鑒定小麥抽穗時(shí)間性狀的方法與分子標(biāo)記的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了鑒定小麥抽穗時(shí)間性狀的方法與分子標(biāo)記。本發(fā)明公開(kāi)的鑒定小麥抽穗時(shí)間性狀的方法包括：分別檢測(cè)待測(cè)小麥A和待測(cè)小麥B中是否含有靶標(biāo)DNA片段，如果所述待測(cè)小麥A含有靶標(biāo)DNA片段，所述待測(cè)小麥B不含有靶標(biāo)DNA片段，所述待測(cè)小麥A的抽穗時(shí)間長(zhǎng)于或候選長(zhǎng)于所述待測(cè)小麥B的抽穗時(shí)間；所述靶標(biāo)DNA片段的序列為下述1)或2)：1)引物對(duì)在小麥基因組上對(duì)應(yīng)的靶序列；所述引物對(duì)由序列1的第1?18位所示的單鏈DNA和與序列1的第686?709位反向互補(bǔ)的單鏈DNA組成；2)1)的任一片段。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的分子標(biāo)記與小麥抽穗時(shí)間相關(guān)，可用來(lái)鑒定或輔助鑒定小麥的抽穗時(shí)間，也可用于小麥育種中。
【專利說(shuō)明】
鑒定小麥抽穗時(shí)間性狀的方法與分子標(biāo)記
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中鑒定小麥抽穗時(shí)間性狀的方法與分子標(biāo)記。
【背景技術(shù)】
[0002] 抽穗是禾本科作物生長(zhǎng)過(guò)程中的一個(gè)重要時(shí)期，適期抽穗對(duì)于作物的適應(yīng)性、高 產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)具有至關(guān)重要的作用。
[0003] 小麥抽穗期受環(huán)境等因素等的影響，同一品種在不同年份，不同生長(zhǎng)地點(diǎn)所表現(xiàn) 出的表型值可能會(huì)有較大的差異。分子標(biāo)記輔助選擇(marker assisted selection MAS) 是基于基因型的選擇，不受外界環(huán)境因素的影響，被越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于育種實(shí)踐中。常用 的分子標(biāo)記類型有RFLP、AFLP、SSR等，但這些標(biāo)記類型不能與目標(biāo)基因共分離。功能標(biāo)記 (Functional marker)是一類基于基因特征序列開(kāi)發(fā)的標(biāo)記，與目標(biāo)基因共分離，大大提高 了選擇的準(zhǔn)確性，在MAS中有著廣泛應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何鑒定小麥的抽穗時(shí)間。
[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了一種鑒定小麥抽穗時(shí)間性狀的方法，所 述方法包括:分別檢測(cè)待測(cè)小麥A和待測(cè)小麥B中是否含有靶標(biāo)DNA片段，如果所述待測(cè)小麥 A含有靶標(biāo)DNA片段，所述待測(cè)小麥B不含有靶標(biāo)DNA片段，所述待測(cè)小麥A的抽穗時(shí)間長(zhǎng)于或 候選長(zhǎng)于所述待測(cè)小麥B的抽穗時(shí)間；
[0006] 所述靶標(biāo)DNA片段的序列為下述1)或2):
[0007] 1)引物對(duì)在小麥基因組上對(duì)應(yīng)的靶序列；所述引物對(duì)由序列1的第1-18位所示的 單鏈DNA和與序列1的第686-709位反向互補(bǔ)的單鏈DNA組成；
[0008] 2)1)的任一片段。
[0009] 上述方法中，所述待測(cè)小麥A和所述待測(cè)小麥B均可為冬小麥。
[0010] 上述方法中，所述檢測(cè)待測(cè)小麥A和待測(cè)小麥B中是否含有靶標(biāo)DNA片段具體可包 括M或N:
[0011] M、下述 Ml)和 M2):
[0012] Ml)分別以待測(cè)小麥A和待測(cè)小麥B的基因組DNA為模板，用所述引物對(duì)分別進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到所述待測(cè)小麥A PCR產(chǎn)物和所述待測(cè)小麥B PCR產(chǎn)物；
[0013] M2)將步驟Ml)中所述待測(cè)小麥A PCR產(chǎn)物和所述待測(cè)小麥B PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，根 據(jù)序列確定所述待測(cè)小麥A和所述所述待測(cè)小麥B是否含有所述靶標(biāo)DNA片段；
[0014] N、下述 N1)和 N2):
[0015] N1)分別以待測(cè)小麥A和待測(cè)小麥B的基因組DNA為模板，用所述引物對(duì)分別進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到所述待測(cè)小麥A PCR產(chǎn)物和所述待測(cè)小麥B PCR產(chǎn)物；
[0016] N2)檢測(cè)步驟N1)中所述待測(cè)小麥A PCR產(chǎn)物和所述待測(cè)小麥B PCR產(chǎn)物的大小，確 定所述待測(cè)小麥A和所述所述待測(cè)小麥B是否含有所述靶標(biāo)DNA片段。
[0017]上述方法中，檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小具體可通過(guò)電泳或測(cè)序進(jìn)行。在通過(guò)電泳進(jìn)行檢 測(cè)時(shí)，所述709bp的DNA片段具體可表現(xiàn)為在500-750bp間有一條帶。
[0018] 上述方法中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的體系中可含有DNA聚合酶、dNTPs、進(jìn)行PCR擴(kuò)增所 需的緩沖液和所述引物對(duì)。所述DNA聚合酶具體可為ExTaq酶(如Takara的ExTaq酶）。所述 dNTPs具體可為Takara產(chǎn)品。所述進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的緩沖液具體可為Takara產(chǎn)品，如GC buffer I。所述進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的儀器具體可為PCR儀。
[0019] 每25yl的進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的體系具體可由以下物質(zhì)組成:基因組DNA(約100ng)， ExTaq酶（Takara，code:DRR100B)0.3lil，GC buffer I 10lil(Takara，code:DRR20GC I)， dNTPs(Takara，code:D4030RA，2.5mM each)4yl，上游引物和下游引物各lyl (引物濃度為 10 yM)，用無(wú)菌超純水補(bǔ)充反應(yīng)體系至25yl。
[0020]上述方法中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的退火溫度可為62°C。進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的條件具 體可為 94￡€51^11;941€4〇8、621€4〇8、72°(：1111111，共35個(gè)循環(huán) ；721€7111111。
[0021 ]上述方法中，所述待測(cè)小麥A和所述待測(cè)小麥B均可為冬小麥。
[0022] 實(shí)際應(yīng)用中，可能會(huì)因?yàn)閭€(gè)體差異導(dǎo)致不同的小麥個(gè)體中的靶標(biāo)DNA片段上的個(gè) 別堿基的不同，但是都屬于本發(fā)明所述的"祀標(biāo)DNA片段"的范圍內(nèi)。
[0023] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種鑒定或輔助鑒定小麥抽穗時(shí)間性狀的 物質(zhì)，所述物質(zhì)為檢測(cè)小麥中是否含有靶標(biāo)DNA片段的物質(zhì)；
[0024]所述靶標(biāo)DNA片段的序列為所述1)或所述2)。
[0025] 實(shí)際應(yīng)用中，可能會(huì)因?yàn)閭€(gè)體差異導(dǎo)致不同的小麥個(gè)體中的靶標(biāo)DNA片段上的個(gè) 別堿基的不同，但是都屬于本發(fā)明所述的"祀標(biāo)DNA片段"的范圍內(nèi)。
[0026] 可以采用現(xiàn)有技術(shù)中的任何能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)DNA片段檢測(cè)的方法來(lái)檢測(cè)本發(fā)明所述 靶標(biāo)DNA片段，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、Southern印跡技術(shù)、PCR等等，只要是用于檢測(cè)本發(fā) 明所述靶標(biāo)DNA片段的物質(zhì)都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0027]上述物質(zhì)可為利用PCR擴(kuò)增檢測(cè)小麥中是否含有靶標(biāo)DNA片段的物質(zhì)。
[0028] 上述物質(zhì)還可為由序列1的第1-18位所示的單鏈DNA和與序列1的第686-709位反 向互補(bǔ)的單鏈DNA組成的引物對(duì)。
[0029] 上述引物對(duì)中兩條單鏈DNA的摩爾比可為1:1。所述引物對(duì)中兩條單鏈DNA可獨(dú)立 包裝，也可包裝在一起。
[0030] 上述物質(zhì)還可由XI和X2組成;所述XI為所述引物對(duì)，所述X2為進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的 試劑和/或儀器。
[0031] 上述物質(zhì)中，所述進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的試劑可為DNA聚合酶、dNTPs和進(jìn)行PCR擴(kuò)增 所需的緩沖液。所述DNA聚合酶具體可為ExTaq酶(如Takara的ExTaq酶）。所述dNTPs具體可 為Takara產(chǎn)品。所述進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的緩沖液具體可為Takara產(chǎn)品，如GC buffer I。所述 進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的儀器具體可為PCR儀。
[0032]上述物質(zhì)中，所述DNA聚合酶、所述dNTPs、所述進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的緩沖液和所述 引物對(duì)均可獨(dú)立包裝，也可包裝在一起。
[0033] 上述物質(zhì)也可為僅含有所述引物對(duì)和所述進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的試劑的試劑或試劑 盒。
[0034] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定小麥抽穗時(shí)間性狀的分子 標(biāo)記，所述分子標(biāo)記為所述靶標(biāo)DNA片段，名稱為TaHM。
[0035] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了下述I-IV中的任一種應(yīng)用：
[0036] I、所述鑒定小麥抽穗時(shí)間性狀的方法在小麥育種中的應(yīng)用。
[0037] II、所述物質(zhì)在下述Z1-Z3中任一種中的應(yīng)用：
[0038] Z1、在制備鑒定或輔助鑒定小麥抽穗時(shí)間性狀產(chǎn)品中的應(yīng)用；
[0039] Z2、在鑒定或輔助鑒定小麥抽穗時(shí)間性狀中的應(yīng)用；
[0040] Z3、在小麥育種中的應(yīng)用；
[0041 ] HI、所述分子標(biāo)記在所述Z1-Z3中任一種中的應(yīng)用。
[0042]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了小麥育種方法，所述方法包括:檢測(cè)小麥?zhǔn)?否含有所述靶標(biāo)DNA片段，選擇不含所述靶標(biāo)DNA片段的小麥為親本進(jìn)行育種。
[0043]本發(fā)明中，所述小麥可為冬小麥。
[0044] 本發(fā)明中，所述抽穗時(shí)間具體可為從當(dāng)年1月1日至抽穗時(shí)的天數(shù)?？蓪?0 %的穗 數(shù)抽出旗葉定為抽穗。
[0045] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與小麥抽穗時(shí)間相關(guān)的分子標(biāo)記，含有TaHM的冬小麥的抽穗時(shí) 間長(zhǎng)于不含TaHM的冬小麥的抽穗時(shí)間：在70份冬小麥中，含有TaHM的55個(gè)品種的抽穗時(shí)間 平均為112.2天;不含TaHM的15個(gè)品種的抽穗時(shí)間平均為110.9天;含有TaHM的55個(gè)品種的 抽穗時(shí)間長(zhǎng)于不含TaHM的15個(gè)品種的抽穗時(shí)間，兩者具有顯著差異(P〈0.01);在170個(gè)藁城 8901/周麥16近等基因系中，101個(gè)含有TaHM的近等基因系的平均抽穗時(shí)間為109.7天，69個(gè) 不含TaHM近等基因系的平均抽穗時(shí)間為108.2天，含有TaHM的近等基因系的平均抽穗時(shí)間 長(zhǎng)于不含TaHM近等基因系的平均抽穗時(shí)間，兩者具有顯著差異(P〈0.01)。表明，TaHM是一個(gè) 與小麥抽穗時(shí)間相關(guān)的分子標(biāo)記，可用來(lái)鑒定或輔助鑒定小麥的抽穗時(shí)間，也可用于小麥 育種中，對(duì)利用分子標(biāo)記輔助選擇生育期適宜的小麥品種具有重要的理論意義和經(jīng)濟(jì)價(jià) 值。將本發(fā)明中的TaHM運(yùn)用于分子標(biāo)記輔助選擇，能對(duì)小麥抽穗期進(jìn)行有效選擇，提高小麥 適應(yīng)性和穩(wěn)產(chǎn)性，更好地適應(yīng)不斷加劇的環(huán)境變化，加速小麥新品種的選育。
【附圖說(shuō)明】
[0046]圖1為70份冬小麥部分冬小麥的電泳結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶大 小從上到下依次為 2000、1000、750、500、250、100bp。
【具體實(shí)施方式】
[0047] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0048] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0049] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0050] 實(shí)施例1、小麥分子標(biāo)記可以用來(lái)鑒定鑒定冬小麥抽穗時(shí)間長(zhǎng)短
[0051]本發(fā)明提供了一種小麥分子標(biāo)記，其名稱為TaHM，TaHM為序列1所示的長(zhǎng)度為 709bp的DNA分子，TaHM為與小麥抽穗時(shí)間長(zhǎng)短相關(guān)的分子標(biāo)記。TaHM只存在于部分冬小麥 品種中，含有TaHM的冬小麥的抽穗時(shí)間長(zhǎng)于不含TaHM的冬小麥的抽穗時(shí)間。
[0052]分別檢測(cè)表1中的70份冬小麥?zhǔn)欠窈蠺aHM，并對(duì)TaHM與冬小麥的抽穗時(shí)間的相 關(guān)性進(jìn)行分析：
[0053] l、TaHM 的檢測(cè)
[0054]提取各冬小麥的基因組DNA，以基因組DNA為模板，用由序列1的第1-18位所示的單 鏈DNA和與序列1的第686-709位反向互補(bǔ)的單鏈DNA組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物。
[0055] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系：基因組DNA(約 1 OOng)，ExTaq酶（Takara，code: DRR100B) 0 ? 3y 1,GC buffer I lOyl(Takara,code：DRR20GC I),dNTPs(Takara,code：D4030RA,2.5mM each)4yl，上游引物和下游引物各lyl (引物濃度為10yM)，用無(wú)菌超純水補(bǔ)充反應(yīng)體系至25 yl〇
[0056] PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)程序：94￡€51^11;941€4〇8、62 1€4〇8、72°(：1111111，共35個(gè)循環(huán)；721€ 7min〇
[0057] 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。部分冬小麥的電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。
[0058] 結(jié)果顯示，這70份冬小麥中，有55個(gè)冬小麥在500-750bp間有一條帶（圖1中泳道 05-08為這55個(gè)冬小麥中的四個(gè)），而在另外15個(gè)冬小麥中無(wú)該條帶（圖1中泳道01-04為這 15個(gè)冬小麥中的四個(gè)），將該55個(gè)冬小麥的該條帶回收，并進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示55個(gè)冬小麥 的該條帶的序列均為序列表中序列1(即TaHM)，表明，在這70份冬小麥中，有55個(gè)冬小麥含 有TaHM，另外15個(gè)品種不含TaHM。
[0059] 2、抽穗時(shí)間的統(tǒng)計(jì)
[0060]將50%的穗數(shù)抽出旗葉定為抽穗，抽穗時(shí)間是從播種地黃淮麥區(qū)的當(dāng)年1月1日至 抽穗時(shí)的天數(shù)。各冬小麥的抽穗時(shí)間如表1所不。
[0061 ] 這70份冬小麥中，含有TaHM的55個(gè)品種的抽穗時(shí)間平均為112.2天;不含TaHM的15 個(gè)品種的抽穗時(shí)間平均為110.9天;含有TaHM的55個(gè)品種的抽穗時(shí)間長(zhǎng)于不含TaHM的15個(gè) 品種的抽穗時(shí)間，兩者具有顯著差異(P〈〇.01)。
[0062]表1、各個(gè)小麥品種的PCR檢測(cè)結(jié)果和抽穗時(shí)間調(diào)查結(jié)果


[0066] 注:一表示不含有TaHM，+表示含有TaHM。
[0067]實(shí)施例2、TaHM與冬小麥抽穗時(shí)間相關(guān)性的進(jìn)一步驗(yàn)證
[0068]選取170個(gè)藁城8901/周麥16近等基因系，按照實(shí)施例1中步驟1的TaHM的檢測(cè)方法 檢測(cè)各近等基因系中是否含有TaHM，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，170個(gè)近等基因系中101個(gè)含有TaHM，69個(gè)不 含TaHM。按照實(shí)施例1步驟2的方法分別統(tǒng)計(jì)各近等基因系的抽穗時(shí)間，結(jié)果如表2所示。 [0069] 結(jié)果顯示，101個(gè)含有TaHM的近等基因系的平均抽穗時(shí)間為109.7天，69個(gè)不含 TaHM近等基因系的平均抽穗時(shí)間為108.2天，含有TaHM的近等基因系的平均抽穗時(shí)間長(zhǎng)于 不含TaHM近等基因系的平均抽穗時(shí)間，兩者具有顯著差異(P〈0.01)。
[0070]表2、170個(gè)藁城8901/周麥16近等基因系的TaHM含有情況與抽穗時(shí)間




【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鑒定小麥抽穗時(shí)間性狀的方法，包括:分別檢測(cè)待測(cè)小麥A和待測(cè)小麥B中是否 含有靶標(biāo)DNA片段，如果所述待測(cè)小麥A含有靶標(biāo)DNA片段，所述待測(cè)小麥B不含有靶標(biāo)DNA片 段，所述待測(cè)小麥A的抽穗時(shí)間長(zhǎng)于或候選長(zhǎng)于所述待測(cè)小麥B的抽穗時(shí)間； 所述靶標(biāo)DNA片段的序列為下述1)或2): 1) 引物對(duì)在小麥基因組上對(duì)應(yīng)的靶序列；所述引物對(duì)由序列1的第1-18位所示的單鏈 DNA和與序列1的第686-709位反向互補(bǔ)的單鏈DNA組成； 2) 1)的任一片段。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：所述待測(cè)小麥A和所述待測(cè)小麥B均為冬小 麥。3. -種鑒定或輔助鑒定小麥抽穗時(shí)間性狀的物質(zhì)，為檢測(cè)小麥中是否含有靶標(biāo)DNA片 段的物質(zhì)； 所述靶標(biāo)DNA片段的序列為權(quán)利要求1中所述1)或所述2)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述物質(zhì)，其特征在于:所述物質(zhì)為利用PCR擴(kuò)增檢測(cè)小麥中是否含 有靶標(biāo)DNA片段的物質(zhì)。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述物質(zhì)，其特征在于:所述物質(zhì)為由序列1的第1-18位所示的單 鏈DNA和與序列1的第686-709位反向互補(bǔ)的單鏈DNA組成的引物對(duì)。6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述物質(zhì)，其特征在于:所述物質(zhì)由XI和X2組成;所述XI為權(quán)利要 求5所述引物對(duì)，所述X2為進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的試劑和/或儀器。7. 鑒定或輔助鑒定小麥抽穗時(shí)間性狀的分子標(biāo)記，為權(quán)利要求1中所述靶標(biāo)DNA片段。8. 下述ι-m中的任一種應(yīng)用： l、 權(quán)利要求1或2所述方法在小麥育種中的應(yīng)用； Π 、權(quán)利要求3-6中任一所述物質(zhì)在下述Z1-Z3中任一種中的應(yīng)用： Z1、在制備鑒定或輔助鑒定小麥抽穗時(shí)間性狀產(chǎn)品中的應(yīng)用； Z2、在鑒定或輔助鑒定小麥抽穗時(shí)間性狀中的應(yīng)用； Z3、在小麥育種中的應(yīng)用； m、 權(quán)利要求7所述分子標(biāo)記在所述Z1-Z3中任一種中的應(yīng)用。9. 小麥育種方法，包括:檢測(cè)小麥?zhǔn)欠窈袡?quán)利要求1中所述靶標(biāo)DNA片段，選擇不含權(quán) 利要求1中所述靶標(biāo)DNA片段的小麥為親本進(jìn)行育種。10. 根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一所述物質(zhì)、權(quán)利要求7所述分子標(biāo)記、權(quán)利要求8所述應(yīng)用 或權(quán)利要求9所述方法，其特征在于:所述小麥為冬小麥。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105821122SQ201610204921
【公開(kāi)日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年4月5日
【發(fā)明人】何中虎, 王金平, 曹雙河
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所