污水處理廠聚磷菌的快速定量方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種污水處理廠聚磷菌的快速定量方法，具體步驟包括污水處理廠活性污泥樣品采集和保藏、制作無菌明膠涂片、制作樣品涂片、亞甲基藍染色、DAPI染色、顯微鏡觀察、聚磷菌豐度的確定及統(tǒng)計分析等步驟。根據(jù)該方法，可以簡單快速從復雜廢水處理系統(tǒng)混合微生物群落中定量聚磷菌，操作流程快速，成本較低，操作簡便，操作人員不需要特殊的技能培訓，對檢測的地點和時間無特殊的要求，檢測結果準確，并能迅速提供給城市污水處理廠技術人員相關的數(shù)據(jù)，可作為監(jiān)測強化生物除磷過程異常的原因和依據(jù)，對進一步調整工程控制措施，保證城市污水處理廠強化生物除磷過程的正常運行具有重要的意義。
【專利說明】
污水處理廠聚磷菌的快速定量方法
技術領域：
[0001] 本發(fā)明涉及一種微生物的快速定量方法，特別是一種污水處理廠聚磷菌的快速定 量方法。
【背景技術】
[0002] 隨著城鎮(zhèn)化的發(fā)展，城市及工業(yè)污水排放引起的水體富營養(yǎng)化問題越來越突出， 其主要原因是含氮、磷污水的過量排放，因此必須對污水進行處理。城市及工業(yè)污水中的磷 可以采用物理、化學和生物處理法去除，與傳統(tǒng)的物理和化學方法相比，生物處理法在去除 污水中污染物方面有著無可比擬優(yōu)勢，例如:無需通過高溫高壓，在溫和條件下即可完成對 污水的處理，因此處理費用低廉；由于城市廢水中所含的微生物代謝類型多樣，可以對大多 數(shù)污水的污染物實現(xiàn)生物降解;而且污水生物處理不產生附加的廢棄物，對環(huán)境的影響較 小。因此，以活性污泥為主體的污水處理過程已成為現(xiàn)代社會最大的生物技術產業(yè)。
[0003] 活性污泥法是一種對污水的好氧生物的處理方法。活性污泥是廢水微生物處理中 微生物懸浮在水中的各種物質的統(tǒng)稱。活性污泥法的本質是從污水中去除溶解的和膠體狀 態(tài)的有機物以及能被活性污泥吸附的懸浮固體和其他一些物質，同時也能去除一部分磷和 氮。
[0004] 活性污泥是由細菌、放線菌、真菌和原生動物組成的絮狀體構成，活性污泥法的原 理是向廢水中連續(xù)的通入空氣，經一定時間后因好氧微生物繁殖，而形成了污泥狀絮凝物。 其上棲息著各種微生物群，具有很強的吸附能力與氧化有機物的能力，用來分解去除污水 中的有機污染物。這樣就可以使污泥與水分離，而且大部分污泥再回流到曝氣池，能再次利 用，多余部分則排出該系統(tǒng)。
[0005] 目前生物除磷的重要途徑是強化生物除磷技術（enhanced b i 〇 1 og i ca 1 phosphorus removal，EBPR)。生物處理法中生物除磷是一個重要的過程，利用了活性污泥 中一種特殊微生物的超量磷吸收的現(xiàn)象，即該微生物吸收的磷量超過自身正常生長所需的 磷量，這種特殊的微生物就是聚磷菌。強化生物除磷主要通過聚磷菌（phosphate accumulating organisms，PA0s)在厭氧條件下釋放磷，在好氧條件下過量吸收磷，而后排 放富含磷的剩余污泥，進而達到將磷從污水中去除的目的。由聚磷菌通過強化生物脫磷過 程完成的去除污水中的磷的具體過程是:在污水與活性污泥混合后通過厭氧區(qū)、兼性厭氧 區(qū)和好氧區(qū)的流程中，首先活性污泥中的聚磷菌在厭氧區(qū)利用體內多聚磷酸鹽 (polyphosphate, polyP)為能源，吸收污水中的短鏈脂肪酸并將其儲存為體內的聚羥基脂 肪酸酯化〇171^(11'(?7311?11103七68，？說），并向細胞外釋放磷酸鹽，當進入兼性厭氧期和好 氧區(qū)后，聚磷菌利用體內的聚羥基脂肪酸酯為能源吸收污水中的磷(P〇 4^)，儲存為體內的多 聚磷酸鹽，同時完成生長過程。在強化生物除磷過程中在好氧區(qū)的末期通過排放富含磷的 剩余活性污泥就達到了從污水中去除磷的目的。
[0006] 聚磷菌能在好氧情況下將污水中超量的磷吸入自身體內，使體內的磷含量為一般 細菌含磷量的數(shù)倍，而在厭氧區(qū)，聚磷菌會分解體內一部分的多聚磷酸鹽，用以維持自身生 存，因此聚磷菌被廣泛地應用于生物除磷。微生物遵循生長曲線的規(guī)律，在厭氧區(qū)中，聚磷 菌細胞會從廢水中攝取大量溶解態(tài)的磷酸鹽，在細胞內合成多聚磷酸鹽，并儲存在細胞內， 供給生長時期所需要的合成核酸時的磷素；當活性污泥中的聚磷菌在營養(yǎng)豐富的環(huán)境中生 活時，進入對數(shù)生長期，在對數(shù)生長期聚磷菌會大量分裂;之后聚磷菌進入靜止期，大部分 細胞停止繁殖，核酸的合成也隨之停止，此時聚磷菌對磷的需要量很低，但若環(huán)境中的磷源 仍有剩余，細胞又有一定的能量時，仍能從外界吸收磷元素，將磷以多聚磷酸鹽的形式儲存 于細胞內，作為細胞貯存物質，這種對磷的積累作用使聚磷菌能夠聚集大大超過其生長所 需的磷量；當細菌細胞處于極為不利的生活條件時，聚磷菌又能吸收污水中的乙酸、甲酸、 丙酸及乙醇等極易生物降解的有機物質，貯存在體內作為營養(yǎng)源，同時將體內存貯的聚磷 酸鹽分解，以便獲得能量，供細菌在不利環(huán)境中維持其生存所需，此時菌體內多聚磷酸鹽就 逐漸消失;如果該類細菌再次進入營養(yǎng)豐富的好氧環(huán)境時，它將重復體內積磷的過程。
[0007] 污水處理過程中很多生物和非生物因素都會影響強化生物除磷過程的效率，例如 糖源積累細菌(glycogen accumulating organisms，GA0)可以與聚磷菌在厭氧期競爭吸收 同樣的有機基質，從而減少了聚磷菌在厭氧期聚羥基脂肪酸酯的積累，導致了它們在好氧 期和兼性厭氧期的磷吸收減少;此外，污水特征如C/N比、pH值和溫度等的變化，也會影響磷 去除的效率，甚至會造成強化生物除磷過程的完全崩潰。
[0008] 為了污水的有效處理和達標排放，污水處理廠管理和操作人員需要監(jiān)控和及時判 斷影響強化生物除磷過程異常的原因，以便對活性污泥流程和工廠設施進行必要的調整， 保證強化生物除磷過程的正常運行，保證污水的達標排放。
[0009] 在現(xiàn)有的物理化學和生物指標中，活性污泥微生物群落中聚磷菌的相對豐度和活 性直接反應強化生物除磷過程運行狀況，是強化生物除磷過程監(jiān)控的良好指標。但是，目前 用于聚磷菌的檢測方法較少，目前主要采用以聚磷菌16S rRNA為靶標的基因探針通過定量 焚光原位雜交（quantitative fluorescence in situ hybridization,qFISH)和通過qPCR 定量聚磷菌的豐度和活性的方法檢測。qFISH是利用熒光標記的特異核酸探針按照堿基互 補配對原則，與細胞內相應的DNA分子雜交，形成可被檢測的雙鏈核酸，通過熒光顯微鏡可 觀察到熒光信號。qPCR是在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積，監(jiān)測PCR的進 程，最后通過標準曲線對聚磷菌進行定量分析。但目前兩種檢測的方法操作復雜，操作人 員需要一定的專業(yè)技能，檢測時間過長(7-8小時），實驗過程所需材料及設備也比較昂貴， 不適于作為簡單快速的檢測方法。因此，建立一種簡單、快捷、高效、低成本的聚磷菌檢測方 法，適用于活性污泥脫磷效果和污水處理廠設備工作效率的常規(guī)檢測，對保護水資源環(huán)境 和人民的生活水平有著重大的意義。

【發(fā)明內容】

[0010] 本發(fā)明提供了一種污水處理廠聚磷菌的快速定量方法，開發(fā)了一種簡單快速從復 雜廢水處理系統(tǒng)混合微生物群落中定量聚磷菌的手段，亞甲基藍染色和DAPI染色聯(lián)用可在 1-2小時內定量城市污水處理廠活性污泥強化生物除磷過程中的聚磷菌，而且操作過程簡 單快速，操作人員不需要專業(yè)技能培訓，聚磷菌的豐度和活性可用于監(jiān)控污水處理廠強化 生物除磷過程運行的狀況、判斷強化生物除磷過程異常的原因，并能及時采取正確的工程 控制措施，保證城市污水處理廠的正常有效運行。
[0011] 為達到上述目的，本發(fā)明包含以下步驟：
[0012] (1)污水處理廠活性污泥樣品采集和保藏:在曝氣裝置后的曝氣區(qū)進行采樣，樣品 存入廣口玻璃瓶中，并在1小時內轉運到實驗室。樣品在實驗室存放于離心管中，置于4°C冰 箱中保存，染色實驗在三天內完成。
[0013] (2)制作無菌明膠涂片：無菌狀態(tài)下，取7個載玻片架，將載玻片填滿于載玻片架 中；在3.5L蒸餾水中加入4-5滴洗滌劑，放入載玻片架，煮沸l(wèi)Omin;取出載玻片架，晾3min; 用蒸餾水將洗滌劑沖洗干凈，將載玻片保持直立狀態(tài)晾干;在3.5L蒸餾水中加入2.5g的十 二水硫酸鉀鉻和0.44g的明膠，加熱至70°C，待明膠基本溶解后放入載玻片架，恒溫lOmin; 取出載玻片架，將載玻片斜立于試管架邊上干燥即得。
[0014] (3)制作樣品涂片:無菌狀態(tài)下，將裝有樣品的離心管在勻質器上搖勻，由于樣品 中有的顆粒體積較大，槍頭在使用前將前端剪去2-3毫米，用移液槍取約20ul混合活性污泥 樣品[8-10g/L混合液體(干重計量）]置于載玻片中央，蓋上另外一片同樣處理的載玻片，用 手拉住兩片載玻片的末端朝相反的方向來回拉動10-20次，將載玻片立靠在試管架邊緣，使 其風干。
[0015] (4)亞甲基藍染色:取10-15ml亞甲基藍染液滴于風干的樣品載玻片上，染色15s后 將染液倒去，并用70%的酒精沖洗30s，置于陰涼處風干。
[0016] (5)DAPI染色:取100-200ul染色劑D覆蓋于風干的載玻片上均勻涂開，并置于黑暗 的無菌操作箱中染色10-20min;將染色劑D倒去，并用蒸餾水小心沖洗2-3遍(每次lmin);避 光并在無菌操作箱中風干；
[0017] (6)顯微鏡觀察:將干燥好的載玻片置于熒光顯微鏡物鏡臺上，100 X的物鏡下進 行觀察和拍照，每個樣品至少采集30套(每套數(shù)據(jù)圖片包括一張亞甲基藍染色圖片和一張 DAPI染色圖片)數(shù)據(jù)圖片；
[0018] (7)聚磷菌豐度的確定及統(tǒng)計分析:使用圖像分析軟件ImageJ分別分析同一套數(shù) 字圖片中的亞甲基藍染色陽性聚磷菌細胞數(shù)和DAPI染色陽性的細胞數(shù)(微生物總數(shù)），亞甲 基藍染色陽性聚磷菌細胞采用ImageJ中提供的手動計數(shù)法計數(shù)，DAPI染色細胞采用自動計 數(shù)法計數(shù)：
[0019] 聚磷菌的豐度=亞甲基藍染色陽性聚磷菌細胞數(shù)/細胞總數(shù)X 100%
[0020] t檢驗和方差分析均在excel中完成。
[0021] 優(yōu)選地，所述亞甲基藍染色劑的配制方法為：
[0022] a)A液的配制：質量比10-20%的K0H溶液；
[0023] b)B液的配制：亞甲基藍:酒精=1:33_50(質量比）；
[0024] c)亞甲基藍染色劑的配制:將A液與B液按體積比（1:0.5-1)混合。
[0025] 優(yōu)選地，所述DAPI染液為濃度0.0003-0.005mg/ml的DAPI水溶液。
[0026] 本發(fā)明中，通過把亞甲基藍染色法與DAPI(4'，6-diamidino_2-phenylindole)染 色法聯(lián)用，探索出一種簡單快速定量活性污泥微生物群落中聚磷菌的方法。方法的原理是： 亞甲基藍染料帶正電荷，而多聚磷酸鹽顆粒帶負電荷，因此二者具有很高的親和力，兩者結 合后染料的光吸收性發(fā)生變化，產生不同的顏色能夠區(qū)分異染顆粒與細胞。在亞甲基藍染 色中亞甲基藍能夠與聚磷菌體內的多聚磷酸鹽發(fā)生顯色反應，生色團可以用常規(guī)顯微鏡進 行觀察，而且它們的強度與多聚磷酸鹽的量成正比，因此可用于指示潛在的聚磷菌的活性。 因此可以采用亞甲基藍染色法來標記污水處理廠活性污泥微生物群落中的聚磷菌，可以采 用DAPI染色標記活性污泥微生物群落中的所有微生物細胞，DAPI作為一種熒光染料，可以 穿透細胞膜與細胞核中的雙鏈DNA結合而發(fā)揮標記的作用，可以產生比DAPI自身強20多倍 的熒光。顯微鏡下可以看到顯藍色熒光的細胞。結合兩種方法，并通過熒光顯微鏡圖片計算 出同一視野中聚磷菌占所有微生物細胞的百分比。至今為止，這兩種方法還從未聯(lián)合使用 過，該方法的成功開發(fā)將能夠快速準確的測定污水處理廠活性污泥中聚磷菌的豐度，掌握 和判斷污水處理廠的工作狀況。
[0027] 本發(fā)明首次將亞甲基藍染色法與4'，6'_二脒基-2-苯吲哚鹽酸（DAPI)(4'，6'_ diamidino-2-phenylindole)染色法聯(lián)用，探索出一種簡單快速的定量活性污泥微生物群 落中聚磷菌的方法。亞甲基藍染色和DAPI染色聯(lián)用可在1-2小時內定量城市污水處理廠活 性污泥強化生物除磷過程中的聚磷菌，而且操作過程簡單快速，操作人員不需要專業(yè)技能 培訓，聚磷菌的豐度和活性可用于監(jiān)控污水處理廠強化生物除磷過程運行的狀況、判斷強 化生物除磷過程異常的原因，并能及時采取正確的工程控制措施，保證城市污水處理廠的 正常有效運行。
[0028] 本發(fā)明開發(fā)了一種簡單快速從復雜廢水處理系統(tǒng)混合微生物群落中定量聚磷菌 的手段，此手段和目前的分子生物學方法(qFISH和qPCR)比較，克服了現(xiàn)有的方法的不足， 特點是快速(可以在1-2小時內完成），成本較低，操作簡便，操作人員不需要特殊的技能培 訓，對檢測的地點和時間無特殊的要求，檢測結果準確，并能迅速提供給城市污水處理廠技 術人員相關的數(shù)據(jù)，可作為監(jiān)測強化生物除磷過程異常的原因和依據(jù)，對進一步調整工程 控制措施，保證城市污水處理廠強化生物除磷過程的正常運行具有重要的意義。
【附圖說明】
[0029] 圖1為污水處理廠聚磷菌的快速定量方法流程圖；
[0030] 圖2為活性污泥微生物群落中亞甲基藍染色陽性聚磷菌顯微照片示例，箭頭所指 的是陽性聚磷菌；
[0031] 圖3為DAPI染色污泥微生物群落中的總的微生物細胞照片示例，箭頭所指的是被 亞甲基藍染色陽性聚磷菌也被DAPI染亮。
【具體實施方式】
[0032] 以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書 所揭露的內容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實 施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。
[0033] 在進一步描述本發(fā)明【具體實施方式】之前，應理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下 述特定的具體實施方案;還應當理解，本發(fā)明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數(shù)形式"一個"、"一"和"這個"包括復數(shù)形式。
[0034] 當實施例給出數(shù)值范圍時，應理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端 點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術和 科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、 材料外，根據(jù)本技術領域的技術人員對現(xiàn)有技術的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本 發(fā)明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術的任何方法、設備和材料來實 現(xiàn)本發(fā)明。
[0035] 除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術領 域常規(guī)的分子生物學、生物化學、分析化學技術及相關領域的常規(guī)技術。
[0036] 本發(fā)明所述的污水處理廠聚磷菌的快速定量方法，其具體步驟：
[0037] (1)污水處理廠活性污泥樣品采集和保藏:在曝氣裝置后的曝氣區(qū)進行采樣，樣品 存入廣口玻璃瓶中，并在1小時內轉運到實驗室。樣品在實驗室存放于離心管中，置于4°C冰 箱中保存，染色實驗在三天內完成。
[0038] (2)制作無菌明膠涂片：無菌狀態(tài)下，取7個載玻片架，將載玻片填滿于載玻片架 中；在3.5L蒸餾水中加入4-5滴日常家用洗滌精，放入載玻片架，煮沸l(wèi)Omin;取出載玻片架， 晾3min;用蒸餾水將洗滌劑沖洗干凈，將載玻片保持直立狀態(tài)晾干;在3.5L蒸餾水中加入 2.5g的十二水硫酸鉀鉻和0.44g的明膠，加熱至70°C，待明膠基本溶解后放入載玻片架，恒 溫lOmin;取出載玻片架，將載玻片斜立于試管架邊上干燥即得。
[0039] (3)制作樣品涂片:無菌狀態(tài)下，將裝有樣品的離心管在勻質器上搖勻，由于樣品 中有的顆粒體積較大，槍頭在使用前將前端剪去2-3毫米，用移液槍取20ul混合活性污泥樣 品、濃度為8-10g/L混合液體，置于載玻片中央，蓋上另外一片同樣處理的載玻片，用手拉住 兩片載玻片的末端朝相反的方向來回拉動15次，將載玻片立靠在試管架邊緣，使其風干。
[0040] (4)亞甲基藍染色：取10ml亞甲基藍染液滴于風干的樣品載玻片上，染色15s后將 染液倒去，并用70%的酒精沖洗30s，置于陰涼處風干。
[0041] (5)DAPI染色：取80ul染色劑D覆蓋于風干的載玻片上均勻涂開，并置于黑暗的無 菌操作箱中染色30min;將染色劑D倒去，并用蒸餾水小心沖洗2-3遍，每次lmin;避光并在無 菌操作箱中風干；
[0042] (6)顯微鏡觀察:將干燥好的載玻片置于熒光顯微鏡物鏡臺上，100 X的物鏡下進 行觀察和拍照，每個樣品至少采集30套(每套數(shù)據(jù)圖片包括一張綠色熒光淀粉染色圖片和 一張DAPI染色圖片)數(shù)據(jù)圖片；
[0043] (7)聚磷菌豐度的確定及統(tǒng)計分析:使用圖像分析軟件ImageJ分別分析同一套數(shù) 字圖片中的亞甲基藍染色陽性聚磷菌細胞數(shù)和DAPI染色陽性的細胞數(shù)(微生物總數(shù)），亞 甲基藍染色陽性聚磷菌細胞采用ImageJ中提供的手動計數(shù)法計數(shù)，DAPI染色細胞采用自動 計數(shù)法計數(shù)：
[0044] 聚磷菌的豐度=亞甲基藍染色陽性聚磷菌細胞數(shù)/細胞總數(shù)X 100%
[0045] t檢驗和方差分析均在excel中完成。
[0046] 其中，所述亞甲基藍染色劑的配制方法為：
[0047] (1 )A液的配制：質量比10%的KOH溶液；
[0048] (2)B液的配制:亞甲基藍:水:酒精=1:19.4:12.93(質量比）；
[0049] (3)亞甲基藍染色劑的配制:將A液與B液按體積比（1:1)混合。
[0050] 所述DAPI染液為濃度0.005mg/ml的DAPI水溶液。
[0051]通過以上實驗方案，對昆明市第一污水處理廠的三次不同樣本的處理與染色后， 每個樣本得到3組各15套實驗數(shù)據(jù)圖片，共計135套實驗圖片，并對這些實驗圖進行了數(shù)據(jù) 與統(tǒng)計分析。聚磷菌在各組活性污泥樣品中所占的比例及其平均值和標準偏差(表1-表3)， 表4為T檢驗結果。
[0052]表1:聚磷菌在各組活性污泥樣品中所占的比例及其平均值和標準偏差(2012年12 月14日樣本）
[0055]表2:聚磷菌在各組活性污泥樣品中所占的比例及其平均值和標準偏差（2013年3 月20日樣本）
[0057]表3:聚磷菌在各組活性污泥樣品中所占的比例及其平均值和標準偏差（2013年4 月10日樣本）

[0060]表4統(tǒng)計分析(T檢驗)的P值
[0062] (注:樣本一為2012 ? 12 ? 14樣本，樣本二為2013 ? 3 ? 20樣本，樣本三為2013 ? 4 ? 10樣 本。)
[0063] T檢驗的檢驗標準為P值大于0.05為無顯著差異，小于0.05則為有顯著差異，由表2 可知，樣本一與樣本二之間無顯著差異，樣本一與樣本三之間接近有顯著差異，樣本二與樣 本二之間無顯著差異。
[0064]本發(fā)明提供的方法，能夠簡單快速的從復雜微生物生態(tài)系統(tǒng)(如城市廢水處理廠） 混合微生物群落中示蹤和定量聚磷菌，由于此前都是用一些復雜的分子生物學的方法來示 蹤和定量聚磷菌，包括采用以聚磷菌16S rRNA為祀標的基因探針通過定量焚光原位雜交 (qFISH)和通過qPCR定量聚磷菌的豐度和活性。但qFISH和qPCR檢測的方法操作復雜，操作 人員需要一定的專業(yè)技能培訓，而且檢測時間過長(7-8小時），實驗過程所需材料及設備也 比較昂貴，不適用于簡單快捷的檢測方法。此發(fā)明專利的方法和以前的分子生物學方法比 較，特點是可以對新鮮的活性污泥樣品直接標定和監(jiān)控聚磷菌群，較大地縮短和降低了勞 動強度，成本較低，操作過程簡便，操作人員不需要特殊的培訓，對檢測的地點無特殊的要 求，實驗結果準確無誤，能迅速提供給廢水處理廠工程技術人員相關的數(shù)據(jù)（聚磷菌的豐 度），保證城市污水處理系統(tǒng)正常運轉，也可作為一種監(jiān)控強化生物除磷過程的效率的常規(guī) 檢測方法，確保污水的有效處理和達標排放。
[0065]以上僅是本發(fā)明的具體應用范例，對本發(fā)明的保護范圍不構成任何限制。凡采用 等同變換或者等效替換而形成的技術方案，均落在本發(fā)明權利保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種污水處理廠聚磷菌的快速定量方法，其特征在于:包括以下步驟： 污水處理廠活性污泥樣品采集和保藏:在曝氣裝置后的曝氣區(qū)進行采樣，樣品存入廣 口玻璃瓶中，并在1小時內轉運到實驗室，樣品在實驗室存放于離心管中，置于4°c冰箱中保 存，染色實驗在二天內完成； 制作無菌明膠涂片:無菌狀態(tài)下，取7個載玻片架，將載玻片填滿于載玻片架中；在3.5 L蒸餾水中加入4-5滴廣州立白企業(yè)集團有限公司生產的1升裝的立白洗滌精，放入載玻片 架，煮沸10 min;取出載玻片架，晾3 min;用蒸餾水將洗滌劑沖洗干凈，將載玻片保持直立 狀態(tài)晾干;在3.5L蒸餾水中加入2.5g的十二水硫酸鉀鉻和0.44g的明膠，加熱至70°C，待明 膠基本溶解后放入載玻片架，恒溫10 min;取出載玻片架，將載玻片斜立于試管架邊上干燥 即得； 制作樣品涂片:無菌狀態(tài)下，將裝有樣品的離心管在勻質器上搖勻，由于樣品中有的顆 粒體積較大，移液槍槍頭在使用前將前端剪去2-3毫米，用移液槍取20ul混合活性污泥樣 品，該混合活性污泥樣品按干重計量為8-10 g/L的混合液體，置于載玻片中央，蓋上另外一 片同樣處理的載玻片，用手拉住兩片載玻片的末端朝相反的方向來回拉動10-20次，將載玻 片立靠在試管架邊緣，使其風干； 亞甲基藍染色：取10-15 ml亞甲基藍染色液滴于風干的樣品載玻片上，染色15 s后將 染色液倒去，并用70%的酒精沖洗30 s，置于陰涼處風干； DAPI染色：取100-200 ul染色劑DAPI覆蓋于風干的載玻片上均勻涂開，并置于黑暗的 無菌操作箱中染色10-20 min;將染色劑DAPI倒去，并用蒸餾水小心沖洗2-3遍，每次1 min; 避光并在無菌操作箱中風干； 顯微鏡觀察:將干燥好的載玻片置于熒光顯微鏡物鏡臺上，100X的物鏡下進行觀察和 拍照，每個樣品至少采集30套數(shù)據(jù)圖片，每套數(shù)據(jù)圖片包括一張步驟(4)處理過的亞甲基藍 染色圖片和一張步驟(5)處理過的DAPI染色圖片； 聚磷菌豐度的確定及統(tǒng)計分析:使用圖像分析軟件ImageJ分別分析同一套數(shù)據(jù)圖片中 的亞甲基藍染色陽性聚磷菌細胞數(shù)和DAPI染色陽性的細胞數(shù)，亞甲基藍染色陽性聚磷菌細 胞采用ImageJ中提供的手動計數(shù)法計數(shù)，DAPI染色細胞采用自動計數(shù)法計數(shù)： 聚磷菌的豐度=亞甲基藍染色陽性聚磷菌細胞數(shù)/細胞總數(shù)X 100% t檢驗和方差分析均在excel中完成。2. 根據(jù)權利要求1所述的污水處理廠聚磷菌的快速定量方法，其特征在于：步驟(4)所 述亞甲基藍染色劑的配制方法為： A液的配制：質量比10-20%的KOH溶液； B液的配制:按質量比亞甲基藍:酒精=1:33-50; 亞甲基藍染色劑的配制:將A液與B液按體積比1:0.5-1混合。3. 根據(jù)權利要求1所述的污水處理廠聚磷菌的快速定量方法，其特征在于：步驟(5)所 述DAPI染色液為濃度0.0003-0.005 mg/ml的DAPI水溶液。
【文檔編號】C12R1/01GK105821114SQ201610278664
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】孔云虹, 夏云, 王定康, 黃鶴平
【申請人】孔云虹