一對用于花生根結(jié)線蟲pcr檢測的特異性引物及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了1對用于花生根結(jié)線蟲PCR檢測的特異性引物及其使用方法，所述方法的關(guān)鍵創(chuàng)新點為新的花生根結(jié)線蟲的特異性引物可與已報道的南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲的特異性引物組合建立三重PCR檢測方法，通過一次PCR擴增反應(yīng)即可鑒別上述三種線蟲，克服了以前上述三種線蟲的特異性引物在單條線蟲的水平必須分開使用的難題。本發(fā)明中的方法高效、穩(wěn)定，靈敏度達到單條線蟲的水平，可在我國口岸及農(nóng)林部門檢疫鑒定中推廣應(yīng)用。
【專利說明】
一對用于花生根結(jié)線蟲PCR檢測的特異性引物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及植物線蟲檢疫鑒定領(lǐng)域，提供了 1對用于花生根結(jié)線蟲PCR檢測的特異 性引物及其使用方法，具體而言，所述方法通過組合使用新的花生根結(jié)線蟲特異性引物以 及已報道的南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲的特異性PCR引物，在單條線蟲的水平上建立了 用于鑒別上述3種線蟲的三重PCR檢測方法，克服了以前無法在單條線蟲的水平上將上述三 種線蟲的特異性引物混合使用的難題，顯著提高了檢測效率，適用于口岸及農(nóng)林業(yè)相關(guān)檢 疫鑒定實驗室應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)、花生根結(jié)線蟲(M. arenaria)和爪唾根 結(jié)線蟲(M. javanica)是根結(jié)線蟲屬中分布最廣、寄主最多、危害最重的3種線蟲。由于這3 種線蟲可能是在長期的演化中，通過染色體丟失或融合逐漸分化而來，種間遺傳差異較小， 導(dǎo)致對其鑒別十分困難。
[0003] 傳統(tǒng)方法鑒定以上3種線蟲主要基于形態(tài)和同工酶技術(shù)，但這些方法對技術(shù)人員 專業(yè)素質(zhì)要求高、耗時長，并且受蟲體發(fā)育階段等因素限制較大。以線蟲DNA為基礎(chǔ)的分子 鑒定技術(shù)由于克服了以上方法的不足，逐漸成為根結(jié)線蟲鑒定的重要手段。Xu等（2004)通 過擴增線蟲線粒體⑶II-16S rRNA基因之間的序列，并利用內(nèi)切酶Hinf I對擴增產(chǎn)物進行 酶切，實現(xiàn)了對以上3種根結(jié)線蟲的區(qū)分[4]，但該方法擴增單條線蟲時重復(fù)性較差，而且對 線蟲進行酶切又耗時較長。通過建立特異引物PCR方法對以上3種線蟲進行鑒定有大量報 道。Adam等通過篩查發(fā)現(xiàn)，104/10^ &以1^^?」&￥/幻&￥三對引物用于特異性擴增南方、 花生、爪哇根結(jié)線蟲效果最好，特異性引物Inc-K14-F/R擴增南方根結(jié)線蟲結(jié)果為陰性。而 Kiewnick等的研究表明，F(xiàn)ar/Rar、Fjav/Rjav能夠很好的特異性擴增花生和爪唾根結(jié)線蟲， 與Adam等的研究結(jié)果相同。但MI-F/MI-R用于特異擴增南方根結(jié)線蟲時多個群體結(jié)果為陰 性，反而是Adam等排除的特異性引物Inc-K14-F/R在擴增南方根結(jié)線蟲時效率極高。
[0004] 基于存在的以上問題，本發(fā)明在以前學(xué)者研究的基礎(chǔ)上，對南方、花生、爪哇根結(jié) 線蟲的特異性引物進行重新篩選、驗證和設(shè)計，建立了一種快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的以上3種線蟲 多重PCR檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中在單條線蟲的水平上無法混合使用 已報道的花生根結(jié)線蟲、南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲的特異性引物的難題，提供了一對 新的花生根結(jié)線蟲的特異性引物及其與已報道南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲特異性引物 混合使用的方法，所述新的花生根結(jié)線蟲特異性引物和使用方法如下： 所述新的花生根結(jié)線蟲的特異性引物序列為： 上游引物 Far2:5 Z-TGCTATGCCATCAGGAGATGTG-3 ' 下游引物Rar 2:5 二CTCTTCTCCACTCGCAGGAA-3 ' 所述新的花生根結(jié)線蟲特異性引物可與已報道的南方根結(jié)線蟲特異性引物Inc-K14-F: GGGATGTGTAAATGCTCCTG 和 Inc-K 14-R: CCCGCTACACCCTCAACTTC 以及已報道的爪哇花生根 結(jié)線蟲特異性引物F jav: GGTGCGCGAITGAACTGAGC和 R jav: CAGGCCCTTCAGTGGAACTATAC組合建 立三重PCR檢測方法，該方法包括如下步驟： 步驟一、線蟲DNA的提?。?用雙蒸水將線蟲清洗干凈，挑取單條線蟲放入含8yL ddH20的PCR管中，用小型解剖刀 將線蟲切為2-3段，瞬時離心，反復(fù)凍融2次(液氮處理lmin，65°C水浴2min)后，加入2yL裂解 液(所述裂解液為1 〇 X PCR Buf f er、雙蒸水與20mg/mL蛋白酶K的混合液(體積比10:9:1)， 10 X PCR Buffer與20mg/mL蛋白酶K均購自 TAKARA公司），56°C保溫lh，95°C加熱lOmin，瞬 時離心后上清液可用于后續(xù)的分子檢測。
[0006] 步驟二、多重PCR擴增：PCR反應(yīng)體系（50yL):10X PCR Buffer(Mg2+)5 yL，dNTPs (2.5 mmol/L)2 yL，三種線蟲的上、下游引物（10 ymol/L)分別為0.5 yL(共3yL)，rTaq DNA 聚合酶(5 U/yL)0.4 yL，模板DNA 8 yL，ddH20 31.6 yL。除引物外，所用試劑均購自寶生物 (TAKARA)公司。PCR反應(yīng)條件:95 °C預(yù)變性5 min;40個循環(huán)反應(yīng):95 °C變性30 sec，62.5 。(:退火40 sec，72 °C延伸1.5 min;最后72 °C保溫5 min，使反應(yīng)物充分延伸。
[0007] 步驟三、結(jié)果判定:擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測若出現(xiàn)335 bp特異性條帶，則說明待檢線 蟲為花生根結(jié)線蟲，若出現(xiàn)399 bp特異性條帶，說明待檢線蟲為南方根結(jié)線蟲，若出現(xiàn)670 bp的特異性條帶，說明待檢線蟲為爪哇根結(jié)線蟲，若無擴增產(chǎn)物或出現(xiàn)大小不一致的條帶， 則說明待檢線蟲不是上述3種線蟲的任何一種。
[0008] 所述雙蒸水即為經(jīng)過兩次蒸餾的無菌水，其通常用于分子生物學(xué)實驗。
[0009] 所述裂解液中的10X PCR Buffer和20mg/mL的蛋白酶K均為TAKARA公司生產(chǎn)，商 品編號分別為R001B和9033; 優(yōu)選地，本申請的花生根結(jié)線蟲特異性引物的使用方法中，步驟二中PCR反應(yīng)條件要求 退火溫度為62.5 °C; 本申請的方法適用于鑒別花生根結(jié)線蟲Meloidogyne arenaria、南方根結(jié)線蟲M. incognita和爪唾根結(jié)線蟲M. javanica。
[0010] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的進步在于:新的花生根結(jié)線蟲的特異性引物可與已報 道的南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲的特異性引物組合建立三重PCR檢測方法，通過一次PCR 擴增反應(yīng)鑒別上述三種線蟲，克服了以前上述三種線蟲的特異性引物在單條線蟲的水平必 須分開使用的難題。本發(fā)明中的方法高效、穩(wěn)定，靈敏度達到單條線蟲的水平，可在我國口 岸及農(nóng)林部門檢疫鑒定中推廣應(yīng)用。
【附圖說明】
[0011] 圖1三重PCR檢測方法特異性測試結(jié)果； 圖2三重PCR檢測方法靈敏度測試結(jié)果-南方根結(jié)線蟲； 圖3三重PCR檢測方法靈敏度測試結(jié)果-花生根結(jié)線蟲； 圖4三重PCR檢測方法靈敏度測試結(jié)果-爪哇根結(jié)線蟲； 圖5三重PCR檢測方法重復(fù)性測試結(jié)果； 圖1中各字母含義如下：泳道M:100bp ladder marker;泳道1-5:南方根結(jié)線蟲 M. incognita(MIAUl、MIIT1、MIXC2、MITJ1、MITJ3);泳道6-8 :花生根結(jié)線蟲M. arenaria (MATJ1、MAJS1、MAXC1);泳道9、10:爪哇根結(jié)線蟲M. javanica(MJHNl、MJTJ2);泳道 11-17:北 方根結(jié)線蟲M.hapla、象耳豆根結(jié)線蟲M. enterolobii、西班牙根結(jié)線蟲M.hispanica、蘋果 根結(jié)線蟲M.mali、山茶根結(jié)線蟲M.camelliae、奇氏根結(jié)線蟲M. chitwoodi、虛假根結(jié)線蟲 M.fallax;泳道 18:CK(ddH20) 圖2,圖3,圖4中各字母的含義如下：泳道M:100bp ladder marker;泳道1-3:單條線蟲 DNA未稀釋;泳道4-6:稀釋5 X ;泳道7-9:稀釋10 X ;泳道10-12:稀釋20 X ;泳道13-15:稀釋 50 X ;泳道 16-18:稀釋 100 X ;泳道 19: CK 圖5中各字母的含義如下：泳道M:100bp ladder marker;泳道1-10:南方根結(jié)線蟲 M.incognita(MIAUl、MIJS3、MIIT1、MIHNHK、MIXC1、MIXC2、MIHB1、MITJ1、MITJ2、MITJ3);泳 道 12-21:花生根結(jié)線蟲M. arenaria(MAUSl、MAH01、MAJS1、MAYN1、MATW1、MAXC1、MAXC2、 MATJ1、MATJ2);泳道23-32:爪哇根結(jié)線蟲M. javanica(MJYNl、MJHN1、MJGX1、MJIR1、MJ⑶、 MJBE1、MJTJ1、MJTJ2、MJXC1、MJXC2);泳道 11、22、33: CK
【具體實施方式】
[0012]為能進一步了解本發(fā)明的
【發(fā)明內(nèi)容】
、特點及功效，茲舉以下實施例，并配合附圖詳 細(xì)說明如下： 標(biāo)本來源 供試線蟲包括南方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲等10種線蟲的36個群體，詳 情見下表：
實施例1、三重PCR檢測方法特異性測試 1.單條線蟲DNA提取 用雙蒸水將線蟲清洗干凈，挑取單條線蟲放入含8yL ddH20的PCR管中，用小型解剖刀 將線蟲切為2-3段，瞬時離心，反復(fù)凍融2次(液氮處理lmin，65°C水浴2min)后，加入2yL裂解 液(所述裂解液為1 〇 X PCR Buf f er、雙蒸水與20mg/mL蛋白酶K的混合液(體積比10:9:1)， 10 X PCR Buffer與20mg/mL蛋白酶K均購自 TAKARA公司），56°C保溫lh，95°C加熱lOmin，瞬 時離心后上清液可用于后續(xù)的分子檢測。
[0013] 多重PCR擴增 PCR反應(yīng)體系（50yL):10X PCR Buffer(Mg2+)5 yL，dNTPs(2.5 mmol/L)2 yL，三種線 蟲的上、下游引物（10 ymol/L)分別為0.5 yL(共3yL)，rTaq DNA聚合酶(5 U/yL)0.4 yL，模 板DNA 8 yL，ddH20 31.6 yL。除引物外，所用試劑均購自寶生物(TAKARA)公司。PCR反應(yīng)條 件:95 °C預(yù)變性5 min;40個循環(huán)反應(yīng):95 °C變性30 sec，62.5 °C退火40 sec，72 °C延伸 1.5 min;最后72 °C保溫5 min，使反應(yīng)物充分延伸。
[0014]電泳檢測 每個樣品取3yL擴增產(chǎn)物，使用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，設(shè)置電壓160V，電泳30min后 將凝膠放入EB染液中染色15min，隨后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。
[0015]三重PCR檢測方法特異性測試結(jié)果 本研究利用南方根結(jié)線蟲10個群體、花生根結(jié)線蟲9個群體、爪哇根結(jié)線蟲10個群體和 7種其它根結(jié)線蟲群體對構(gòu)建的多重PCR檢測體系進行特異性測試，每個群體3個重復(fù)。考慮 到群體太多，本研究最終選取5個南方根結(jié)線蟲群體，3個花生根結(jié)線蟲群體和2個爪哇根結(jié) 線蟲群體以及其它7種根結(jié)線蟲群體的各1個群體以展示實驗結(jié)果。結(jié)果表明（圖1)，南方、 花生和爪哇根結(jié)線蟲均在相應(yīng)的泳道內(nèi)特異性擴增獲得目的條帶，而其它7種根結(jié)線蟲均 未出現(xiàn)特異性目的條帶，說明新構(gòu)建的多重PCR檢測體系滿足特異性要求。
[0016]實施例2、三重PCR檢測方法靈敏度測試 1.單條線蟲DNA提取 同實施例1。
[0017] 多重PCR擴增 同實施例1。
[0018]電泳檢測 同實施例1。
[0019] 三重PCR檢測方法靈敏度測試結(jié)果 將3種根結(jié)線蟲的單條線蟲DNA提取物分別以未稀釋、5X、10X、20X、50X、100X稀釋 進行靈敏度測試，每個梯度3個重復(fù)。結(jié)果表明，稀釋至20X時，南方和花生根結(jié)線蟲的目的 條帶依然可以有效擴增（圖2-3)，而爪哇根結(jié)線蟲甚至在稀釋至100X時，目的擴增條帶依 然可見（圖4)。不過，由于花生根結(jié)線蟲在稀釋到5 X時擴增效率顯著降低，因此在實際檢測 過程中不建議對單條線蟲DNA提取物稀釋后使用。
[0020] 實施例3、三重PCR檢測方法重復(fù)性測試 1.單條線蟲DNA提取 同實施例1。
[0021] 多重PCR擴增 同實施例1。
[0022] 電泳檢測 同實施例1。
[0023]三重PCR檢測方法重復(fù)性測試結(jié)果 選取南方、花生和爪哇根結(jié)線蟲共計29個群體，每個群體隨機挑取10條線蟲，即10個重 復(fù)，以測試多重PCR檢測體系的重復(fù)性。由于重復(fù)太多，最終每個群體選取1個重復(fù)以展示實 驗結(jié)果。結(jié)果表明（圖5)，本研究構(gòu)建的多重PCR檢測體系能夠穩(wěn)定的擴增出以上3種根結(jié)線
【主權(quán)項】
1. 一對用于花生根結(jié)線蟲PCR檢測的特異性引物，其特征在于，序列為： 上游引物 Far2:5 二TGCTATGCCATCAGGAGATGTG-3 ' 下游引物Rar 2:5 二CTCTTCTCCACTCGCAGGAA-3 \2. 根據(jù)權(quán)利要求1的特異性引物，其特征在于，該特異性引物可與已報道的南方根結(jié)線 蟲特異性引物 I nc-K 14-F: GGGATGTGTAAATGCTCCTG 和 I nc-K 14-R: CCCGCTACACCCTCAACTTC 以 及已報道的爪哇花生根結(jié)線蟲特異性引物Fjav:GGTGCGCGATTGAACTGAG(^PRjav: CAGGCCCTTCAGTGGAACTATAC組合建立三重PCR檢測方法，該方法包括如下步驟： 步驟一、單條線蟲DNA的提??； 步驟二、多重PCR擴增：PCR反應(yīng)體系（50yL):10X PCR Buffer(Mg2+)5 yL，dNTPs(2.5 mmol/L)2 yL，上、下游引物（10 μ mol/L)分別為0.5 yL(共3yL)，rTaq DNA聚合酶(5 U/yL) 0.4 yL，模板DNA 8 yUddifeO 31.6 yL;除引物外，所用試劑均購自寶生物(TAKARA)公司； PCR反應(yīng)條件:95 °C預(yù)變性5 min;40個循環(huán)反應(yīng):95 °C變性30 sec，62.5 °C退火40 sec， 72 °C延伸1.5 min;最后72 °C保溫5 min，使反應(yīng)物充分延伸； 步驟三、結(jié)果判定:擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測若出現(xiàn)335 bp特異性條帶，則說明待檢線蟲為 花生根結(jié)線蟲，若出現(xiàn)399 bp特異性條帶，說明待檢線蟲為南方根結(jié)線蟲，若出現(xiàn)670 bp的 特異性條帶，說明待檢線蟲為爪哇根結(jié)線蟲，若無擴增產(chǎn)物或出現(xiàn)大小不一致的條帶，則說 明待檢線蟲不是上述3種線蟲的任何一種。3. 根據(jù)權(quán)利要求2的使用方法，其特征在于，步驟二的PCR反應(yīng)條件中，退火溫度為62.5 Γ。4. 根據(jù)權(quán)利要求1的特異性引物和權(quán)利要求2的檢測方法，其特征在于:所述三重PCR檢 測方法系用于通過一步PCR鑒別花生根結(jié)線蟲Meloidogyne arenaria、南方根結(jié)線蟲M. incognita和爪唾根結(jié)線蟲Μ· javanica。
【文檔編號】C12N15/11GK105821118SQ201510934300
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2015年12月14日
【發(fā)明人】王金成, 劉躍庭, 林宇, 馮潔, 顧建鋒, 張裕君, 陳先鋒
【申請人】天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心