進一步，重組菌roop的獲得步驟包括:設計引物克隆酪氨酸酶基因，將克隆到的酪 氨酸酶基因連入表達載體中，構(gòu)建表達質(zhì)粒Tyrse，再將表達質(zhì)粒Tyrse導入左旋酪氨酸生 產(chǎn)菌(Tyr)中，構(gòu)建得到重組菌FDop。
[0010] 進一步，表達載體采用表達載體PKK223-3。
[0011]制備左旋多巴的方法，具體包括如下步驟：（1)菌種活化:挑單FDop菌落，接種于種 子培養(yǎng)基中，加Amp至10011^/1，35-37°(：，200-250印111，培養(yǎng)12-1611，得到一級種子；（2)擴大 培養(yǎng):將所述一級種子接種到種子培養(yǎng)基中，加Amp至100mg/L，35-37°C，200-250rpm，培養(yǎng) 12-16h，得到二級種子;（3)發(fā)酵培養(yǎng):將所述二級種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時加入葡萄 糖，轉(zhuǎn)速350-450rpm，風量3-5L/min，控制pH6.0-6.5進行發(fā)酵，溶氧控制在15-30%，得到發(fā) 酵液；（4)誘導:所述發(fā)酵液的0D600達到8-10，加入IPTG至終濃度為0.03-0.06mM，同時開始 流加左旋酪氨酸溶液，誘導48-72小時，純化得到左旋多巴。
[0012]進一步，步驟(4)中，左旋酪氨酸溶液的流加流速為0.3-0.8g/L。
[0013] 進一步，步驟(3)中，采用氨水控制pH6.0-6.5。
[0014]進一步，所述種子培養(yǎng)基包括胰蛋白胨10g/L、酵母提取物0.5g/L、氯化鈉10g/L。 [0015]進一步，發(fā)酵培養(yǎng)基包括十二水磷酸氫二鈉15.14g/L、磷酸二氫鉀3g/L、氯化銨 1 g/L、氯化鈉0 ? 5g/L、七水硫酸鎂0 ? 246g/L。
[0016]進一步，獲得重組菌roop的具體步驟包括： 1.將L-酪氨酸生產(chǎn)菌(Tyr)制備成感受態(tài)細胞 使用TAKARA感受態(tài)細胞制備試劑盒，按說明書操作，制備獲得Tyr菌感受態(tài)。
[0017] 2.全基因合成酪氨酸酶基因片段 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中Gene ID:M32843.1提供的序列，合成粗糙鏈孢菌（Neurospora crassa)來源的酪氨酸酶全基因片段。
[0018] 3 ?構(gòu)建酪氨酸酶表達質(zhì)粒Tyrse 將酪氨酸酶全基因片段亞克隆至PKK223-3質(zhì)粒，酶切位點Ec〇RI、HindIII。
[0019] 4 ?表達質(zhì)粒Tyrse導入感受態(tài)細胞 1) 感受態(tài)從-70度取出后立刻插入冰水浴中3min; 2) 超凈臺中取1微升的質(zhì)粒Tyrse加入感受態(tài)，輕彈混勾，立刻插入冰水浴25min，靜置； 3) 將感受態(tài)輕輕轉(zhuǎn)移至42度水浴熱激1.5min，立刻輕輕轉(zhuǎn)移至冰水浴5min; 4) 加700微升左右的LB培養(yǎng)基，150rpm，37度，60min復蘇； 5 )3500rpm*3min，棄上清600-700微升，剩余菌液吹吸混勻，涂布加氨芐青霉素（100mg/ L)LB 平板，37°C 培養(yǎng) 16h。
[0020]通過實施上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下有益效果:本發(fā)明制備左旋多巴的工藝 易于控制，穩(wěn)定性好，副產(chǎn)物少，左旋多巴的產(chǎn)率高。
【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0022] 實施例1: 一、 制備重組菌FDop 1、將L-酪氨酸產(chǎn)生菌(大腸桿菌工程菌)制備成感受態(tài)細胞 使用TAKARA感受態(tài)細胞制備試劑盒，按說明書操作，制備獲得Tyr菌感受態(tài)。
[0023] 2、全基因合成酪氨酸酶基因片段 根據(jù)Gene ID:M32843.1提供的序列，合成粗糙鏈孢菌(Neurospora crassa)來源的酪 氨酸酶全基因片段。
[0024] 3、構(gòu)建酪氨酸酶表達質(zhì)粒Tyrse 將酪氨酸酶全基因片段與強啟動子片段亞克隆至表達載體PKK223-3質(zhì)粒，酶切位點選 用EcoRI、HindIII。
[0025] 4、表達質(zhì)粒Tyrse導入感受態(tài)細胞 (1)感受態(tài)從-70度取出后立刻插入冰水浴中3min; (2 )超凈臺中取1微升的質(zhì)粒Tyrse加入感受態(tài)，輕彈混勾，立刻插入冰水浴25min，靜 置； (3) 將感受態(tài)輕輕轉(zhuǎn)移至42度水浴熱激1.5min，立刻輕輕轉(zhuǎn)移至冰水浴5min; (4) 加700微升左右的LB，150rpm，37度，60min復蘇； 3500rpm*3min，棄上清600-700微升，剩余菌液吹吸混勻，涂布加氨芐青霉素（100mg/L) LB平板，37°C培養(yǎng)16h; 二、 利用重組菌FDop發(fā)酵產(chǎn)生左旋多巴 1) 挑重組菌FDop單菌落接種于含4ml種子培養(yǎng)基的試管，加Amp至100mg/L，37°C， 220rpm，培養(yǎng)12h，得到一級種子;采用的種子培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物0.5 g/L、 氯化鈉l〇g/L、純水； 2) -級種子接種于100ml種子培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，加Amp至100mg/L，37°C，220rpm，培養(yǎng) 4h，得到二級種子； 3) 二級種子接種8L發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時加入基礎葡萄糖4 g/L，轉(zhuǎn)速400rpm，風量4L/ min，氨水控制pH6.0發(fā)酵，溶氧控制20%;發(fā)酵培養(yǎng)基:十二水磷酸氫二鈉15.14g/L、磷酸二 氫鉀3g/L、氯化銨1 g/L、氯化鈉0.5g/L、七水硫酸鎂0.246 g/L、純水； 4) 基糖耗完，補加葡萄糖6g/L，控制加入速度0.6-1.2g/L，得到發(fā)酵液； 5) 待發(fā)酵液的0D600達到8-10時，開始加IPTG至終濃度0.05mM，同時開始流加L-酪氨酸 溶液(質(zhì)量含量為30%)，控制L-酪氨酸溶液流速0.5g/L。
[0026] 6)發(fā)酵至左旋多巴不再增加，約48-50小時，停止發(fā)酵，左旋多巴含量達50g/L。
[0027] 實施例2: 一、制備重組菌FDop 同實施例1。
[0028] 二、利用重組菌ro〇P發(fā)酵產(chǎn)生左旋多巴 1)挑重組菌FDop單菌落接種于含4ml種子培養(yǎng)基的試管，加Amp至100mg/L，35°C， 250rpm，培養(yǎng)16h，得到一級種子;采用的種子培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物0.5 g/L、 氯化鈉l〇g/L、純水； 2) -級種子接種于100ml種子培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，加Amp至100mg/L，37°C，200rpm，培養(yǎng) 6h，得到二級種子； 3) 二級種子接種8L發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速350rpm，風量3L/min，氨水控制pH6.5發(fā)酵， 溶氧控制30%，得到發(fā)酵液;發(fā)酵培養(yǎng)基:十二水磷酸氫二鈉15.14g/L、磷酸二氫鉀3g/L、氯 化銨1 g/L、氯化鈉0.5g/L、七水硫酸鎂0.246 g/L、葡萄糖1 Og/L、純水； 4) 待發(fā)酵液的0D600達到8時，開始加IPTG至終濃度0.06mM，同時開始流加L-酪氨酸溶 液(質(zhì)量含量為30%)，控制L-酪氨酸溶液流速0.5g/L; 5) 發(fā)酵至左旋多巴不再增加，約60-65小時，停止發(fā)酵，左旋多巴含量達58g/L。
[0029] 實施例3: 一、制備重組菌FDop 同實施例1。
[0030] 二、利用重組菌ro〇P發(fā)酵產(chǎn)生左旋多巴 (1) 挑重組菌TOop單菌落接種于含4ml種子培養(yǎng)基的試管，加Amp至100mg/L，36°C， 200rpm，培養(yǎng)15h，得到一級種子;采用的種子培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物0.5 g/L、 氯化鈉1 〇g/L、純水； (2) -級種子接種于100ml種子培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，加Amp至100mg/L，36°C，200rpm，培 養(yǎng)5h，得到二級種子； (3) 二級種子接種8L發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時加入基礎葡萄糖4 g/L，轉(zhuǎn)速450rpm，風量5L/ min，氨水控制pH6.5發(fā)酵，溶氧控制30%;發(fā)酵培養(yǎng)基:十二水磷酸氫二鈉15.14g/L、磷酸二 氫鉀3g/L、氯化銨1 g/L、氯化鈉0.5g/L、七水硫酸鎂0.246 g/L、純水； (4) 基糖耗完，補加葡萄糖6g/L，控制加入速度1.0-1.2g/L，得到發(fā)酵液； (5) 待發(fā)酵液的0D600達到9時，開始加IPTG至終濃度0.03mM，同時開始流加L-酪氨酸溶 液(質(zhì)量含量為30%)，控制L-酪氨酸溶液流速0.5g/L。
[0031] (6)發(fā)酵至左旋多巴不再增加，約72小時，停止發(fā)酵，左旋多巴含量達55g/L。
【主權(quán)項】
1. 一種制備左旋多巴的方法，其特征在于，采用重組菌大腸埃希氏菌FDop (Escherichia coli FDop)發(fā)酵產(chǎn)生，F(xiàn)D0P已保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為 2016年2月 19日，保藏編號為CCTCC N0:M 2016064。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種制備左旋多巴的方法，其特征在于，重組菌ro〇P是通過將酪 氨酸酶基因?qū)胱笮野彼嵘a(chǎn)菌構(gòu)建而成。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述一種制備左旋多巴的方法，其特征在于，所述酪氨酸酶基因來源 于粗糖鏈抱菌(Neurospora crassa)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種制備左旋多巴的方法，其特征在于，包括如下步驟：（1)菌種 活化:挑單FDop單菌落，接種于種子培養(yǎng)基中，加 Amp至100mg/L，35-37 °C，200-250rpm，培養(yǎng) 12-16h，得到一級種子；（2)擴大培養(yǎng)：將所述一級種子接種到種子培養(yǎng)基中，加 Amp至 100mg/L，35-37°C，200-250rpm，培養(yǎng)4-6h，得到二級種子；（3)發(fā)酵培養(yǎng):將所述二級種子接 種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時加入葡萄糖，轉(zhuǎn)速350-450rpm，風量3-5L/min，控制pH6.0-6.5進行 發(fā)酵，溶氧控制在15-30%，得到發(fā)酵液;（4)誘導:所述發(fā)酵液的0D600達到8-10，加入IPTG至 終濃度為〇 . 03-0.06mM，同時開始流加左旋酪氨酸溶液，誘導48-72小時，純化得到左旋多 巴。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述一種制備左旋多巴的方法，其特征在于，包括如下步驟:步驟(4) 中，左旋酪氨酸溶液的流加流速為0.3-0.8g/L。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述一種制備左旋多巴的方法，其特征在于，包括如下步驟:步驟(3) 中，采用氨水控制PH6.0-6.5。7. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述一種制備左旋多巴的方法，其特征在于，重組菌ro〇p的獲得 步驟包括:設計引物克隆酪氨酸酶基因，將克隆到的酪氨酸酶基因連入表達載體中，構(gòu)建表 達質(zhì)粒Tyrse，再將表達質(zhì)粒Tyrse導入左旋酪氨酸生產(chǎn)菌(Tyr)中，構(gòu)建得到重組菌FDop。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述一種制備左旋多巴的方法，其特征在于，所述表達載體采用表達 載體 PKK223-3。
【文檔編號】C12P13/22GK105821091SQ201610287966
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月4日
【發(fā)明人】儲消和, 吳黎誠, 余煒, 方明山, 徐順清, 周衛(wèi)國, 張擁軍
【申請人】浙江綠創(chuàng)生物科技有限公司, 浙江野風藥業(yè)股份有限公司